ガイドRNA

ガイドRNA（gRNA）またはシングルガイドRNA（sgRNA）は、Cas9エンドヌクレアーゼまたは他のCasタンパク質^[1]のガイドとして機能する短いRNA配列であり、二本鎖DNAを切断して遺伝子編集に使用できます。^[2]細菌および古細菌では、gRNAはCRISPR -Casシステムの一部であり、生物をウイルスから保護する適応免疫防御として機能します。ここで、短いgRNAは外来DNAの検出器として機能し、外来核酸を分解するCas酵素を誘導します。^{[1] [3]}

RNA編集ガイドRNAは、1990年にB. Blum、N. Bakalara、L. Simpsonによって、真核寄生虫Leishmania tarentolaeのミトコンドリアマキシサークルDNAのノーザンブロットハイブリダイゼーションにより発見されました。2000年代半ばからその後の数年間にわたる研究では、gRNAとCRISPR-Casシステムの構造と機能が調査されました。2012年にgRNAがCas9エンドヌクレアーゼを誘導して二本鎖DNAに標的特異的な切断を導入できることが発見され、大きな進歩が遂げられました。この発見により、CRISPR-Cas9遺伝子編集技術の開発への貢献により、 ジェニファー・ダウドナとエマニュエル・シャルパンティエは2020年のノーベル賞を受賞しました。

トリパノソーマ原生生物および他のキネトプラスト類は、ミトコンドリア内でウリジンの挿入/削除を実行する「RNA編集」と呼ばれる転写後RNA修飾プロセスを持っています。^{[4] [5]}このミトコンドリアDNAは環状で、マキシサークルとミニサークルに分かれています。ミトコンドリアには約50個のマキシサークルが含まれており、コード領域と非コード領域の両方があり、約20キロベース（kb）で構成されています。コード領域は高度に保存されており（16〜17kb）、非コード領域は種によって異なります。ミニサークルは小さい（約1kb）ですが、マキシサークルよりも数が多く、ミトコンドリアには数千個のミニサークルが含まれています。^{[6] [7] [8]}マキシサークルは「クリプト遺伝子」といくつかのgRNAをコードでき、ミニサークルは大部分のgRNAをコードできます。 gRNA遺伝子の中には、異なる配列であっても挿入部位と削除部位が同一であるものもあれば、編集済みのmRNAと相補的でない配列を持つものもあります。マキシサークルとミニサークル分子は、ミトコンドリア内で巨大なDNAネットワークに連結されています。^{[9] [8] [10]}

マキシサークル転写産物の大部分は、その配列のフレームシフトのためにタンパク質に翻訳できない。これらのフレームシフトは、正確な部位でのウリジン残基の挿入と削除によって転写後に修正され、オープンリーディングフレームが形成される。このオープンリーディングフレームはその後、他の細胞に見られるミトコンドリアタンパク質と相同なタンパク質に翻訳される。^[11]ウリジンの挿入と削除のプロセスは、短いガイドRNA（gRNA）によって媒介され、相補配列を介して編集情報をエンコードし、グアニンとウラシル（GU）間、およびグアニンとシトシン（GC）間の塩基対形成を可能にして、編集プロセスを容易にする。^[12]

ガイドRNAは主にDNAマキシサークルの遺伝子間領域から転写され、mRNAと相補的な配列を持っています。gRNAの3'末端には、非コード化領域にあるオリゴ「U」テール（長さ5〜24ヌクレオチド）が含まれていますが、5'アンカーと3'アンカーによって熱力学的に安定化された編集済みmRNAとgRNAのAとGに富んだ領域と相互作用して安定した複合体を形成します。^[13]この最初のハイブリッドは、編集される特定のmRNA部位を認識するのに役立ちます。^[14]

RNA 編集は、通常、mRNA の 3' 末端から 5' 末端に向かって進行します。最初の編集プロセスは、gRNA が編集部位のすぐ下流にある相補的な mRNA 配列と RNA 二重鎖を形成するときに始まります。このペアリングは、gRNA-mRNA アンカーに隣接する最初のミスマッチ塩基の切断を指示する多数のリボ核タンパク質複合体をリクルートします。これに続いて、ウリジリルトランスフェラーゼが3' 末端に「U」を挿入し、RNA リガーゼが 2 つの切断された末端を結合します。このプロセスは、次の上流編集部位で同様の方法で繰り返されます。通常、単一の gRNA は、複数の編集部位 (編集「ブロック」) の情報をエンコードし、編集により完全な gRNA/mRNA 二重鎖が生成されます。この連続編集プロセスは、酵素カスケード モデルとして知られています。^{[14] [12] [15]}

