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CRISPR遺伝子編集（/ ˈkrɪspər /、発音は「クリスパー」、略称は「clustered regularly interspaced short palindromic repeats」）は、分子生物学における遺伝子工学技術であり、生物のゲノムを改変することができる。これは、細菌のCRISPR - Cas9抗ウイルス防御システムの簡略版に基づいている。合成ガイドRNA （gRNA）と複合体を形成したCas9ヌクレアーゼを細胞内に導入することで、細胞のゲノムを目的の場所で切断することができ、生体内（「生体内」）で既存の遺伝子を除去したり、新しい遺伝子を追加したりすることができる。 [ 1 ]
この技術は、生体内でのゲノム編集を可能にし、非常に精密で費用対効果が高く効率的であると考えられているため、バイオテクノロジーと医学において非常に重要視されています。新しい医薬品、農産物、遺伝子組み換え生物の作成、または病原体や害虫の制御手段として使用できます。また、遺伝性疾患や、癌などの体細胞突然変異に起因する疾患の治療にも可能性を秘めています。ただし、ヒト生殖細胞系列の遺伝子改変への使用は非常に議論の的となっています。この技術の開発により、ジェニファー・ダウドナとエマニュエル・シャルパンティエは2020年にノーベル化学賞を受賞しました。 [ 2 ] [ 3 ]同じ発見でカブリ賞を共同受賞した3番目の研究グループ[ 4 ]は、ヴィルジニウス・シクシュニスが率いていましたが、ノーベル賞は受賞しませんでした。[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]
遺伝子ハサミのように働くCas9ヌクレアーゼは、標的DNA配列の両方の鎖を開き、2つの方法のいずれかで改変を導入します。相同組換え修復（HDR）によって促進されるノックイン変異は、標的ゲノム編集アプローチの従来の方法でした。[ 1 ]これにより、標的DNA損傷と修復を導入できます。HDRは、類似のDNA配列を使用して、修復テンプレートとして機能する外来DNAの組み込みを介して切断の修復を促進します。[ 1 ]この方法は、修復を開始するために、標的部位でのDNA損傷の周期的かつ孤立した発生に依存しています。CRISPR-Cas9によって引き起こされるノックアウト変異は、非相同末端結合（NHEJ）またはPOLQ/ポリメラーゼθ媒介末端結合（TMEJ）による二本鎖切断の修復によって生じます。これらの末端結合経路は、修復部位でランダムな欠失や挿入を引き起こすことが多く、遺伝子の機能を阻害または変化させる可能性がある。そのため、CRISPR-Cas9を用いたゲノム編集技術によって、研究者は標的を絞ったランダムな遺伝子破壊を実現できる。
1980年代以降、さまざまな方法を用いて真核細胞におけるゲノム編集は可能であったが、採用された方法は非効率的で、大規模な実施には不向きであることが判明した。CRISPR、特にCas9ヌクレアーゼ分子の発見により、効率的かつ高度に選択的な編集が可能になった。細菌種Streptococcus pyogenes由来のCas9は、 crRNAおよびtracrRNAガイド鎖によって指定された特定の場所に標的切断を作成する信頼性の高い方法を可能にすることで、真核細胞における標的ゲノム改変を促進した。[ 8 ]研究者は、Cas9とテンプレートRNAを容易に挿入して、特定の遺伝子座でサイレンシングまたは点突然変異を引き起こすことができる。これは、さまざまな真核生物のさまざまな遺伝子に関連するゲノムモデルと生物学的プロセスの迅速かつ効率的なマッピングに非常に貴重であることが証明されている。オフターゲット活性を大幅に低減するCas9ヌクレアーゼの新規設計変異体が開発されている。[ 9 ]
CRISPR-Cas9ゲノム編集技術には多くの潜在的な応用例がある。ゲノム編集のためのCRISPR-Cas9-gRNA複合体の使用[ 10 ]は、 2015年にAAASのブレークスルー・オブ・ザ・イヤーに選ばれた[ 11 ]。 2015年以降、CRISPRは生存不可能なヒト胚で実験的に研究されてきた[ 12 ]。 2019年には、物議を醸した賀建奎事件の結果として、CRISPR技術を使用してゲノム編集された胚から最初のヒトが生まれた[ 13 ]。生殖細胞系列編集にCRISPRを使用する見込み、特にヒト優生学を可能にする可能性について、いくつかの生命倫理上の懸念が提起されている。[ 14 ] 2023年、CRISPR遺伝子編集を利用した最初の薬剤であるExagamglogene autotemcel（商品名「Casgevy」）が、鎌状赤血球症とβサラセミアの治療薬として英国で正式に承認された。[ 15 ] [ 16 ] 2023年12月2日、バーレーン王国は、鎌状赤血球貧血とβサラセミアの治療薬としてCasgevyの使用を承認した世界で2番目の国となった。[ 17 ] [ 18 ] 2023年12月8日、Casgevyは米国食品医薬品局から米国での使用承認を受けた。[ 19 ]
2000年代初頭、ドイツの研究者たちは、 DNA結合ドメインによって特定の箇所でDNAの二本鎖切断を起こせる合成タンパク質であるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）の開発に着手した。ZFNはCas9よりも精度が高く、サイズも小さいという利点があるが、CRISPRベースの方法ほど広くは使われていない。2010年には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）と呼ばれる合成ヌクレアーゼが登場し、DNA鎖上の特定の場所に二本鎖切断を標的とするより簡単な方法が提供されるようになった。ジンクフィンガーヌクレアーゼとTALENはいずれも、標的とするDNA配列ごとにカスタムタンパク質を設計・作成する必要があり、これはガイドRNAを設計するよりもはるかに難しく、時間のかかるプロセスである。CRISPRは、短いRNA配列を合成するだけで済むため、設計がはるかに容易である。この手順は、他の多くの分子生物学技術（例えば、オリゴヌクレオチドプライマーの作成）ですでに広く使われている。[ 20 ]
RNA干渉（RNAi）などの方法では遺伝子機能を完全に抑制することはできませんが、CRISPR、ZFN、TALENは完全かつ不可逆的な遺伝子ノックアウトを実現します。[ 21 ] CRISPRは、異なるgRNAを導入するだけで複数のDNA部位を同時に標的にすることもできます。さらに、CRISPRを使用するコストは比較的低くなっています。[ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]
2005年、フランス国立農業研究所（INRA）のアレクサンダー・ボロティンは、新規のCas遺伝子を含むCRISPR遺伝子座を発見した。特に重要なのは、Cas9として知られる大きなタンパク質をコードする遺伝子である。[ 24 ]
2006年、米国国立生物工学情報センター（NCBI）のユージン・クーニンは、CRISPRが細菌の免疫システムとしてどのように連鎖的に機能するかについての説明を提案した。[ 24 ]
2007年、ダニスコ・フランスSASのフィリップ・ホルヴァートは、CRISPRシステムが適応免疫システムであり、新しいファージDNAをCRISPRアレイに組み込むことで、次の攻撃ファージの波を撃退する方法を実験的に示しました。[ 24 ]
2012年、ジェニファー・ダウドナ教授（カリフォルニア大学バークレー校）とエマニュエル・シャルパンティエ教授（ウメオ大学）が率いる研究チームは、DNA編集に必要なCRISPR-Cas9システムを特定、開示し、特許出願を行った最初のグループとなった。[ 24 ]また、CRISPR- Cas9をRNAでプログラムしてゲノムDNAを編集できるという発見も発表しており、これは現在、生物学の歴史上最も重要な発見の1つと考えられている。
2013年11月現在 SAGE Labs（ Horizon Discoveryグループの一部）は、それらの企業の1社から遺伝子組み換えラットの製造および販売に関する独占的権利と、マウスおよびウサギモデルに関する非独占的権利を取得していた。[ 25 ] 2015年までにThermo Fisher ScientificはToolGenからCRISPR試薬キットを開発するための知的財産権のライセンスを取得していた。[ 26 ]
2014年12月現在 2014年、MITとハーバード大学のブロード研究所のFeng Zhang氏と他の9名が、真核生物におけるCRISPR-Cas9遺伝子編集の使用に関する米国特許第8,697,359号を取得しました。[ 29 ] CRISPRの着想はCharpentierとDoudna（CVCと呼ばれる）によるものですが、特許裁判官のSally Gardner Lane、James T. Moore、Deborah Katzによると、最初に「実用化」を達成したのはブロード研究所でした。[ 30 ]
最初の特許は2015年にブロードチームに付与され、CVCグループの弁護士が最初の特許抵触訴訟を申し立てるきっかけとなった。[ 31 ] 2017年2月、米国特許庁は、ブロード研究所に付与された特許に関してカリフォルニア大学が提起した特許抵触訴訟について裁定を下し、真核細胞におけるCRISPR-Cas9の応用を対象とするクレームを含むブロードの特許は、カリフォルニア大学が主張する発明とは異なると判断した。[ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]
