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プライマーは、すべての生物がDNA合成の開始時に使用する短い一本鎖核酸です。合成プライマーはオリゴヌクレオチドの一種です。DNAポリメラーゼ（DNA複製を担う酵素）は、既存の核酸の3'末端にのみヌクレオチドを付加できるため、DNAポリメラーゼが相補鎖の合成を開始する前に、プライマーが鋳型に結合している必要があります。[ 1 ]
DNAポリメラーゼはRNAプライマーに結合した後、ヌクレオチドを追加して鎖全体を合成します。その後、RNA鎖を正確に除去し、DNAヌクレオチドに置き換える必要があります。これにより、ニックと呼ばれるギャップ領域が形成され、リガーゼを使用して埋められます。[ 2 ] RNAプライマーの除去プロセスには、Fen1、Lig1などのいくつかの酵素が必要であり、これらはDNAポリメラーゼと協調して働き、RNAヌクレオチドの除去とDNAヌクレオチドの追加を確実にします。
生物はRNAプライマーのみを使用するが、生化学や分子生物学の実験技術で、 DNAシーケンスやポリメラーゼ連鎖反応など、試験管内でのDNA合成を必要とするものには、温度安定性が高いDNAプライマーが一般的に使用される。プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの特定の反応に合わせて実験室で設計することができる。PCRプライマーを設計する際には、プライマーの融解温度や反応自体のアニーリング温度など、考慮すべき特定の項目がある。
RNAプライマーは、生物がDNA鎖の合成を開始する際に使用されます。プライマーゼと呼ばれる酵素群は、リーディング鎖とラギング鎖の両方において、相補的なRNAプライマーを読み取りテンプレートにde novoで付加します。プライマーの遊離3'-OH（プライマー末端と呼ばれる）から、DNAポリメラーゼは新たに合成された鎖を伸長することができます。DNA複製におけるリーディング鎖は、複製フォークと共に移動する1本の連続した断片として合成され、合成を開始するには最初のRNAプライマーのみが必要です。ラギング鎖では、テンプレートDNAは5'→3'方向に走ります。DNAポリメラーゼはテンプレート鎖に相補的な塩基を3'→5'方向に付加できないため、DNAは複製フォークから離れて移動する短い断片（岡崎フラグメントと呼ばれる）として「逆方向」に合成されます。リーディング鎖とは異なり、この方法ではDNA合成の開始と停止が繰り返されるため、複数のRNAプライマーが必要となります。 DNAテンプレートに沿って、プライマーゼはDNAポリメラーゼが5′→3′方向にDNAを合成するために使用するRNAプライマーを散りばめる。[ 1 ]
DNA合成を可能にするためにプライマーが使用されるもう1つの例は、逆転写です。逆転写酵素は、RNAの鋳型鎖を使用して相補的なDNA鎖を合成する酵素です。逆転写酵素のDNAポリメラーゼ成分は、合成を開始するために既存の3'末端を必要とします。[ 1 ]
岡崎フラグメントの挿入後、RNAプライマーが除去され（除去のメカニズムは原核生物と真核生物で異なる）、 RNAプライマーが存在していたギャップを埋める新しいデオキシリボヌクレオチドに置き換えられる。その後、 DNAリガーゼが断片化された鎖を結合し、ラギング鎖の合成を完了する。[ 1 ]
原核生物では、DNAポリメラーゼIは、前のRNAプライマーに到達するまで岡崎フラグメントを合成します。その後、この酵素は同時に5′→3′エキソヌクレアーゼとして働き、前方のプライマーリボヌクレオチドを除去し、後方にデオキシリボヌクレオチドを追加します。RNAプライマーの重合と切除の両方の活性は5′→3′の方向に起こり、ポリメラーゼIはこれらの活性を同時に行うことができます。これは「ニックトランスレーション」として知られています。[ 1 ]ニックトランスレーションとは、RNAプライマーの除去とデオキシリボヌクレオチドの追加におけるポリメラーゼIの同期した活性を指します。その後、鎖間にニックと呼ばれるギャップが形成され、 DNAリガーゼを使用して閉じられます。
真核生物では、ラギング鎖のRNAプライマーの除去は複製完了に不可欠である。そのため、ラギング鎖はDNAポリメラーゼδによって5'→3'方向に合成され、不連続なDNA鎖である岡崎フラグメントが形成される。次に、DNAポリメラーゼが前の岡崎フラグメントからRNAプライマーの5'末端に到達すると、プライマーの5'末端を一本鎖RNAフラップに押し出し、ヌクレアーゼ切断によって除去される。RNAフラップの切断には、プライマー除去の3つの方法がある。[ 3 ]プライマー除去の最初の可能性は、5'突出フラップを切断するフラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ1 （FEN-1）によって直接除去される短いフラップを作成することである。この方法は、RNAプライマー除去の短いフラップ経路として知られている。[ 4 ] RNAプライマーを切断する2番目の方法は、 RNaseを使用してRNA鎖を分解することです。真核生物では、RNase H2として知られています。この酵素は、プライマーの5'末端に近いヌクレオチドを除いて、アニーリングしたRNAプライマーの大部分を分解します。したがって、残りのヌクレオチドはフラップとして表示され、FEN-1を使用して切断されます。RNAプライマーを除去する最後の可能な方法は、ロングフラップ経路として知られています。