「パン編集」されたmRNAの場合、^[16]二重鎖がほどけ、別のgRNAが編集されたmRNA配列と二重鎖を形成し、別の編集ラウンドが開始されます。これらの重複したgRNAは編集「ドメイン」を形成します。一部の遺伝子には複数の編集ドメインが含まれています。 [ ^17]特定の遺伝子の編集の範囲は、トリパノソーマ科の種によって異なります。この違いは、おそらく特定のgRNAをコードするミニサークル配列クラスの損失による、3'側での編集の喪失です。進化による編集の部分的、場合によっては完全な喪失を説明するために、レトロポジション^[18]モデルが提案されています。編集の喪失は通常致命的ですが、そのような喪失は古い実験室株で観察されています。これらの古代の原生生物の長い進化の歴史にわたって編集が維持されていることは、選択的優位性の存在を示唆していますが、その正確な性質はまだ不明です。^[16]

トリパノソーマ類がなぜこのような複雑なメカニズムを利用してmRNAを生成するのかは明らかではない。このメカニズムはトリパノソーマ類の祖先であるボドニド類に存在することから、キントプラスト類原生生物系統の祖先の初期ミトコンドリアに由来する可能性があるが^{[19] 、キネトプラスト類と同じ共通祖先から分岐した}ユーグレナ類には存在しない可能性がある。

原生動物Leishmania tarentolaeでは、18 個のミトコンドリア遺伝子のうち 12 個がこの過程を使って編集されています。そのような遺伝子の 1 つが Cyb です。mRNA は実際には 2 回連続して編集されます。最初の編集では、mRNA 上の関連する配列は次のようになります。

mRNA 5' ああああああああGGCUUAACUUCAGGUUGU 3'

3' 末端は、塩基対合（いくつかの G/U ペアが使用される）によって gRNA（この場合は gCyb-I gRNA）を固定するために使用されます。5' 末端は完全に一致しないため、3 つの特定のエンドヌクレアーゼの 1 つがミスマッチ サイトで mRNA を切断します。

gRNA 3' ああああああああああああああああああああああああああああああああグウカグア 5'
mRNA 5' AA AGAAAA AGGC UUUAACUUCAGGUUGU 3'

mRNA は、各編集部位に U を連続して追加することで「修復」され、次の配列が得られます。

gRNA 3' ああああああああああああああああああああああああああああああああグウカグア 5'
mRNA 5' ううううううううがああああううううぐうぐううううううううううぐうぐ 3'

この遺伝子には重複するgRNA編集部位が2つあります。このセクションの5'末端は別のgRNA（gCyb-II gRNA）の3'アンカーです。^[9]

細菌や古細菌などの原核生物は、適応免疫システムとしてCRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) とそれに関連する Cas 酵素を使用しています。原核生物がファージに感染し、攻撃をかわすと、特定の Cas 酵素がファージ DNA (または RNA) を切断し、その断片を CRISPR 配列の間隔に組み込みます。保存されたこれらのセグメントは、将来のウイルス攻撃時に認識され、Cas 酵素はこれらのセグメントの RNA コピーと関連する CRISPR 配列を gRNA として使用して、外来配列を識別して中和することができます。^{[20] [21] [22]}

ガイドRNAは、単純なワトソン-クリック塩基対形成によって相補配列を標的とする。^[23]タイプII CRISPR/casシステムでは、sgRNAがCas酵素に指示を出し、ゲノム内の特定の領域を標的としてDNAを切断する。sgRNAは、CRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化crRNA（tracrRNA）という2つのRNA分子を人工的に組み合わせたものである。crRNA成分は標的特異的DNA領域に結合する役割を担い、tracrRNA成分はCas9エンドヌクレアーゼ活性の活性化を担う。これら2つの成分は短いテトラループ構造で連結され、sgRNAが形成される。tracrRNAは、ステムループ構造を形成する塩基対で構成されており、エンドヌクレアーゼ酵素への結合を可能にする。CRISPR遺伝子座の転写によってcrRNAが生成され、これには通常18～20塩基対（bp）の長さの反復配列に挟まれたスペーサー領域が含まれる。このcrRNAはCas9エンドヌクレアーゼをDNA上の相補的標的領域に誘導し、そこでDNAを切断してエフェクター複合体と呼ばれるものを形成する。sgRNA内のcrRNA配列の改変により結合位置を変更できるため、異なるDNA領域を正確に標的とすることができ、実質的にゲノム編集のためのプログラム可能なシステムとなる。^{[24] [25] [26]}

CRISPR-Cas9 の標的特異性は、gRNA の 5' 末端にある 20 ヌクレオチド (nt) の配列によって決まります。目的の標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) の前になければなりません。PAM は、通常 2～6 塩基対の長さの短い DNA 配列で、CRISPR-Cas9 などの CRISPR システムによって切断される DNA 領域の後に続きます。PAM は Cas ヌクレアーゼによる切断に必要であり、通常は切断部位から 3～4 ヌクレオチド下流に位置します。gRNA が標的と塩基対を形成すると、Cas9 は PAM の約 3 ヌクレオチド上流で二本鎖切断を引き起こします。^{[27] [28]}