その後まもなく、カリフォルニア大学はこの判決に対して控訴した。[ 35 ] [ 36 ] 2019年に、2回目の特許抵触訴訟が提起された。これは、CVCが行った特許出願に対応して、審判部が技術の元の発明者を決定する必要があったためである。USPTOは2022年3月にUCに不利な判決を下し、ブロード研究所が最初に出願したと述べた。この決定は、UCバークレーからライセンス供与されたCRISPR編集技術の多くのライセンス契約に影響を与えた。UCはUSPTOの判決に対して控訴する意向を表明した。[ 37 ]
2017年3月、欧州特許庁（EPO）は、ベルリンのマックス・プランク研究所、カリフォルニア大学、ウィーン大学に対し、あらゆる種類の細胞編集に関するクレームを認める意向を発表した[ 38 ] [ 39 ]。また、2017年8月には、ミリポアシグマが提出した特許出願において、CRISPRに関するクレームを認める意向を発表した[ 38 ] 。 2017年8月現在、 ヨーロッパの特許状況は複雑で、カリフォルニア大学やブロード研究所に加え、ミリポアシグマ、ツールジェン、ヴィリニュス大学、ハーバード大学が特許権を争っていた。[ 40 ]
2018年7月、欧州司法裁判所は、植物の遺伝子編集は遺伝子組み換え食品のサブカテゴリーであり、したがってCRISPR技術は今後、欧州連合の遺伝子組み換えに関する規則および規制によって規制される、との判決を下した。[ 41 ]
2020年2月、米国で行われた臨床試験で、3人の癌患者に対するCRISPR遺伝子編集の安全性が示された。[ 42 ]
2020年10月、研究者のエマニュエル・シャルパンティエとジェニファー・ダウドナは、この分野での研究に対してノーベル化学賞を受賞しました。[ 43 ] [ 44 ]彼女たちは、男性の貢献者なしでこの賞を共同受賞した最初の2人の女性として歴史に名を刻みました。[ 45 ] [ 5 ]
2021年6月、ヒトを対象とした静脈内CRISPR遺伝子編集の最初の小規模臨床試験が有望な結果で終了した。[ 46 ] [ 47 ]
2021年9月、日本で初めてCRISPR編集食品が一般販売された。トマトは、鎮静作用がある可能性のあるGABAの量が通常の約5倍になるように遺伝子操作された[ 48 ] 。[ 49 ] CRISPRは2014年に初めてトマトに適用された。[ 50 ]
2021年12月、日本で初のCRISPR遺伝子編集海洋動物/シーフードと2番目のCRISPR編集食品が一般販売されたと報じられた。そのうちの1種は食欲を制御するレプチンを阻害することで自然個体の2倍の大きさに成長し、もう1種は筋肉の成長を阻害するミオスタチンを無効化することで同じ量の餌で自然の平均サイズの1.2倍に成長する2種類の魚である。[ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]
2022年の研究では、CRISPRトマトについてより詳しく知ることが参加者の好みに大きな影響を与えたことが明らかになった。「科学者であるドイツの参加者32人のほぼ半数は一貫した選択を示したが、大多数（主に非科学者）はCRISPRトマトを購入する意欲が高まった。」[ 54 ] [ 55 ]
2021年5月、カリフォルニア大学バークレー校は、CRISPR遺伝子編集と癌免疫療法の特許の両方の非代替性トークンをオークションにかける意向を発表した。ただし、この場合、大学は特許の所有権を保持する。[ 56 ] [ 57 ]「第四の柱」と名付けられたコレクションの販売を通じて集められた資金の85%は、研究資金として使用される予定だった。[ 58 ] [ 59 ]これは2022年6月に22イーサで売却され、当時のレートで約54,000米ドルだった。 [ 60 ]
2023年11月、英国医薬品・医療製品規制庁（MHRA）は、鎌状赤血球貧血とβサラセミアの治療薬として、CRISPR遺伝子編集に基づく初の薬剤であるCasgevyの使用を世界で初めて承認しました。Casgevy、またはexagamglogene autotemcelは、患者の骨の中にある幹細胞の遺伝子に直接作用し、健康な赤血球を産生させます。この治療法により、定期的な高額な輸血の必要性がなくなります。[ 15 ] [ 16 ]
2023年12月2日、バーレーン王国の国家保健規制当局（NHRA）は、鎌状赤血球貧血とβサラセミアの治療にカスゲビーを使用することを承認した世界で2番目の機関となった。[ 17 ] [ 18 ]
2023年12月、FDAは鎌状赤血球症（SCD）患者を治療するための米国初の遺伝子治療を承認した。FDAは、SCD治療のための初の細胞ベースの遺伝子治療であるCasgevyとLyfgeniaという2つの画期的な治療法を承認した。[ 61 ]
2025年2月16日、バーレーン王国は、キング・ハマド大学病院（KHUH）にあるロイヤル・メディカル・サービス・バーレーン腫瘍センターで、米国以外で世界初の鎌状赤血球症患者に対するカスゲビーによる治療が成功したことを発表し[ 62 ] [ 63 ]、世界保健機関事務局長のテドロス・アダノム・ゲブレイェソス氏から治療の成功を祝福された[ 64 ] 。
CRISPR-Cas9ゲノム編集は、II型CRISPRシステムを使用します。このシステムは、 Cas9 、crRNA、tracrRNAからなるリボ核タンパク質（RNP）と、オプションのDNA修復テンプレートで構成されています。
CRISPR-Cas9では、 RNPコンポーネントをコードするプラスミドを用いて標的細胞にトランスフェクションを行うか、RNPを組み立ててからヌクレオフェクションによって細胞に導入することが多い。[ 65 ]このプラスミドの主な構成要素は図に示され、表にリストされている。crRNAは、Cas9が宿主細胞のDNA内の特定の配列を識別して直接結合するために使用する配列であるため、アプリケーションごとに独自に設計されている。crRNAは、編集が必要な場所にのみ結合する必要がある。修復テンプレートも、切断の両側のDNA配列をある程度補完し、宿主ゲノムに挿入したい配列も含む必要があるため、アプリケーションごとに独自に設計されている。
複数のcrRNAとtracrRNAをまとめてパッケージ化して、シングルガイドRNA（sgRNA）を形成できます。[ 66 ]このsgRNAは、Cas9タンパク質をコードする遺伝子と一緒に含めてプラスミドにすることで、細胞に導入できます。効果的なsgRNA配列の設計を支援するオンラインツールが多数あります。[ 67 ] [ 68 ]
Cas9の代替となるタンパク質には、以下のようなものがある。
Cas12a（CRISPR関連タンパク質12a、以前はCpf1）は、クラスIIタイプVのCRISPR関連エンドヌクレアーゼ-エキソヌクレアーゼです。[82] F. novicidaなどの細菌[ 83 ] [ 84 ]では、 Cas12aはウイルスやその他の外来可動遺伝因子の遺伝物質を標的として破壊します。標的生物では、crRNAはCas12aが認識する定常領域と、以前に細胞に感染した外来核酸（例えば、ファージゲノムの一部）に相補的な「スペーサー」領域を含んでいます。 [ 85 ]
Cas12aはCas9とは異なり、二本鎖DNAに平滑末端とは対照的にずれた切断を生成します。[ 86 ] Cas12aは「Tリッチ」プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）（典型的には5'-TTTV-3'、ここでVはA、C、またはG）に依存しており、Cas9が好む「Gリッチ」PAM（典型的には5'-NGG-3'）とは異なる部位を提供します。[ 87 ]また、効果的なターゲティングにはCRISPR RNA（crRNA）のみが必要ですが、Cas9はcrRNAとトランス活性化crRNA（tracrRNA）の両方を必要とします。[ 88 ]
クラスIIシステムの改良版（特にCas12a）は、天然RNAの代わりに人工一本鎖DNAガイドで機能します。この新しいパラダイムでは、システムのエンドヌクレアーゼ活性は、dsDNAではなくssRNAの切断に向けられます。[ 89 ] DNAをガイドとして使用することで、複雑なRNAの調製や保存が不要になり、クラスIIエフェクターはプログラム可能なRNAターゲティングやトランスレーショナルバイオテクノロジーにおいてより汎用性が高まります。[ 89 ]
Cas13は、 RNAを標的とするオルソロガスなCRISPR関連エンドヌクレアーゼのファミリーです（DNAを標的とするCas9やCas12とは異なります）。Cas13は、単一のエンドヌクレアーゼを使用して、ガイドRNAと配列相補性のある特定のssRNAに結合して切断します。Cas13は、自身のCRISPR RNA（crRNA）の処理と標的RNA切断の触媒という2つの異なるリボヌクレアーゼ機能を実行します。[ 90 ] [ 91 ] [ 92 ]このシステムの特異性により、転写レベルでの変異の修正が可能になります。
