エピゲノム編集

エピゲノム編集またはエピゲノム工学は、特定の部位をターゲットにした人工分子を使用して、特定の部位のエピゲノムを変更する遺伝子工学の一種です(ゲノム全体の変更とは対照的です)。遺伝子編集では実際の DNA 配列自体を変更するのに対し、エピジェネティック編集では DNA 配列を変更して、DNA 機能に影響を与えるタンパク質やその他の DNA 結合因子に提示します。このようにエピゲノム特性を「編集」することで、研究者は問題の部位でのエピジェネティック変更の正確な生物学的役割を判断できます。

エピゲノム編集に使用される人工タンパク質は、特定の配列を標的とする DNA 結合ドメインと、エピゲノムの特徴を変更するエフェクタードメインで構成されています。現在、エピゲノム編集には、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター (TALE)、ヌクレアーゼ欠損 Cas9 融合 ( CRISPR ) の 3 つの主要な DNA 結合タンパク質グループが主に使用されています。

ゲノム全体のエピジェネティックマップを遺伝子発現と比較することで、研究者は特定の修飾に活性化または抑制の役割を割り当てることができるようになりました。エピゲノムの制御におけるDNA配列の重要性は、DNAモチーフを使用してエピゲノム修飾を予測することで実証されています。^[1]エピジェネティクスの背後にあるメカニズムへのさらなる洞察は、 in vitro生化学および構造分析から得られています。モデル生物を使用して、研究者はノックアウト研究を通じて多くのクロマチン因子の役割を説明できました。ただし、クロマチン修飾因子全体をノックアウトすると、ゲノム全体に大きな影響が及ぶため、特定のコンテキストでのその機能を正確に表すとは限りません。その一例として、DNAメチル化はリピート領域、プロモーター、エンハンサー、および遺伝子本体で発生します。遺伝子プロモーターでのDNAメチル化は通常、遺伝子抑制と相関しますが、遺伝子本体でのメチル化は遺伝子活性化と相関しており、DNAメチル化は遺伝子スプライシングでも役割を果たす可能性があります。^[2] 個々のメチル化部位を直接標的にして編集する能力は、特定の部位におけるDNAメチル化の正確な機能を決定するために重要です。エピゲノム編集は、この種の分析を可能にする強力なツールです。部位特異的なDNAメチル化編集やヒストン編集のために、ゲノム編集システムはエピジェネティック編集システムに適合されています。つまり、遺伝子編集のために人工的または天然に存在するヌクレアーゼ機能を備えたゲノムホーミングタンパク質を変異させ、純粋な送達システムに適応させることができます。エピジェネティック修飾酵素またはドメインをホーミングタンパク質に融合することができ、タンパク質のリクルートメント時に局所的なエピジェネティック修飾を変更できます。例外的にDNAメチル化の場合、ホーミングドメイン自体が通常のエピジェネティックプロセスを妨害して、標的を絞ったエピジェネティック編集につながる可能性があります。^[3]

転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質は、そのDNA結合ドメインの構成に基づいて特定のDNA配列を認識します。^[4] これにより、研究者はTALEの一次タンパク質構造を編集することで、標的DNA配列を認識するさまざまなTALEタンパク質を構築できます。 このタンパク質の結合特異性は、通常、得られたDNA断片のクロマチン免疫沈降（ChIP）とサンガーシーケンシングを使用して確認されます。 ^{[5] [6] [7]}この確認は、すべてのTALE配列認識研究で依然として必要です。^[8] エピゲノム編集に使用する場合、これらのDNA結合タンパク質はエフェクタータンパク質に結合します。 この目的で使用されてきたエフェクタータンパク質には、10-11転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ1（TET1）^[6] 、リジン（K）特異的デメチラーゼ1A（LSD1）^[7]、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質1（CIB1）^[5]などがあります。