ガイド配列の最適なGC含有量は50%以上であるべきである。GC含有量が高いほどRNA-DNA二重鎖の安定性が高まり、オフターゲットハイブリダイゼーションが減少する。ガイド配列の長さは通常20bpであるが、17～24bpの範囲であることもある。配列が長いほどオフターゲット効果は最小限に抑えられる。17bpより短いガイド配列は複数の遺伝子座を標的にするリスクがある。^{[29] [30] [24]}

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 は、遺伝子編集や遺伝子治療に使用される技術です。Cas は、ガイド RNA によって指示された特定の場所で DNA を切断するエンドヌクレアーゼ酵素です。これは、二本鎖修復経路に応じて遺伝子ノックアウトまたはノックインを導入できるターゲット固有の技術です。証拠によると、in vitro と in vivo の両方で、tracrRNA は Cas9 がターゲット DNA 配列に結合するために必要です。CRISPR-Cas9 システムは、3 つの主な段階で構成されています。最初の段階では、ゲノム配列に外来 DNA スペーサーを追加することにより、CRISPR 遺伝子座領域の塩基を拡張します。cas1 や cas2 などのタンパク質は、新しいスペーサーを見つけるのに役立ちます。次の段階では、CRISPR の転写が行われます。pre-crRNA (前駆体 CRISPR RNA) は、CRISPR リピート スペーサー アレイの転写によって発現されます。さらに修飾すると、pre-crRNAは単一のスペーサーで挟まれた領域に変換され、短いcrRNAを形成します。RNA成熟プロセスはタイプIとIIIで似ていますが、タイプIIでは異なります。第3段階では、cas9タンパク質が結合し、DNAセグメントを切断するように指示します。Cas9タンパク質は、crRNAとtracrRNAの結合型に結合してエフェクター複合体を形成します。これは、エンドヌクレアーゼ活性を指示するcas9タンパク質のガイドRNAとして機能します。^{[31] [2] [3]}

遺伝子制御の重要な方法の1つはRNA変異誘発であり、gRNAの助けを借りてRNA編集によって導入することができる。^[32]ガイドRNAは特定の標的部位でアデノシンをイノシンに置き換え、遺伝コードを変更する。^[33]アデノシンデアミナーゼはRNAに作用し、コドンやさまざまなタンパク質機能を変更することで転写後修飾をもたらす。ガイドRNAは小さな核小体RNAであり、リボタンパク質とともに、rRNAのリボメチル化やプレリボソームRNAへの擬似ウリジンの導入などの細胞内RNA修飾を行う。^[34]ガイドRNAはアンチセンスRNA配列に結合し、RNA修飾を制御する。標的RNA配列として一般的に使用される小さな干渉RNA（siRNA）とマイクロRNA（miRNA）は、サイズが小さいため修飾が比較的導入しやすいことが観察されている。^[35]

• CRISPR遺伝子編集
• CRISPR/Casツール
• siRNA の
• 遺伝子ノックアウト
• プロトスペーサー隣接モチーフ

• ガイド RNA によるウリジン挿入 RNA 編集 (in vitro)http://www.jbc.org/content/272/7/4212.full
• Blum, Beat; Simpson, Larry (1990)。「キネトプラスチドミトコンドリアのガイドRNAには、事前編集領域の認識に関与する非コード化3′オリゴ(U)テールがある」。Cell . 62 (2): 391–397. doi :10.1016/0092-8674 ( 90)90375-O. PMID  1695552. S2CID  2181338.
• Kurata, Morito; Wolf, Natalie K.; Lahr, Walker S.; Weg, Madison T.; Kluesner, Mitchell G.; Lee, Samantha; Hui, Kai; Shiraiwa, Masano; Webber, Beau R.; Moriarity, Branden S. (2018). 「CRISPR/Cas9 gRNAアレイを用いた高度に多重化されたゲノムエンジニアリング」. PLOS ONE . 13 (9): e0198714. Bibcode :2018PLoSO..1398714K. doi : 10.1371/journal.pone.0198714 . PMC  6141065 . PMID  30222773.
• Khan, Fehad J.; Yuen, Garmen; Luo, Ji (2019). 「単純なcrRNA:tracrRNA共トランスフェクションによる多重CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウト」. Cell & Bioscience . 9:41 . doi : 10.1186/s13578-019-0304-0 . PMC  6528186. PMID  31139343 .
• 西増 宏; 濡木 修 (2017). 「CRISPR RNA誘導エフェクターヌクレアーゼの構造とメカニズム」Current Opinion in Structural Biology . 43 : 68–78. doi : 10.1016/j.sbi.2016.11.013 . PMID  27912110.
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