Cas13は標的に結合したまま、他のssRNA分子を無差別に切断します。[ 93 ]この副次的切断特性は、さまざまな診断技術の開発に利用されています。[ 94 ] [ 95 ] [ 96 ]膵臓癌モデルでKRAS -G12D mRNAを効率的に修復し、健康な細胞への影響を最小限に抑えるために使用されています。[ 90 ]動物モデルでアッシャー症候群などの遺伝性疾患を治療するためにRNA塩基を編集するREPAIRプラットフォームなどのツールに採用されています。また、SHERLOCKなどの診断プラットフォームで、病原体、腫瘍DNA、ウイルス変異体を高感度で検出するために利用されています。[ 92 ] PAM非依存の標的化とオフターゲット効果の低減により、RNAイメージング、ファージゲノムエンジニアリング、一過性遺伝子制御に適しています。[ 91 ]
CRISPR-Cas9は高い忠実度と比較的単純な構造を提供します。その特異性は、標的配列とプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列という2つの要素に依存します。標的配列は、crRNAアレイ内の各CRISPR遺伝子座の一部として20塩基長です。[ 65 ]一般的なcrRNAアレイには、複数の固有の標的配列があります。Cas9タンパク質は、配列を利用して宿主DNA上の塩基対と結合することにより、宿主ゲノム上の正しい位置を選択します。この配列はCas9タンパク質の一部ではないため、カスタマイズ可能であり、独立して合成できます。[ 97 ] [ 98 ]
宿主ゲノム上のPAM配列はCas9によって認識される。Cas9は別のPAM配列を認識するように容易に改変することはできない。しかし、これは最終的にはそれほど大きな制約ではない。なぜなら、PAM配列は通常非常に短く非特異的な配列であり、ゲノム全体にわたって多くの場所に頻繁に出現するからである（例えば、SpCas9のPAM配列は5'-NGG-3'であり、ヒトゲノムでは約8～12塩基対ごとに出現する）。[ 65 ]
これらの配列がプラスミドに組み立てられ、細胞に導入されると、Cas9タンパク質はcrRNAの助けを借りて宿主細胞のDNA中の正しい配列を見つけ、Cas9の変異体に応じて、DNAの適切な場所に一本鎖または二本鎖切断を作成します。[ 99 ]
宿主DNAの適切な間隔で生じた一本鎖切断は相同組換え修復を誘発する可能性があり、これは二本鎖切断後に通常起こる非相同末端結合またはシータ介在末端結合よりもエラーが少ない。DNA修復テンプレートを提供することで、ゲノム内の正確な位置に特定のDNA配列を挿入することができる。修復テンプレートは、Cas9誘導DNA切断から40～90塩基対以上伸びる必要がある。[ 65 ]目標は、細胞本来のHDRプロセスが提供された修復テンプレートを利用して、新しい配列をゲノムに組み込むことである。組み込まれると、この新しい配列は細胞の遺伝物質の一部となり、娘細胞に受け継がれる。低分子化合物とsiRNAによるNHEJとTMEJの同時一過性阻害は、HDR効率を最大93%まで高め、同時にオフターゲット編集を防ぐことができる。[ 100 ]
Cas9、sgRNA、および関連複合体の細胞への送達は、ウイルス系および非ウイルス系を介して行うことができます。DNA 、RNA、またはリボヌクレオ複合体のエレクトロポレーションは一般的な手法ですが、標的細胞に有害な影響を与える可能性があります。[ 101 ]脂質およびペプチドを利用した化学的トランスフェクション技術も、Cas9と複合体を形成したsgRNAを細胞に導入するために使用されています。 [ 102 ] [ 103 ]ナノ粒子ベースの送達もトランスフェクションに使用されています。[ 104 ]トランスフェクションがより困難な種類の細胞（幹細胞、ニューロン、および造血細胞など）には、レンチウイルス（LV）、アデノウイルス（AdV）、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）に基づくものなど、より効率的な送達システムが必要です。[ 105 ] [ 106 ] [ 107 ]
CRISPR-Cas9 の効率は、遺伝子組み換えではなく、CRISPR/Cas9 構造全体から Cas9-gRNA 複合体まで、システムのさまざまなコンポーネントを組み立てられた形で送達すると大幅に向上することがわかっています。[ 108 ] [ 109 ]これは、大量商業化のための遺伝子組み換え作物で特に価値があることがわかりました。[ 110 ] [ 111 ]これらのタンパク質を生成するために宿主の複製機構は必要ないため、sgRNA の認識配列の可能性はほぼゼロであり、オフターゲット効果の可能性が低くなります。[ 104 ]
CRISPR-Cas9システムのさらなる改良と派生技術は、その使用における制御性の向上に重点を置いている。具体的には、このシステムの改良を目的とした研究には、特異性、効率性、および編集能力の粒度の向上が含まれる。技術は、改変するシステムの構成要素によってさらに細分化および分類することができる。これには、Casタンパク質の異なる変異体または新規作成物の使用、全く異なるエフェクタータンパク質の使用、sgRNAの改変、または既存の最適解を特定するためのアルゴリズム的手法の使用などが含まれる。
特異性は、CRISPR-Cas9 システムを改善する上で重要な側面です。なぜなら、このシステムが生み出すオフターゲット効果は細胞のゲノムに深刻な影響を与え、その使用には注意が必要だからです。したがって、オフターゲット効果を最小限に抑えることは、システムの安全性を最大限に高めることにつながります。特異性を高める新しい Cas9 タンパク質のバリエーションには、従来標的にできなかった配列を標的にできる、元の SpCas9 と同等の効率と特異性を持つエフェクター タンパク質や、オフターゲット変異がほとんどないバリアントなどがあります。[ 112 ] [ 113 ]また、新しい Cas9 タンパク質の設計に関する研究も行われており、crRNA の RNA ヌクレオチドを部分的に DNA に置き換えるものや、構造ガイド型 Cas9 変異体生成手順などがあり、いずれもオフターゲット効果が低減されています。[ 114 ] [ 115 ]繰り返し切断された sgRNA や高度に安定化された gRNA もオフターゲット効果を低減することが示されています。[ 116 ] [ 117 ]機械学習を含む計算手法は、特定の標的に対する特異性を最大化するために、システムの親和性を予測し、独自の配列を作成するために使用されてきました。[ 118 ] [ 119 ]
CRISPR-Cas9のいくつかのバリアントは、光や小分子などの外部トリガーによる遺伝子活性化やゲノム編集を可能にする。[ 120 ] [ 121 ] [ 122 ]これらには、光応答性タンパク質パートナーを活性化ドメインおよびdCas9と融合させて遺伝子活性化を行う光活性化CRISPRシステム[ 123 ] [ 124 ]、同様の光応答性ドメインを2つのsplit-Cas9構築物と融合させるもの[ 125 ] [ 126 ] 、ケージ化された非天然アミノ酸をCas9に組み込むもの[ 127 ] 、またはガイドRNAを光切断可能な相補鎖で修飾してゲノム編集を行うもの[ 128 ]などがある。
低分子によるゲノム編集の制御方法には、バックグラウンド編集が検出されないアロステリックCas9があり、4-ヒドロキシタモキシフェン（4-HT）の添加によって結合と切断が活性化される[ 120 ] 、 4-HT応答性インテイン結合Cas9 [ 129 ]、または4つのERT2ドメインに融合すると4-HT応答性になるCas9 [ 130 ]などがある。インテイン誘導性スプリットCas9はCas9断片の二量体化を可能にし[ 131 ]、ラパマイシン誘導性スプリットCas9システムは、2つのスプリットCas9構築物をFRBおよびFKBP断片と融合させることによって開発された[ 132 ]。他の研究では、低分子ドキシサイクリンでCas9の転写を誘導することができた。[ 133 ] [ 134 ]低分子化合物は相同組換え修復を改善するためにも使用でき、[ 135 ]多くの場合、非相同末端結合経路および/またはシータ介在末端結合経路を阻害することによって行われます。[ 136 ] [ 137 ]低分子化合物VE-822およびAZD-7762によって誘導されるCpf1エフェクタータンパク質を用いたシステムが作られました。[ 138 ]これらのシステムにより、CRISPR活性の条件付き制御が可能になり、精度、効率、および時空間制御が向上します。時空間制御はオフターゲット効果を除去する一形態であり、特定の細胞または生物の一部のみを改変する必要がある場合があり、そのため、光または低分子化合物をこれを行う方法として使用できます。CRISPR-Cas9システムの効率は、タンパク質および必要な試薬を作成するためのDNA指示を適切に送達することによっても大幅に向上します。[ 138 ]
CRISPRは、単一塩基対編集タンパク質も利用して、標的配列の1つまたは2つの塩基に特定の編集を行います。CRISPR/Cas9は、当初はCからT、GからAへの変異とその逆のみを変更できる特定の酵素と融合されました。これは最終的にDNA切断を必要とせずに達成されました。[ 139 ] [ 140 ] [ 141 ]別の酵素との融合により、塩基編集CRISPR-Cas9システムはCからGとその逆も編集できるようになりました。[ 142 ]
クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復配列（CRISPR）/Cas9システムは、ガイドリボ核酸（gRNA ）がプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列に結合できる場所であればどこでも二本鎖切断（DSB）を誘導できる遺伝子編集技術です。 [ 143 ] Cas9活性部位変異体（Cas9ニッカーゼとも呼ばれる）によって一本鎖ニックも誘導できます。 [ 144 ] gRNAの配列を変更するだけで、Cas9エンドヌクレアーゼを目的の遺伝子に送達してDSBを誘導できます。[ 146 ] Cas9エンドヌクレアーゼの効率と遺伝子を標的にできる容易さにより、マウス細胞とヒト細胞の両方でCRISPRノックアウト（KO）ライブラリーが開発され、特定の遺伝子セットまたはゲノム全体をカバーできるようになりました。[ 147 ] [ 148 ] CRISPRスクリーニングは、科学者が生きたモデル生物内で体系的かつハイスループットな遺伝子摂動を作り出すのに役立ちます。この遺伝子摂動は、遺伝子機能とエピジェネティック制御を完全に理解するために必要です。[ 149 ]プールされたCRISPRライブラリの利点は、一度に多くの遺伝子を標的にできることです。
ノックアウトライブラリーは、発現したすべてのgRNAで均等な表現とパフォーマンスを実現するように作成され、形質導入された細胞を回収するために使用できる抗生物質または蛍光選択マーカーを保持します。[ 143 ] CRISPR/Cas9ライブラリーには2つのプラスミドシステムがあります。1つ目は、sgRNAとCas9がトランスフェクトされた細胞で同時に生成されるオールインワンプラスミドです。2つ目は、sgRNAとCas9プラスミドが別々に送達される2ベクターシステムです。[ 149 ]ウイルス形質導入により、低感染多重度（MOI、通常0.1～0.6）で数千のユニークなsgRNA含有ベクターを1つの細胞容器に送達することが重要です。これにより、個々の細胞クローンが複数の種類のsgRNAを受け取る可能性がなくなり、そうでない場合は、遺伝子型と表現型の誤った割り当てにつながる可能性があります。[ 147 ]
プールされたライブラリーが準備されたら、sgRNA の豊富さを明らかにするために、PCR 増幅されたプラスミド DNA のディープ シーケンシング (NGS、次世代シーケンシング) を実行する必要があります。目的の細胞は、ライブラリーによって感染し、表現型に応じて選択されます。選択には、ネガティブ選択とポジティブ選択の 2 種類があります。ネガティブ選択では、死細胞または増殖の遅い細胞が効率的に検出されます。これにより、生存に必須の遺伝子を特定でき、分子標的薬の候補としてさらに利用できます。一方、ポジティブ選択では、ランダムな突然変異誘発によって増殖上の利点を獲得した集団のコレクションが得られます。[ 143 ]選択後、ゲノム DNA が収集され、NGS によってシーケンスされます。sgRNA の減少または増加が検出され、sgRNA が対応する標的遺伝子で注釈付けされた元の sgRNA ライブラリーと比較されます。次に、統計分析によって、目的の表現型に関連する可能性が有意に高い遺伝子が特定されます。[ 147 ]
ノックアウトの他に、ノックダウン（CRISPRi）および活性化（CRISPRa）ライブラリーもあり、これらはプロテアーゼで不活性化されたCas9融合タンパク質（dCas9）が標的DNAに結合する能力を利用するため、目的の遺伝子は切断されずに過剰発現または抑制されます。これにより、CRISPR/Cas9システムは遺伝子編集においてさらに興味深いものとなりました。不活性dCas9タンパク質は、dCas9リプレッサーまたはアクチベーターを標的遺伝子のプロモーターまたは転写開始部位に向けることで遺伝子発現を調節します。遺伝子を抑制するために、Cas9はgRNAと複合体を形成するKRABエフェクタードメインに融合できますが、CRISPRaは、異なる転写活性化ドメインに融合したdCas9を利用し、さらにgRNAによってプロモーター領域に誘導されて発現を上方制御します。[ 151 ] [ 152 ] [ 153 ]
Cas9ゲノム改変により、遺伝学分野において迅速かつ効率的なトランスジェニックモデルの作成が可能になった。Cas9は、sgRNAとともにプラスミドトランスフェクションを介して標的細胞に容易に導入でき、疾患の蔓延や感染に対する細胞の応答と防御をモデル化することができる。 [ 154 ] Cas9をin vivoで導入できることで、遺伝子機能や変異の影響に関するより正確なモデルを作成できるだけでなく、従来の遺伝子工学手法でよく見られるオフターゲット変異も回避できる。
CRISPRとCas9によるゲノムモデリングの革命は、哺乳類だけにとどまりません。最初のモデル生物の一つであるショウジョウバエなどの従来のゲノムモデルも、Cas9の使用により解像度がさらに向上しました。[ 154 ] Cas9は細胞特異的なプロモーターを使用することで、Cas9の制御された使用を可能にします。Cas9酵素は特定の細胞型のみに作用するため、Cas9は疾患を治療する正確な方法です。Cas9療法を受けている細胞は除去して再導入することで、治療効果を増幅させることもできます。[ 155 ]
CRISPR-Cas9は、生体内で生物のDNAを編集し、発生のどの段階においても、個々の遺伝子や染色体全体を除去するために使用できます。CRISPR技術を用いて生体内で除去に成功した染色体には、成体実験用マウスのY染色体とX染色体、および胚性幹細胞株と異数体マウスのヒト染色体14と21が含まれます。この方法は、ダウン症候群や性分化疾患など、染色体数の異常によって引き起こされる遺伝性疾患の治療に役立つ可能性があります。[ 156 ]
CRISPR-Cas9 を用いた生体内ゲノム編集の成功は、大腸菌[ 157 ] 、サッカロミセス・セレビシエ[ 158 ] [ 159 ] 、カンジダ・アルビカンス、メタンサルシナ・アセチボランス[ 160 ] [ 161 ] 、線虫 [ 162 ] 、シロイヌナズナ属[ 163 ] 、ゼブラフィッシュ[ 164 ] 、およびハツカネズミ( mus musculus ) [ 165 ] [ 166 ]を含む多数のモデル生物で実証されている。基礎生物学の研究、疾患モデルの作成 [ 162 ] [ 167 ]、および疾患モデルの実験的治療 [ 168 ] において成功を収めている。
オフターゲット効果（意図した遺伝子以外の遺伝子の編集）がCRISPR遺伝子編集実験の結果を混乱させる可能性がある（つまり、観察された表現型の変化は、標的遺伝子の改変によるものではなく、他の遺伝子の改変によるものである可能性がある）という懸念が提起されている。オフターゲット効果の可能性を最小限に抑えるために、CRISPRに改良が加えられてきた。遺伝子編集実験の結果を確認するために、直交CRISPR実験がしばしば推奨される。[ 169 ] [ 170 ]
CRISPRは、疾患を模倣したり、遺伝子がノックダウンまたは変異したときに何が起こるかを示す研究用の遺伝子改変生物の作成を簡素化します。CRISPRは、標的遺伝子があらゆる場所（つまり、多細胞生物のすべての細胞/組織/器官）で変化する生物を作成するために生殖細胞系列レベルで使用することも、生物内の特定の細胞集団のみに影響を与える局所的な変化を作成するために非生殖細胞系列で使用することもできます。[ 171 ] [ 172 ] [ 173 ]
CRISPRは、疾患のヒト細胞モデルを作成するために利用できます。[ 174 ]例えば、ヒト多能性幹細胞に適用した場合、CRISPRは多発性嚢胞腎（PKD）および巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）に関連する遺伝子に標的変異を導入するために使用されてきました。 [ 175 ]これらのCRISPRで改変された多能性幹細胞は、その後、疾患特異的な表現型を示すヒト腎臓オルガノイドに成長しました。PKD変異を持つ幹細胞由来の腎臓オルガノイドは、腎尿細管から大きく半透明の嚢胞構造を形成しました。嚢胞は、直径1センチメートルまでの肉眼的寸法に達することができました。[ 176 ] FSGSに関連する遺伝子に変異を持つ腎臓オルガノイドは、その疾患で影響を受ける濾過細胞であるポドサイト間の接合部欠陥を発症しました。これは、ポドサイトが隣接する細胞間に微絨毛を形成できないことに起因することがわかりました。[ 177 ]重要なことに、これらの疾患表現型は、遺伝的背景は同じだがCRISPR改変のない対照オルガノイドでは見られなかった。[ 175 ]
同様のアプローチは、多能性幹細胞由来の心筋細胞におけるQT延長症候群のモデル化にも用いられた。 [ 178 ]これらのCRISPRで生成された細胞モデルは、同質遺伝子コントロールとともに、ヒト疾患の研究や薬剤試験のための新しい方法を提供する。
CRISPR編集は、複雑な疾患に関連する非コードアレルの分子機能を定義するために使用できます。[ 179 ]これらのアレルは、複雑な形質と普遍的に関連しており、関連する細胞型での遺伝子制御を変化させることによって機能します。また、機能を割り当てることは非常に困難です。ゲノム編集を使用して個々の変異をゲノムに導入し、その後下流の分子効果を定義することができます。このアプローチは、対象となる変異に適した細胞型または細胞株で行う必要があります。また、このアプローチは、オフターゲット効果、編集効率の低さ、および遺伝子編集の非特異的な転写効果によって混乱する可能性があります。