エピゲノム編集の部位を認識するためのジンクフィンガー融合タンパク質の使用も検討されている。Maederらは、DNA脱メチル化に使用するためのZF-TET1タンパク質を構築した。^[6]これらのジンクフィンガータンパク質は、変更可能なタンパク質構造に基づいてDNA上の特定の配列部位に結合できるという点で、 TALEタンパク質と同様に機能する。Chenらは、TET1タンパク質と結合したジンクフィンガーDNA結合ドメインを使用して、以前にサイレンシングされたいくつかの遺伝子の脱メチル化を誘導することに成功した。^[9] KungulovskiとJeltschは、ZFP誘導DNAメチル化遺伝子の沈着を使用して遺伝子サイレンシングを引き起こすことに成功したが、トリガー信号が停止するとDNAメチル化とサイレンシングは失われた。著者らは、安定したエピジェネティックな変化には、関連するエピジェネティックマークのDNAメチル化の複数の沈着、または長期にわたるトリガー刺激が必要であると示唆している。^[10] ZFPエピジェネティック編集は、さまざまな神経変性疾患を治療する可能性を示している。^[11]

クラスター化調節性間隔短縮回文反復配列（CRISPR） -Casシステムは、DNA部位特異的ヌクレアーゼとして機能する。^[12]よく研究されているタイプII CRISPRシステムでは、Cas9ヌクレアーゼはtracrRNAとcrRNAからなるキメラと結合する。このキメラはガイドRNA（gRNA）と呼ばれることが多い。Cas9タンパク質がDNA領域特異的gRNAと結合すると、Cas9は標的DNA遺伝子座でDNAを切断する。しかし、D10AおよびH840A点変異が導入されると、DNAに結合できるが切断しない、触媒不活性Cas9（dCas9）が生成されます。^[13] dCas9システムは、部位特異的DNAメチル化を導入するための標的エピジェネティック再プログラミングに利用されている。DNMT3a触媒ドメインを dCas9 タンパク質と融合することにより、dCas9-DNMT3a は、本ガイド RNA によって指定された標的領域の標的 DNA メチル化を達成することができます。 ^{[14]同様に、dCas9 はヒトアセチルトランスフェラーゼ}p300の触媒コアと融合されています。dCas9-p300 は、ヒストン H3 リジン 27 の標的アセチル化を触媒することに成功しています。^{[15] [16]あるいは、dCas9 タンパク質のみでも、分裂細胞で標的とされた部位で}DNA メチル化を維持する通常のプロセスを物理的に妨害するのに十分であり、その結果、標的 DNA の脱メチル化が起こります。このアプローチの主な利点は、エピジェネティック修飾酵素が存在しないことです。エピジェネティック修飾酵素は、標的の dCas9 タンパク質に結び付けられているにもかかわらず、ゲノム全体で独立して作用し、広範囲にわたるエピジェネティック マークに影響を与える可能性があり、多くの場合、広範囲にわたるオフターゲット効果につながります。^[3]

CRISPRエピゲノム編集の変異体（FIRE-Cas9と呼ばれる）は、何か問題が発生した場合に、行われた変更を元に戻すことを可能にする。^{[17] [18]}

CRISPRoffは、ほとんどの遺伝子の遺伝子発現を遺伝的に抑制し、可逆的な改変を可能にするために使用できる不活性化Cas9融合タンパク質である。^{[19] [20]}

TET1はCpG部位のシトシンの脱メチル化を誘導する。このタンパク質はCpGメチル化によって抑制されている遺伝子を活性化し、個々のCpGメチル化部位の役割を決定するために使用されている。^[6] dCas9-TETを細胞に導入すると、過剰発現したTET酵素の広範囲にわたるオフターゲット活性につながるため、標的脱メチル化は通常dCas9単独（通常のDNAメチル化機構への標的干渉による）でよりよく達成されると広く信じられている。^[3] LSD1はH3K4me1 / 2の脱メチル化を誘導し、これはH3K27の脱アセチル化の間接的な影響も引き起こす。このエフェクターはエンハンサー領域のヒストンに使用でき、隣接する遺伝子の発現を変化させることができる。^[7] CIB1は光感受性クリプトクロムであり、このクリプトクロムはTALEタンパク質と融合されている。 2番目のタンパク質には、クロマチン/DNA修飾子（例：SID4X）と融合した相互作用パートナー（CRY2 ）が含まれています。CRY2は、青色光の照射によってクリプトクロムが活性化されるとCIB1と相互作用することができます。 ^[21]この相互作用により、クロマチン修飾子が目的の場所に作用することができます。これは、修飾が誘導的かつ可逆的に実行できることを意味し、構成的なエピジェネティック修飾によって引き起こされる長期的な二次的影響を軽減します。^[5]

