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遺伝子ノックアウト（遺伝子欠失または遺伝子不活性化とも呼ばれる）は、生物のゲノム内の特定の遺伝子を標的として除去または不活性化する、広く用いられている遺伝子工学技術である。これは、相同組換え、CRISPR-Cas9、TALENなど、さまざまな方法で行うことができる。
遺伝子ノックアウトの主な利点の1つは、研究者が特定の遺伝子の機能を生体内で研究し、正常な発生や生理機能、そして疾患の病理におけるその遺伝子の役割を理解できることである。ノックアウトされた遺伝子を持つ生物の表現型を研究することで、研究者はその遺伝子が関与する生物学的プロセスについての知見を得ることができる。
遺伝子ノックアウトには、完全ノックアウトと条件付きノックアウトの2種類があります。完全ノックアウトは遺伝子を永久的に不活性化するのに対し、条件付きノックアウトは特定の時期や組織において遺伝子のオンオフを切り替えることができます。条件付きノックアウトは、発生過程の研究や、特定の細胞型や組織における遺伝子の役割を理解する上で特に有用です。
遺伝子ノックアウトは、細菌、酵母、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、マウスなど、さまざまな生物で広く利用されている。マウスでは、遺伝子ノックアウトは、発生、生理機能、がん研究における特定の遺伝子の機能を研究するために一般的に用いられている。
マウスモデルにおける遺伝子ノックアウトの利用は、ヒト疾患の研究において特に有用である。例えば、マウスの遺伝子ノックアウトは、がん、神経疾患、免疫疾患、代謝性疾患における特定の遺伝子の役割を研究するために用いられてきた。
しかし、遺伝子ノックアウトにもいくつかの限界がある。例えば、単一の遺伝子の欠損は遺伝性疾患の影響を完全に再現するとは限らず、ノックアウトによって他の遺伝子や経路に意図しない影響が生じる可能性がある。さらに、マウスのゲノムはヒトのゲノムと同一ではなく、マウスの生理機能はヒトの生理機能とは異なるため、遺伝子ノックアウトは必ずしもヒト疾患の良いモデルとはならない。
KO法は、基本的に遺伝子ノックイン法の反対です。生物において2つの遺伝子を同時にノックアウトすることをダブルノックアウト（DKO ）といいます。同様に、3つまたは4つの遺伝子をノックアウトする場合は、それぞれトリプルノックアウト（TKO）およびクアドラプルノックアウト（QKO ）という用語が用いられます。ただし、ヘテロ接合型KOとホモ接合型KOを区別する必要があります。前者の場合、2つの遺伝子コピー（対立遺伝子）のうち1つだけがノックアウトされ、後者の場合、両方ともノックアウトされます。
ノックアウトはさまざまな技術によって実現されます。当初は、自然発生的な突然変異が特定され、その後、DNAシーケンスやその他の方法によって遺伝子の喪失または不活性化を確立する必要がありました。[ 1 ]
突然変異による遺伝子ノックアウトは、細菌で一般的に行われている。大腸菌におけるこの技術の初期の例は、1989年にHamiltonらによって発表された[ 2 ] 。この実験では、2つの連続した組換えを使用して遺伝子を削除した。この研究は、細菌で機能的な遺伝子を除去または置換することの実現可能性を確立した。この方法はその後、他の生物、特にマウスなどの実験動物向けに開発された。ノックアウトマウスは、疾患に重要な意味を持つ可能性のあるヒトの相同遺伝子を研究するためによく使用される。ノックアウトマウスを使用した研究の例としては、中国漢民族における突然原因不明夜間死亡症候群（SUNDS）およびブルガダ症候群におけるXirpタンパク質の役割の調査がある[ 3 ] 。
遺伝子ノックアウト研究には、遺伝子サイレンシングとしても知られる、より新しい手法であるRNA干渉（RNAi）が普及している。RNA干渉（RNAi）では、特定の遺伝子のメッセンジャーRNAが、低分子干渉RNA（siRNA）または短鎖ヘアピンRNA（shRNA）を使用して不活性化される。これにより、遺伝子の発現が効果的に停止する。bcl -2やp53などの癌遺伝子、神経疾患、遺伝性疾患、ウイルス感染症に関連する遺伝子はすべて、RNA干渉（RNAi）を利用した遺伝子サイレンシングの標的となっている。[ 4 ]