CRISPR-Cas技術は、特に遺伝的原因によるものなど、多くのヒト疾患の治療法として提案されている。[ 180 ]特定のDNA配列を改変する能力により、病気を引き起こす突然変異を修復する可能性を秘めたツールとなっている。動物モデルを用いた初期の研究では、CRISPR技術に基づく治療法が、癌[ 182 ]、早老症[ 183 ] 、βサラセミア[ 184 ][ 185 ] [ 186 ] 、鎌状赤血球症[ 186 ] [ 187 ] 、血友病[ 188 ]、嚢胞性線維症[ 189 ]、デュシェンヌ型筋ジストロフィー[ 190 ] 、ハンチントン病[ 191 ][192] 、トランスサイレチンアミロイドーシス[ 47 ]、心臓病[ 193 ]など、幅広い疾患の治療に有効である可能性が示唆されている。CRISPRは蚊のマラリア治療にも使用されており、これにより媒介生物とヒトのマラリアを根絶できる可能性がある。[ 194 ] CRISPRは、移植拒絶反応を引き起こすことが多いMHCクラスIIタンパク質の発現を欠くヒト血管を作成するなど、組織工学や再生医療にも応用できる可能性がある。 [ 195 ]
さらに、CRISPR-Cas9技術を用いたヒト患者におけるβサラセミアおよび鎌状赤血球症の治療に関する臨床試験では、有望な結果が示されています。 [ 196 ] [ 197 ] 2023年12月、米国食品医薬品局（FDA）は、鎌状赤血球症の治療のための初の細胞ベースの遺伝子治療薬であるCasgevyとLyfgeniaを承認しました。Casgevyは、CRISPR-Cas9技術を使用するFDA承認の初の遺伝子治療薬であり、患者の造血幹細胞を改変することによって作用します。[ 198 ]
しかしながら、遺伝子治療におけるこの技術の使用にはいくつかの制限が残っている。オフターゲット効果の頻度が比較的高いこと、標的部位の近くにPAM配列が必要であること、CRISPR誘導二本鎖切断によるp53を介したアポトーシス、そして通常はウイルスによる送達システムに起因する免疫原性毒性などである。[ 199 ]
CRISPRは細胞ベースの免疫療法の開発にも多くの応用例が見出されている。[ 200 ] CRISPRを用いた最初の臨床試験は2016年に開始された。この試験では、肺がん患者から免疫細胞を採取し、CRISPRを用いてプログラム細胞死タンパク質1 （PD-1）を発現する遺伝子を編集除去した後、改変した細胞を同じ患者に投与した。 2017年時点で、主に中国で20件の臨床試験が進行中または準備段階にあった。[ 182 ]
2016年、米国食品医薬品局（FDA）は、CRISPRを使用してさまざまな種類の癌患者から採取したT細胞を改変し、その改変されたT細胞を同じ患者に投与する臨床試験を承認した。[ 201 ]
2020年11月、マウス動物モデルにおいて、CRISPRは膠芽腫（急速に増殖する脳腫瘍）と転移性卵巣がんの治療に効果的に使用された。これらは予後が最も悪いがんの1つであり、通常は進行期に診断される。治療の結果、転移性卵巣がんでは腫瘍の増殖が抑制され、生存率が80%向上し、腫瘍細胞のアポトーシスにより、膠芽腫では腫瘍の増殖が50%抑制され、生存率が30%向上した。[ 202 ]
2021年10月、CRISPR Therapeutics社は、米国で実施中の同種T細胞療法に関する第1相臨床試験の結果を発表した。これらの細胞は健康なドナーから採取され、がん細胞を攻撃し、レシピエントの免疫系が脅威と認識しないように編集され、その後、多数のレシピエントに投与できるほど大量に増殖される。[ 203 ]
2022年12月、グレート・オーモンド・ストリート病院の医師らは、治療不可能なT細胞急性リンパ芽球性白血病と診断された13歳のイギリス人少女を治癒させた。これは、この目的での治療的遺伝子編集の最初の記録例であり、他の治療法が失敗した後、6か月間の実験的治療を受けた結果である。この手順には、まず健康なT細胞を再プログラムして癌化したT細胞を破壊し、白血病を取り除き、次に健康な免疫細胞を使用して免疫システムをゼロから再構築することが含まれていた。[ 204 ]チームはBASE編集を使用し、2015年にはTALENを使用して急性リンパ芽球性白血病の症例を治療した経験があった。[ 205 ]
1型糖尿病は、膵臓のβ細胞がインスリンを産生できなくなることで起こる内分泌疾患です。インスリンは、血糖を細胞に運び、エネルギー産生に不可欠な物質です。研究者たちは、健康なβ細胞の移植を試みてきました。CRISPRを用いて細胞を編集することで、患者の体が移植を拒絶する可能性を低減しようとしています。
2021年11月17日、CRISPR TherapeuticsとViaCyteは、カナダの医療当局が、1型糖尿病の治療を目的としたCRISPR編集幹細胞療法VCTX210の臨床試験申請を承認したと発表した。これは、糖尿病に対する遺伝子編集療法として初めて臨床応用を目指したものであり、重要な意義を持つ。両社はまた、CRISPR遺伝子編集幹細胞由来の数百万個の膵臓細胞を用いた小型医療用インプラントを介してインスリンを生成する、1型糖尿病の新規治療法も開発した。[ 206 ]
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、体の免疫系を攻撃するウイルスです。患者が健康な生活を送れるようにする効果的な治療法は存在しますが、HIVは逆行性であり、つまり、不活性なバージョンのウイルスをヒトゲノムに組み込みます。CRISPRは、逆行性HIVゲノムを標的とするガイドRNAを設計することで、ゲノムからウイルスを選択的に除去するために使用できます。このアプローチの問題の1つは、ほぼすべての細胞からHIVゲノムを除去する必要があることですが、これは現実的に達成するのが難しい場合があります。[ 203 ]
HIVの治療と治癒における初期の成果はかなり成功しており、2021年には抗レトロウイルス剤とCRISPR/Cas-9の組み合わせで治療された23匹のヒト化マウスのうち9匹で、通常の再増殖期間後でもウイルスが検出不能になった。2つの治療法のいずれも単独ではこのような効果はなかった。[ 208 ] CRISPR-Cas9ベースの治療法であるEBT-101のヒトでの臨床試験は2022年に開始された。[ 209 ] [ 210 ] 2023年10月、EBT-101の3人を対象とした初期段階の研究で、治療は重大な副作用がなく安全であるように見えたが、その有効性に関するデータは開示されなかったと報告された。[ 211 ] 2024年3月、アムステルダム大学の研究者による別のCRISPR療法が細胞培養でHIVの排除を報告した。[ 212 ] [ 213 ]
CRISPR-Casベースの「RNA誘導ヌクレアーゼ」は、病原性因子、抗生物質耐性をコードする遺伝子、およびその他の医学的に関連のある配列を標的とするために使用できます。したがって、この技術は、新しい形態の抗菌療法であり、細菌集団を操作する戦略を表しています。[ 214 ] [ 215 ]最近の研究では、CRISPR-Cas遺伝子座の干渉と抗生物質耐性の獲得との間に相関関係があることが示唆されています。[ 216 ]このシステムは、トランスポゾン、バクテリオファージ、プラスミドなどの侵入する外来DNAから細菌を保護します。このシステムは、細菌病原体における抗生物質耐性および病原性因子の獲得に対する強力な選択圧であることが示されています。[ 216 ]
遺伝子操作されたバクテリオファージによって送達されるCRISPR-Cas3遺伝子編集技術に基づく治療法は、病原体の標的DNAを破壊するために使用できる。[ 217 ] Cas3は、よりよく知られているCas9よりも破壊力が高い。[ 218 ] [ 219 ]
研究によると、CRISPRは複数のヘルペスウイルスの複製を制限する効果的な方法であることが示唆されています。エプスタイン・バーウイルス（EBV）の場合、ウイルスDNAを根絶することができました。抗ヘルペスウイルスCRISPRは、腫瘍細胞から癌を引き起こすEBVを除去したり、免疫不全患者への臓器移植時にウイルス感染を防いだり、 HSV-1の再活性化を阻害することで口唇ヘルペスや再発性眼感染症を予防したりするなど、有望な応用が期待されています。2016年8月現在 これらはテスト待ちだった。[ 220 ]
CRISPRは、動物の臓器を人間に移植するという概念を復活させる可能性がある。動物のゲノムに存在するレトロウイルスは、移植を受けた人に害を及ぼす可能性がある。2015年、あるチームは、腎臓上皮細胞内のブタのゲノムから特定のレトロウイルスDNA配列の62コピーを除去した。 [ 221 ]研究者らは最近、CRISPRを使用してこれらのレトロウイルスをゲノムから除去した後、生きたブタの標本を初めて出産できることを実証した。[ 222 ]
CRISPRは、神経疾患における機能獲得変異を抑制し、機能喪失変異を修復するために使用できる。[ 223 ]この遺伝子編集ツールは、分子経路の統合のための生体内応用の足がかりとなっている。
CRISPRは、いくつかの理由から神経疾患の解決に向けた開発において独自の役割を果たしています。例えば、CRISPRを用いることで、研究者は動物やヒトの細胞モデルを迅速に作成し、神経系における遺伝子の働きを研究することができます。これらの細胞に様々な疾患に関連する変異を導入することで、研究者は神経系の発達、機能、行動に対する変化の影響を研究することができます。[ 224 ]これにより、これらの疾患に寄与する分子メカニズムを解明することができ、これは効果的な治療法の開発に不可欠です。これは、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかんなどの複雑な神経疾患のモデル化と治療において特に有用です。