ゲノム内の遺伝子エンハンサー領域を標的としたエピジェネティックな改変による編集は、Mendenhall ら (2013) によって実証されています。^[7]この研究では、遺伝子のエンハンサーを標的とし、エンハンサーのサイレンシングを誘導してエンハンサーの活性と遺伝子制御を推測するために、TALE-LSD1 エフェクター融合タンパク質を使用しました。特定のエンハンサーを標的にし、その後に遺伝子座特異的RT-qPCR を行うことで、サイレンシングされたエンハンサーによって影響を受ける遺伝子を特定できます。あるいは、遺伝子の上流領域でエンハンサーのサイレンシングを誘導することで、遺伝子発現を変化させることができます。その後、 RT-qPCR を使用して、これが遺伝子発現に与える影響を研究できます。これにより、エンハンサーの機能と活性を詳細に研究できます。^[7]

特定のメチル化部位が遺伝子発現の制御に果たす役割を理解することは重要です。これを研究するために、ある研究グループはTALE-TET1融合タンパク質を使用して単一のCpGメチル化部位を脱メチル化しました。^[6]このアプローチでは、標的遺伝子座への特異的結合を確実にするために多くの制御が必要ですが、このアプローチを使用して適切に実施された研究は、特定のCpGメチル化部位の生物学的機能を決定することができます。^[6]

誘導メカニズムを用いたエピジェネティック編集は、さまざまな状態におけるエピジェネティック効果を研究するための幅広い可能性を提供します。ある研究グループは、配列特異的TALE DNA結合ドメインと光感受性クリプトクロム2タンパク質（CIB1）を統合したオプトジェネティックツーハイブリッドシステムを採用しました。 ^[5]細胞内で発現すると、このシステムはヒストン修飾を誘導的に編集し、特定の状況でその機能を決定することができました。^[5]

疾患関連遺伝子の標的制御は、多くの疾患に対する新たな治療法を可能にする可能性があり、特に適切な遺伝子治療がまだ開発されていない、または不適切である場合に有効である。 ^{[22]世代間および集団レベルの影響は完全には理解されていないが、応用機能ゲノミクスおよび}個別化医療の主要なツールとなる可能性がある。^[23] RNA編集と同様に、遺伝子変化およびそれに伴うリスクは伴わない。^[22]エピゲノム編集の潜在的な機能的使用の一例が2021年に記載された。慢性疼痛の3つのマウスモデルで治療の可能性を示した、 CRISPR-dCas9によるNa _v 1.7 遺伝子発現の抑制である。^{[24] [25]}

2022年には、タウタンパク質レベルの低下、ハンチントン病に関与するタンパク質の調節、遺伝性の肥満、ドラベ症候群の治療における有用性が研究で評価されました。^[26]

配列特異性はエピゲノム編集において非常に重要であり、注意深く検証されなければならない（これはクロマチン免疫沈降法の後にサンガー配列決定を行って標的配列を検証することで行うことができる）。^{[8] TALE融合がエピゲノム修飾因子の触媒活性に影響を及ぼすかどうかは不明である。これは、}ポリコーム抑制複合体などの複数のサブユニットと複合体を必要とするエフェクタータンパク質では特に重要である可能性がある。^[8]エピゲノム編集に使用されるタンパク質は、標的部位でリガンドと基質を阻害することもある。^[8] TALEタンパク質自体は、同じ配列を標的としている場合、転写因子と競合することさえある。 ^[8]さらに、DNA修復システムはクロマチンの変更を元に戻し、望ましい変更が行われないようにする可能性がある。^[8]最後に、dCas9に融合された酵素は通常、融合先のdCas9タンパク質とは独立して作用することができる。これらの融合体が細胞内で過剰発現すると、これらの酵素はゲノムの広範囲に渡って改変を行う傾向があり、劇的なオフターゲット活性を引き起こす。^{[3] [27]}そのため、信頼性が高く繰り返し可能なエピゲノム編集のためには、融合構造と標的化メカニズムを最適化する必要がある。

• DNA編集
• RNA編集