[ 4 ]この経路では、いくつかの酵素が動員されてRNAプライマーを伸長し、その後切断します。フラップは、 Pif1として知られる5'から3'ヘリカーゼによって伸長されます。Pif1によってフラップにヌクレオチドが追加された後、ロングフラップは複製タンパク質A （RPA）によって安定化されます。 RPA結合DNAはFEN1の活性またはリクルートを阻害するため、フラップを切断するために別のヌクレアーゼがリクルートされる必要がある。[ 3 ]この2番目のヌクレアーゼはDNA2ヌクレアーゼであり、ヘリカーゼヌクレアーゼ活性を持ち、RNAプライマーの長いフラップを切断し、その後、FEN1によって切断される数個のヌクレオチドが残る。最後に、すべてのRNAプライマーが除去されると、岡崎フラグメント間にニックが形成され、ライゲーションと呼ばれるプロセスを経て、リガーゼ1として知られる酵素を使用してデオキシリボヌクレオチドで埋められる。
合成プライマーは、通常はDNAからなる化学合成オリゴヌクレオチドであり、鋳型DNA上の特定の部位にアニーリングするようにカスタマイズできます。溶液中では、プライマーはDNAポリメラーゼによって伸長される前に、ワトソン・クリック塩基対形成によって鋳型と自発的にハイブリダイズします。サンガーシーケンスと次世代シーケンスの両方で、反応を開始するためにプライマーが必要です。[ 1 ]
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）では、増幅される配列の両端でDNA伸長を互いに誘導するために、一対のカスタムプライマーが使用されます。これらのプライマーは通常18～24塩基の長さで、増幅される配列の特定の上流および下流部位に相補的です。[ 1 ]
プライマーのペアは、PCR中のアニーリングが両方の鎖で同時に起こるため、同様の融解温度を持つように設計されている。融解温度は、反応のアニーリング温度よりも高すぎても低すぎてもならない。アニーリング温度が低すぎると、非特異的な構造が形成され、反応効率が低下する可能性がある。[ 5 ]
さらに、プライマー配列は、DNAの特定の領域を一意に選択し、近くの類似配列とのハイブリダイゼーションの可能性を回避するように選択する必要があります。プライマー部位を選択する一般的な方法はBLAST検索であり、これにより、プライマーが結合する可能性のあるすべての領域を確認できます。ヌクレオチド配列とプライマー自体の両方をBLAST検索できます。無料のNCBIツールPrimer-BLASTは、プライマー設計とBLAST検索を1つのアプリケーションに統合しており[ 6 ] 、ePrimeやBeacon Designerなどの市販のソフトウェア製品も同様です。設計したプライマーの特異性を評価するために、in silico PCRを実行することができます[ 7 ] 。
プライマー結合のための特定のDNA領域を選択するには、いくつかの追加的な考慮事項が必要です。モノヌクレオチドおよびジヌクレオチドの繰り返しが多い領域は、ループ形成が起こり、ハイブリダイゼーションの失敗につながる可能性があるため、避けるべきです。互いに相補的なプライマーはプライマーダイマーの形成につながり、目的の反応の効率を低下させる可能性があります。[ 8 ]自己アニーリング可能なプライマーは、内部ヘアピンやループを形成し、テンプレートDNAとのハイブリダイゼーションを阻害する可能性があります。[ 8 ]
プライマーを設計する際に、各プライマーの末端にヌクレオチド塩基を追加することで、増幅領域の両端にカスタマイズされたキャップ配列を形成できます。この手法の応用例の一つとして、PCRに似た特殊なサブクローニング技術であるTAクローニングがあり、5'末端と3'末端にAGテールを追加することで効率を高めることができます。[ 9 ]
状況によっては、縮重プライマーの使用が必要になる場合があります。縮重プライマーとは、類似しているが同一ではないプライマーの混合物です。異なる生物から同じ遺伝子を増幅する場合、配列は類似しているが同一ではないため、縮重プライマーが便利です。この技術は、遺伝暗号自体が縮重している、つまり複数の異なるコドンが同じアミノ酸をコードできるため有用です。これにより、異なる生物が非常に類似したタンパク質をコードする、大きく異なる遺伝子配列を持つことができます。このため、特定のコドン配列が不明な場合、タンパク質配列に基づいてプライマーを設計する場合にも縮重プライマーが使用されます。したがって、アミノ酸イソロイシンに対応するプライマー配列は「ATH」となる可能性があります。ここで、Aはアデニン、Tはチミン、Hはアデニン、チミン、またはシトシンを表し、各コドンの遺伝暗号に従って、縮重塩基にはIUPAC記号を使用します。縮重プライマーは標的配列と完全にハイブリダイズしない可能性があり、その結果、PCR増幅の特異性が大幅に低下する可能性がある。
縮重プライマーは、微生物生態学の分野で広く用いられ、非常に有用である。これらを用いることで、これまで培養されていなかった微生物から遺伝子を増幅したり、ゲノム情報が入手できない生物から遺伝子を回収したりすることが可能になる。通常、縮重プライマーは、GenBankに登録されている遺伝子配列をアラインメントすることによって設計される。配列間の違いは、個々の塩基にIUPACの縮重度規則を用いることで考慮される。その後、PCRプライマーは、コドン配列のすべての順列に対応するプライマーの混合物として合成される。