アルツハイマー病（AD）は、神経細胞の喪失と脳内の細胞内神経原線維変化および細胞外アミロイド斑の蓄積を特徴とする神経変性疾患である。 [ 225 ]ヒトの早期発症型ADを引き起こす3つの病原性遺伝子、具体的にはアミロイド前駆体タンパク質（APP）、プレセニリン1（PSEN1）、およびプレセニリン2（PSEN2）が特定されている。[ 225 ]これらの遺伝子には300を超える変異が検出されており、その結果、総βアミロイド（Aβ）、Aβ42/40比、および/またはAβ重合の増加が生じる。
CRISPRは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因となるジストロフィン遺伝子や、てんかん疾患であるドラベ症候群の原因となるSCN1A遺伝子変異の修復に用いられてきた。[ 226 ] [ 227 ]神経疾患の治療にCRISPRを用いる際の課題は、その構成要素を血液脳関門を越えて輸送することである。しかし、ナノ粒子送達システムやウイルスベクターの最近の進歩により、この障害を克服できる可能性が示されている。将来を見据えると、技術の進化に伴い、神経科学におけるCRISPRの使用は増加すると予想される。
世界で最も一般的に発生する眼疾患は白内障と網膜色素変性症（RP）です。これらはアルファ鎖のミスセンス変異によって引き起こされ、永久的な失明につながります。眼疾患におけるCRISPR 77hhの使用の課題は、眼の網膜組織が体の免疫応答を受けないことです。研究者たちはCRISPRを使用するために、網膜タンパク質をコードする遺伝子を捕捉し、ゲノムを編集するというアプローチをとっています。[ 228 ]
LCA10（遺伝性小児失明の主な原因であるレーバー先天性黒内障の最も一般的な変異型）に対するCRISPR治療は、患者の欠陥のある光受容体遺伝子を改変する。
2020年3月、 Editas Medicineがスポンサーとなっているこの米国を拠点とする研究で、最初の患者ボランティアに安全性を確認するために低用量の治療薬が投与された。2021年6月、高用量の成人および小児コホート（それぞれ4人の患者ボランティア）の登録が開始された。新しいコホートへの投与は2022年7月までに完了する予定だった。[ 203 ] 2022年11月、Editasは治療を受けた患者の20%に著しい改善が見られたと報告したが、結果として得られた対象集団は独立した開発を継続するには小さすぎるとも発表した。[ 229 ]
CRISPR技術は心臓病の治療に効果的であることが示されています。家族性高コレステロール血症（FH）の場合、動脈壁へのコレステロール沈着により血流が阻害されます。これは、低密度リポタンパク質コレステロール受容体（LDLC）の変異によってコレステロールが血液中に過剰に放出されることが原因です。これは、LDLC受容体のエクソン4の塩基対を欠失させることで治療できます。これはナンセンス変異です。
この疾患は、ヘモグロビンの構造に突然変異が生じたり、グロビン鎖の異なるアミノ酸が置換されたりすることによって引き起こされる遺伝性疾患に分類されます。そのため、赤血球（RBC）は心不全、血管障害、成長障害、視覚障害など一連の障害を引き起こします。[ 230 ] β-ヘモグロビン症を治療するために、患者の多能性細胞をマウスモデルに移植し、体外での遺伝子治療の速度を研究します。その結果、mRNAの発現と遺伝子の修復が起こります。興味深いことに、赤血球の半減期も増加しました。
血友病は、血液凝固タンパク質の1つが正常に機能しないために血液凝固機能が失われる病気です。研究チームは、ヒトの血友病Bに見られるのと同じ欠陥のある凝固タンパク質を持つマウスの系統を作製しました。CRISPR-Cas9を使用することで、チームは欠陥のあるタンパク質の正常なバージョンの遺伝子をこれらのマウスの肝細胞に挿入することができました。十分な数の肝細胞が修復され、これらのマウスの血友病の症状が軽減されました。[ 231 ]
CRISPR-Cas9ゲノム編集の成功は、2013年8月に植物で初めて達成されました。[ 232 ] [ 233 ]それ以来、多くの農業特性の導入または改良を目的として、いくつかの主要な作物種に成功裏に適用されています。[ 234 ] CRISPR技術の開発は植物バイオテクノロジーの分野に大きな影響を与えており、農業の未来を革新する可能性を秘めています。[ 234 ]
CRISPR-Casシステムは、アグロバクテリウムを介した形質転換によって植物に導入されることが最も一般的ですが、粒子銃法やプロトプラスト形質転換も使用されています。[ 235 ]
CRISPR-Cas技術の使用により、いくつかの種で作物収量の向上が達成されている。穀物作物の収量は、植物ホルモンであるサイトカイニンのレベルによって影響を受ける。[ 236 ] CRISPR-Cas9を使用してサイトカイニンを分解する酵素であるサイトカイニンオキシダーゼ/デヒドロゲナーゼ（CKX）をノックアウトすることにより、高収量のイネ[ 237 ]およびコムギ[ 238 ]品種が生産されている。また、CRISPR-Cas9を使用してアミノ酸トランスポーターをノックアウトすることにより、イネの収量が増加している。[ 239 ]
CRISPRは、外観、風味と香り、食感、保存期間、栄養価の向上など、より高品質な作物の開発に利用されてきました。[ 240 ]ピンク色、[ 241 ]黄色、[ 242 ]紫色[ 243 ]のトマトは、色素合成に関わる遺伝子をCRISPRで変異させることにより生産されています。CRISPRは小麦のデンプン含有量を減らすためにも使用され、穀物の品質を向上させています。 [ 244 ]さらに、大豆はCRISPRを使用して、オレイン酸などの心臓に良い一価不飽和脂肪酸をより多く含むように改変されています。[ 245 ]
CRISPR技術は、食品中のアレルゲンの量を減らすためにも使用されています。[ 246 ]一般的なアレルゲンであり不耐性の原因となるグルテンのレベルを下げた小麦がCRISPRを使用して開発されています。[ 247 ]研究者たちはまた、CRISPR-Cas9を使用して大豆、ピーナッツ、マスタードのアレルゲンを減らすことに取り組んでいます。[ 246 ]
CRISPRは、さまざまな病気に対する耐性を向上させた植物の開発に利用されてきました。[ 248 ] CRISPRを使用して、キュウリ、イネ、タバコはウイルス耐性を持つように遺伝子操作されています。小麦、イネ、トマト、ブドウ、カカオは真菌病に対する耐性を持つように改変されています。最後に、イネ、リンゴ、柑橘類は細菌感染に対する耐性を持つように開発されています。[ 248 ]
現在、約6000種類の遺伝性疾患が知られており、そのほとんどは現状では治療法がない。遺伝子治療におけるCRISPRの役割は、欠陥のある遺伝子の代わりに外来DNAを挿入することである。[ 249 ]遺伝子治療は大きな影響を与え、医療バイオテクノロジーに多くの新たな可能性を開いた。
研究者たちは遺伝子編集において多くの課題に直面している。[ 250 ]臨床応用における主な障害は倫理的問題と標的部位への輸送システムである。CRISPRシステムのユニットは細菌から採取されるため、宿主細胞に導入されると、それらに対する免疫反応を引き起こす。物理的、化学的、ウイルスベクターが複合体を宿主に送達するための媒体として使用される。
このため、細胞損傷による細胞死など、多くの合併症が生じています。ウイルスベクターの場合、ウイルスの容量は小さく、Cas9タンパク質は大きいという問題があります。そこで、これらの問題を克服するために、細菌からより小型のCas9株を取り出す新しい方法が開発されました。しかしながら、このシステムをさらに改良するには、依然として多くの研究が必要です。
CRISPR関連ヌクレアーゼは、非標的配列のバックグラウンドが高い場合でも核酸配列を特異的に標的とすることができるため、分子検査ツールとして有用であることが示されています。2016年には、Cas9ヌクレアーゼが、わずか250ピコグラムの初期RNA入力で次世代シーケンシングライブラリから不要なヌクレオチド配列を除去するために使用されました。[ 253 ] 2017年以降、CRISPR関連ヌクレアーゼは、単一分子感度まで核酸の直接診断検査にも使用されるようになりました。[ 251 ] [ 254 ] CRISPRの多様性は、 Martinsら（ 2019 ）によるキサントモナスなどの細菌の系統発生と多様性を識別するための分析ターゲットとして使用されています。 [ 255 ] : 552病原体のCRISPRの分子型別による植物病原体の早期検出は、 Shenらによって実証されているように、農業で使用できます。 2020年。[ 255 ]： 553
CRISPRベースの診断法を他の酵素プロセスと組み合わせることで、核酸以外の分子の検出が可能になります。組み合わせた技術の1つは、SHERLOCKベースのin vitro転写プロファイリング（SPRINT）です。SPRINTは、患者サンプル中の代謝物や環境サンプル中の汚染物質など、さまざまな物質をハイスループットまたは携帯型ポイントオブケアデバイスで検出するために使用できます。[ 256 ] CRISPR-Casプラットフォームは、 COVID-19を引き起こすウイルスであるSARS-CoV-2の検出[ 257 ] [ 258 ] [ 252 ] [ 259 ] [ 260 ]および不活化にも研究されています。[ 261 ] SARS-CoV-2については、AIOD-CRISPRとSHERLOCKテストという2つの異なる包括的な診断テストが特定されています。[ 262 ] SHERLOCKテストは、1マイクロリットルあたり10コピーを識別する能力を持つ蛍光標識されたプレスレポーターRNAに基づいています。[ 263 ] AIOD-CRISPRは、ウイルス核酸の堅牢で高感度な視覚的検出に役立ちます。[ 264 ]