相同組換えは、互いに同一の塩基配列領域が広範囲に及ぶ2本のDNA鎖間で遺伝子が交換される現象です。真核生物、細菌、および一部のウイルスでは、相同組換えは自然に起こり、遺伝子工学において有用なツールとなっています。真核生物の減数分裂中に起こる相同組換えは、二本鎖DNA切断の修復に不可欠であり、染色体交叉中に遺伝情報が移動することを可能にすることで遺伝的多様性を促進します。細菌における主要なDNA修復機構である相同組換えは、水平遺伝子伝達とDNAへの変換によって獲得された遺伝物質の挿入を可能にします。ウイルスにおける相同組換えは、ウイルスの進化の過程に影響を与えます。遺伝子工学で使用される遺伝子ターゲティングの一種である相同組換えは、特定の遺伝子の機能についてより詳しく知るために、その遺伝子に人工的な変異を導入するものです。この方法は、標的遺伝子と類似した配列を持ち、標的遺伝子の上流と下流に同じ配列が挟まれた外来DNAを細胞に挿入するものです。細胞が類似した隣接領域を相同遺伝子として認識すると、複製中に標的遺伝子のDNAが外来DNA配列に置き換えられます。この置換によって標的遺伝子は「ノックアウト」されます。この技術を用いてマウスの胚性幹細胞の特定のアレルを標的にすることで、ノックアウトマウスを作製することが可能です。遺伝子ターゲティングの助けを借りて、数多くのマウス遺伝子が不活性化され、癌、糖尿病、心血管疾患、神経疾患など、さまざまなヒト疾患の数百種類の異なるマウスモデルが作製されました。マリオ・カペッキ、サー・マーティン・J・エバンス、オリバー・スミシーズは、マウス幹細胞における相同組換えに関する画期的な研究を行い、その成果により2007年のノーベル生理学・医学賞を共同受賞しました。[ 5 ]従来、相同組換えは遺伝子ノックアウトを引き起こす主な方法であった。この方法では、目的の変異を含むDNA構築物を作成する。ノックアウトの場合、通常、目的のノックアウト遺伝子の代わりに薬剤耐性マーカーが用いられる。[ 6 ]この構築物は、標的配列と少なくとも2kbの相同性を持つ。構築物は、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションによって幹細胞に導入できる。この方法は、細胞自身の修復機構を利用して、DNA構築物を既存のDNAに組み込む。その結果、遺伝子の配列が変化し、ほとんどの場合、遺伝子は翻訳される。翻訳されたとしても、機能しないタンパク質になってしまいます。しかし、相同組換えはDNA挿入の10 −2から10 −3しか占めていないため、これは非効率的なプロセスです。 [ 6 ] [ 7 ]多くの場合、構築物上の薬剤選択マーカーを使用して、組換えイベントが発生した細胞を選択します。
この遺伝子を欠損した幹細胞は、例えばマウスの初期胚に挿入することで、生体内で使用できる。結果として生じたキメラマウスの生殖細胞系列に遺伝子変化があれば、それが子孫に受け継がれる可能性がある。[ 6 ]
二倍体生物は、ほとんどの遺伝子に2つの対立遺伝子を持ち、同じ役割で協働する複数の関連遺伝子を持つ場合もあるため、標的遺伝子がすべてノックアウトされるまで、形質転換と選抜のサイクルが繰り返される。ホモ接合型ノックアウト動物を作出するには、選択的育種が必要となる場合がある。
現在、DNA配列を正確に標的として二本鎖切断を導入する3つの方法が用いられている。切断が起こると、細胞の修復機構は、切断された2つの末端を直接連結する非相同末端結合（NHEJ）によって、この二本鎖切断を修復しようとする。 [ 7 ]この修復は不完全な場合があり、そのため塩基対の挿入や欠失が生じ、フレームシフト変異を引き起こすことがある。これらの変異は、変異が発生した遺伝子を機能不全にし、その遺伝子のノックアウトを引き起こす。このプロセスは相同組換えよりも効率的であるため、二対立遺伝子ノックアウトの作成に容易に利用できる。[ 7 ]