CRISPR-Cas9は、ヒトと他の類人猿の遺伝的差異、特に脳の差異を調査および特定するために使用できます。たとえば、古代遺伝子変異を脳オルガノイドに再導入して神経発生への影響を示すこと[ 265 ] 、発達中の新皮質の頂端前駆細胞の中期長[ 266 ]、または胚性幹細胞の遺伝子をノックアウトして、初期の細胞形態変化を介してヒト前脳の進化的拡大を促進する遺伝子調節因子を特定すること[ 267 ] [ 268 ]などです。ある研究では、古代遺伝子変異が神経発達に大きな影響を与えることが説明されました[ 269 ] [ 270 ]が、これはCRISPRの副作用によるアーティファクトである可能性があり[ 271 ] [ 272 ]、その後の研究では再現できませんでした[ 100 ] 。
Cas9の「不活性」バージョン（dCas9）を使用すると、CRISPRのDNA切断能力は失われますが、目的の配列を標的とする能力は維持されます。複数のグループがdCas9にさまざまな制御因子を追加し、ほぼすべての遺伝子をオンまたはオフにしたり、その活性レベルを調整したりできるようにしました。[ 221 ] RNAiと同様に、CRISPR干渉（CRISPRi）は、部位を切断するのではなく標的にすることで、可逆的に遺伝子をオフにします。標的部位はメチル化され、遺伝子がエピジェネティックに修飾されます。この修飾により転写が阻害されます。これらの正確に配置された修飾は、DNA内の特定のゲノム配列の阻害後の遺伝子発現とDNAダイナミクスへの影響を制御するために使用できます。過去数年間で、さまざまなヒト細胞のエピジェネティックマークが綿密に研究され、マーク内の特定のパターンが腫瘍の成長から脳活動まであらゆるものと相関していることがわかりました。[ 10 ]逆に、CRISPR媒介活性化（CRISPRa）は遺伝子転写を促進します。[ 273 ] Cas9は、DNAレベルで特定の遺伝子を標的にしてサイレンシングする効果的な方法です。[ 274 ]バクテリアでは、Cas9が存在するだけで転写を阻害するのに十分です。哺乳類への応用では、タンパク質の一部が追加されます。そのガイドRNAは、標的遺伝子の直前にあるプロモーターと呼ばれる調節DNA配列を標的とします。[ 275 ]
Cas9は、特定のヒト遺伝子を活性化する合成転写因子を運ぶために使用された。この技術は、複数のCRISPR構築物を遺伝子のプロモーター上のわずかに異なる場所に標的とすることで、強力な効果を発揮した。[ 275 ]
2016年、研究者らは、一般的な口腔内細菌由来のCRISPRがRNA編集に利用できることを実証した。研究者らは、数億の遺伝子配列を含むデータベースを検索し、CRISPR遺伝子に類似するものを探した。彼らは、フソバクテリウム属のLeptotrichia shahiiに着目した。この細菌は、CRISPR遺伝子に類似した遺伝子群を持っていたが、重要な違いがあった。研究者らが、C2c2と名付けたこれらの遺伝子を他の細菌に導入したところ、これらの生物が新たな防御機構を獲得したことがわかった。[ 276 ] C2c2は後に、Cas遺伝子の標準的な命名法に合わせるため、Cas13aと改名された。[ 277 ]
多くのウイルスは、新しいウイルスを作るために再利用するDNAではなくRNAに遺伝情報をコード化している。HIVやポリオウイルスはそのようなウイルスである。Cas13を持つ細菌は、RNAを分解してウイルスを破壊する分子を作る。これらの遺伝子を改変することで、あらゆるRNA分子の編集が可能になった。[ 276 ]
CRISPR-Casシステムは、植物のマイクロRNAおよび長鎖非コードRNA遺伝子の編集にも利用できる。 [ 278 ]
変異した配列を修正するための編集の指示は、1995 年に初めて提案され、実証されました。 [ 279 ] この最初の研究では、ジストロフィン配列の早期終止コドン変異に相補的な合成 RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドを使用して、モデル ゼノパス細胞システムで終止コドンを A から I への編集を活性化し、読み飛ばしコドンにしました。[ 279 ] これにより、近くの意図しない A から I への遷移も発生しましたが、A から I (G として読み取られる) への遷移は、3 つの終止コドンすべてを修正できますが、終止コドンを作成することはできません。したがって、この変更により、下流のルシフェラーゼ レポーター配列への読み飛ばしを伴う標的終止コドンの 25% 以上が修正されました。Rosenthal によるその後の研究では、シチジン デアミナーゼに連結したオリゴヌクレオチドを指示して、変異した嚢胞性線維症配列を修正することにより、哺乳類細胞培養で変異した mRNA 配列の編集が達成されました。[ 280 ] 最近では、脱アミノ酵素と融合したCRISPR-Cas13がmRNA編集の誘導に用いられている。[ 281 ]
2022年には、Cas7-11を用いた治療用RNA編集が報告された。[ 282 ] [ 283 ]十分に標的を絞った切断が可能であり、その初期バージョンは2021年にin vitro編集に使用された。 [ 284 ]
遺伝子ドライブは、侵入種を排除することで生態系のバランスを回復させる強力なツールとなる可能性がある。有効性、標的種および非標的種における意図しない結果、特に研究所から野生への偶発的な放出の可能性に関する懸念が提起されている。科学者たちは、分子レベル、生殖レベル、生態レベルを含む、実験的な遺伝子ドライブの封じ込めを確実にするためのいくつかの安全策を提案している。[ 286 ]必要に応じてその効果を上書きするために、免疫化ドライブと逆転ドライブを遺伝子ドライブと並行して開発することを推奨する人も多い。[ 287 ]逆転ドライブでは修正できない生態系の混乱の可能性など、長期的な影響をより徹底的に研究する必要があるというコンセンサスは依然として存在する。[ 288 ]
未濃縮のシーケンスライブラリーには、不要な配列が大量に含まれていることが多い。Cas9は、制限酵素に見られるような大きなオフターゲット効果なしに、最大99%の効率で二本鎖切断により不要な配列を特異的に除去することができる。Cas9による処理は、RNA-seqライブラリー中の病原体感受性を高めながら、豊富なrRNAを除去することができる。[ 289 ]
エピゲノム編集、またはエピゲノム工学とは、遺伝子工学の一種であり、特定の部位を標的とした人工分子を用いてエピゲノムを改変する（ゲノム全体を改変するのとは対照的である）。遺伝子編集はDNA配列そのものを変更するのに対し、エピジェネティック編集はDNA配列を改変し、DNAの機能に影響を与えるタンパク質やその他のDNA結合因子に提示する。このようにエピゲノムの特徴を「編集」することで、研究者は問題となっている部位におけるエピジェネティック修飾の正確な生物学的役割を解明することができる。
エピゲノム編集に用いられる人工タンパク質は、特定の配列を標的とするDNA結合ドメインと、エピゲノムの特徴を修飾するエフェクタードメインから構成される。現在、エピゲノム編集には主に3つの主要なDNA結合タンパク質群が用いられている。すなわち、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（TALE）、およびヌクレアーゼ欠損型Cas9融合タンパク質（CRISPR）である。
疾患関連遺伝子の標的制御は、特に適切な遺伝子治療がまだ開発されていないか不適切な場合、多くの疾患に対する新しい治療法を可能にする可能性がある。[ 290 ]世代を超えた影響や集団レベルでの影響は完全には理解されていないが、応用機能ゲノミクスや個別化医療の主要なツールになる可能性がある。[ 291 ] RNA編集と同様に、遺伝子変化とその付随するリスクは伴わない。[ 290 ]エピゲノム編集の潜在的な機能的使用の1つの例は、2021年に説明された。CRISPR -dCas9を介してNa v 1.7遺伝子発現を抑制することで、慢性疼痛の3つのマウスモデルで治療の可能性が示された。[ 292 ] [ 293 ]
2022年には、タウタンパク質レベルの低下、ハンチントン病に関与するタンパク質の調節、遺伝性肥満の標的化、およびドラベ症候群におけるその有用性が研究によって評価された。[ 294 ]
2024年に行われた糖尿病性創傷治癒に関する研究[ 295 ]では、メチル化によるヒストンの修飾が大規模なEV（細胞外小胞）の産生を刺激し、糖尿病性足潰瘍の血管新生を減少させ、それによって死亡リスクを低下させることが示されました。
CRISPR-Cas9とインテグラーゼの組み合わせにより、 2022年にPASTEで実証されたように、問題のある二本鎖切断を起こさずに大規模な編集を行う技術が可能になった。研究者らは、この技術は36,000塩基対もの長い遺伝子を数種類のヒト細胞に導入するために使用でき、それによって多数の突然変異によって引き起こされる疾患の治療に役立つ可能性があると報告した。[ 296 ] [ 297 ]