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、DNA配列を正確に標的とすることができるDNA結合ドメインから構成されています。[ 7 ]各ジンクフィンガーは目的のDNA配列のコドンを認識できるため、特定の配列に結合するようにモジュール式に組み立てることができます。[ 9 ]これらの結合ドメインは、DNAに二本鎖切断（DSB）を引き起こすことができる制限エンドヌクレアーゼと結合しています。 [ 7 ]修復プロセスは、遺伝子の機能を破壊する突然変異を導入する可能性があります。[ 10 ]
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）も、DNA結合ドメインとDNAを切断できるヌクレアーゼを含んでいます。[ 11 ] DNA結合領域は、それぞれが目的の標的DNA配列の1塩基対を認識するアミノ酸リピートで構成されています。[ 9 ]この切断が遺伝子コード領域を標的とし、NHEJを介した修復によって挿入や欠失が導入されると、フレームシフト変異がしばしば発生し、遺伝子の機能が阻害されます。[ 11 ]
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）は、ゲノムを正確に編集できる遺伝子工学技術です。CRISPRの応用例の1つに遺伝子ノックアウトがあり、これは生物の特定の遺伝子を不活性化または「ノックアウト」するものです。[ 12 ]
CRISPRを用いた遺伝子ノックアウトのプロセスは、主に3つのステップから構成されます。まず、ゲノム内の特定の位置を標的とするガイドRNA（gRNA）を設計します。次に、gRNAとCas9酵素（分子ハサミとして作用する）を標的細胞に送達します。そして最後に、細胞がDNAの切断箇所を修復するのを待ちます。細胞が切断箇所を修復する際、切断された末端を再び結合させて機能しない遺伝子にするか、遺伝子の機能を阻害する突然変異を導入するかのいずれかになります。
この技術は、細菌、酵母、植物、動物など、さまざまな生物に適用でき、特定の遺伝子の欠損による影響を観察することで、その機能を研究することを可能にします。CRISPRを用いた遺伝子ノックアウトは、疾患の遺伝的基盤を理解し、新たな治療法を開発するための強力なツールです。
CRISPRベースの遺伝子ノックアウトは、他の遺伝子工学技術と同様に、生物に意図しない、または有害な影響を与える可能性があるため、慎重に使用する必要があります。[ 9 ] [ 13 ]結合したCas9は、DNAの二本鎖切断を引き起こします。[ 9 ]亜鉛フィンガーやTALENと同じ原理に従い、これらの二本鎖切断を修復しようとすると、多くの場合、機能しない遺伝子をもたらすフレームシフト変異が発生します。[ 9 ]非侵襲的なCRISPR-Cas9技術は、マウスのうつ病や不安に関連する遺伝子のノックアウトに成功しており、血液脳関門を通過して遺伝子改変を可能にする最初の成功例となっています。[ 14 ]
遺伝子ノックインは遺伝子ノックアウトと似ているが、遺伝子を削除するのではなく、別の遺伝子に置き換える点が異なる。
条件付き遺伝子ノックアウトは、組織特異的な方法で組織内の遺伝子を欠失させることを可能にする。ヌル変異が胚の死につながる場合、または特定の組織や細胞型に特に関心がある場合、遺伝子ノックアウトの代わりにこれが必要となる。 [ 15 ]これは、遺伝子の周囲にloxPサイトと呼ばれる短い配列を導入することによって行われる。これらの配列は、ノックアウトと同じメカニズムで生殖細胞系列に導入される。この生殖細胞系列は、これらの配列を認識し、それらを組み換え、これらのサイトに挟まれた遺伝子を欠失させるウイルス酵素であるCreリコンビナーゼを含む別の生殖細胞系列と交配することができる。[ 16 ]その後、他のリコンビナーゼが作られ、条件付きノックアウト実験で使用されている。[ 17 ]
ノックアウトは主に、ノックアウト生物を同様の遺伝的背景を持つ野生型と比較することによって、特定の遺伝子またはDNA領域の役割を理解するために使用されます。[ 18 ]
ノックアウト生物は、特定のノックアウトを使用して特定の生物学的プロセスや欠陥を標的にしたり、 Saccharomyces cerevisiaeのようにゲノム全体にわたるノックアウト生物のライブラリを使用して薬剤の作用機序を理解したりするために、薬剤開発におけるスクリーニングツールとしても使用されます。[ 19 ]