ベースエディタには2種類あります。
シチジン塩基エディターは、シチジン（C）をチミジン（T）に変化させる新しい治療法である。
アデニン塩基エディター（ABE）[ 298 ]では、塩基の相補性がアデニン（A）からグアニン（G）に変化します。
変異は細胞DNAに直接導入されるため、ドナーテンプレートは不要です。塩基編集では点変異しか編集できません。さらに、最大4つの点変異しか修復できません。[ 299 ]この問題を解決するために、CRISPRシステムはCas9融合と呼ばれる新しい技術を導入し、編集可能な遺伝子の規模を拡大しました。
プライム編集[ 300 ]は、DNAの特定の部分を正確に置換、挿入、または削除するためのCRISPRの改良版です。CRISPR編集は一般的に効率が悪く、エラーが発生しやすく、標的特異性に欠ける場合があり、これは医療分野でこの技術を使用する上で大きな問題となります。[ 301 ]プライム編集では、CRISPRニッカーゼを使用して標的ゲノムDNAの一本鎖を切断し、次にテザー逆転写酵素を使用して、切断されたDNA末端に目的の配列を追加し、それをゲノムに組み込みます。[ 302 ] pegRNAと呼ばれる関連するガイドRNAには、標的遺伝子配列を決定するための配列と、ゲノムに組み込まれる新しいDNA配列のテンプレートの両方が含まれています。[ 303 ]このゲノム編集の導入メカニズムは、インデルなどの意図しない配列組み込みエラーの発生率が低く、非常に効率的かつ正確です。標的とテンプレートの独立したペアリングイベントが協力してオフターゲット編集を防ぎ、標的の柔軟性と編集特異性を大幅に向上させます。プライム編集は、マサチューセッツ州にあるMITとハーバード大学のブロード研究所の研究者によって開発されました。[ 304 ]
2015年3月現在、米国、中国、英国の研究所や米国のバイオテクノロジー企業OvaScienceなど、複数のグループがヒト胚へのCRISPRの適用によるヒト生殖細胞系工学の基礎を築くことを目的とした研究が進行中であることを発表している。[ 305 ] CRISPRの共同発見者を含む科学者たちは、特に臨床使用を目的としたヒト生殖細胞系へのCRISPRの適用について世界的な一時停止を求めた。彼らは、「科学および政府機関の間でその影響全体が議論されるまで、緩やかな管轄区域では、ヒトへの臨床応用を目的とした生殖細胞系ゲノム改変を試みることさえ避けるべきだ」と述べた。[ 306 ] [ 307 ]これらの科学者たちは、CRISPRに関するさらなる低レベルの研究を支持しており、CRISPRはヒトに遺伝的変化をもたらす臨床使用に十分なほど開発されていないと考えている。[ 308 ]
2015年4月、中国の科学者らは、致死性の遺伝性疾患であるβサラセミアを引き起こす突然変異を修正するために、CRISPRを使用して生存不能なヒト胚のDNAを改変する試みの結果を報告した。 [ 309 ] [ 310 ]この研究は、倫理的な懸念などから、以前はNatureとScienceの両方で却下されていた。 [ 311 ]実験の結果、意図した遺伝子の一部のみを改変することに成功し、他の遺伝子にはオフターゲット効果が生じた。研究者らは、CRISPRは生殖医療における臨床応用には準備ができていないと述べている。[ 311 ] 2016年4月、中国の科学者らは、CRISPRを使用して生存不能なヒト胚のDNAを改変する2度目の試みを行ったが、今回はCCR5遺伝子を改変して胚をHIV感染に抵抗性にするためであったと報告された。[ 312 ]
2015年12月、デビッド・ボルティモアの指導の下、ワシントンでヒト遺伝子編集に関する国際サミットが開催された。米国、英国、中国の国立科学アカデミーのメンバーが、生殖細胞系列の改変の倫理について議論した。彼らは、特定の法的および倫理的ガイドラインの下で基礎研究と臨床研究を支援することに合意した。編集の影響が単一の個人に限定される体細胞と、ゲノムの変化が子孫に遺伝する生殖細胞系列との間に明確な区別がなされた。遺伝する改変は、遺伝学的（例：遺伝子と環境の相互作用）および文化的（例：社会ダーウィニズム）に、意図せず広範囲にわたる人類の進化に影響を与える可能性がある。ヒトに遺伝する変化を生み出すために配偶子や胚を改変することは無責任であると定義された。このグループは、このような懸念に対処し、各国の規制を調和させるための国際フォーラムを立ち上げることに合意した。[ 313 ]
2017年2月、米国科学・工学・医学アカデミー（NASEM）のヒト遺伝子編集委員会は、ゲノム工学技術の倫理的、法的、科学的懸念事項を検討した報告書を発表した。報告書の結論では、遺伝性ゲノム編集は現状では許容されないが、特定の医学的状態においては正当化される可能性があると述べられている。しかし、 CRISPRを機能強化のために使用することは正当化されていない。[ 314 ]
2018年11月、ジャンクイ・ヘは、HIVが細胞に侵入するために使用する受容体をコードするCCR5遺伝子を不活性化するために、2つのヒト胚を編集したと発表した。彼は、数週間前に双子の女児、ルルとナナが生まれたと述べた。彼は、女児たちは機能するCCR5のコピーと不活性化されたCCR5（モザイク現象）の両方を持っており、依然としてHIVに感染しやすい状態にあると述べた。この研究は、非倫理的で危険で時期尚早であるとして広く非難された。[ 315 ]国際的な科学者グループは、ヒト胚の遺伝子編集に対する世界的な一時停止を求めた。[ 316 ]
CRISPR-Cas9システムに関する政策規制は世界中で異なっている。2016年2月、英国の科学者たちは規制当局からCRISPR-Cas9および関連技術を用いてヒト胚を遺伝子改変する許可を得た。しかし、研究者たちは胚を移植することは禁じられており、胚は7日後に破棄されることになっていた。[ 317 ]
米国には、新しい遺伝子組み換え食品や作物を評価するための、複雑な省庁間規制システムがあります。たとえば、2000 年農業リスク保護法は、米国の農業、環境、経済を保護するために、植物害虫や有害雑草の検出、制御、根絶、抑制、防止、または蔓延の遅延を監督する権限を米国農務省に与えています。この法律は、事前に定義された「植物害虫」のゲノムを利用する遺伝子組み換え生物、または以前に分類されていない植物を規制します。 [ 318 ] 2015 年、Yinong Yang は、白いボタンマッシュルームの 16 個の特定の遺伝子を不活性化して褐変しないようにすることに成功しました。彼は生物に外来種 (遺伝子組み換え) DNA を追加していなかったため、このキノコは、セクション 340.2 に基づいて USDA によって規制されませんでした。[ 319 ]ヤンの白いマッシュルームは、CRISPR-Cas9タンパク質システムで遺伝子組み換えされた最初の生物として、米国の規制を通過した。[ 320 ]
2016年、米国農務省は、今後の遺伝子改変技術に関する規制政策を検討する委員会を後援した。米国科学・工学・医学アカデミーの協力を得て、4月15日に特別利益団体が会合を開き、今後5年間の遺伝子工学の進歩の可能性と、その結果として必要となる可能性のある新たな規制について検討した。[ 321 ] 2017年、食品医薬品局は、動物に対する遺伝子工学的改変を「動物用医薬品」に分類し、販売される場合は厳格な規制の対象とし、個人や中小企業が利益を上げる能力を低下させる規則を提案した。[ 322 ] [ 323 ]
社会状況が欧米とは大きく異なる中国では、遺伝性疾患には強い偏見が伴う。[ 324 ]このため、中国ではこの技術の利用に対する政策上の障壁が少ない。[ 325 ] [ 326 ]
2012年と2013年に、CRISPRはサイエンス誌で次点となった。の年間最優秀ブレークスルー賞。2015年に同賞を受賞。[ 221 ] CRISPRは、2014年と2016年にMITテクノロジーレビューの10のブレークスルー技術の1つに選ばれた。[ 327 ] [ 328 ] 2016年、ジェニファー・ダウドナとエマニュエル・シャルパンティエは、ロドルフ・バランゴウ、フィリップ・ホルヴァート、フェン・チャンとともにガードナー国際賞を受賞した。2017年、ダウドナとシャルパンティエは、CRISPR-Cas9の革新的な発明により、日本の東京で日本賞を受賞した。2016年、シャルパンティエ、ダウドナ、チャンは唐奨生物医薬品科学部門を受賞した。[ 329 ] 2020年、シャルパンティエとダウドナは「ゲノム編集法の開発」によりノーベル化学賞を受賞した。 [ 330 ]
<...> ええ、最初に記事を送ったのは私たちだったのですが、あまり運が良くありませんでした。
{{cite journal}}: CS1 maint: 設定の上書き (リンク){{cite journal}}: CS1 maint: 設定の上書き (リンク){{cite journal}}: CS1 maint: 設定の上書き (リンク){{cite journal}}: CS1メンテナンス: DOIは2025年7月現在非アクティブです（リンク）
CC BY 4.0 ライセンス の下で利用可能。2017年10月16日にWayback Machineにアーカイブされました。{{cite journal}}: CS1 maint: 設定の上書き (リンク){{cite journal}}: CS1 maint: 設定の上書き (リンク)サイエンス誌に寄稿した生物学者たちは、この技術を用いた実験室での研究継続を支持しており、臨床使用の準備が整っていると考える科学者はほとんどいない。