遺伝子銃

遺伝子工学において、遺伝子銃またはバイオリスティック粒子送達システムは、外来DNA（トランスジーン）、RNA、またはタンパク質を細胞に送達するために使用される装置です。重金属粒子を目的の遺伝子でコーティングし、これらの微小粒子を機械力で細胞に発射することにより、目的の遺伝情報を目的の細胞に導入することができます。このような微小粒子によるDNA送達に関わる技術は、しばしば「バイオリスティック」、すなわち「生物学的弾道学」の略と呼ばれます。^{[ 1 ] [ 2 ]}

この装置はほぼあらゆる種類の細胞を形質転換することができ、核の形質転換に限定されず、色素体やミトコンドリアなどの細胞小器官も形質転換することができる。^{[ 3 ]}

遺伝子銃は元々、高密度のタングステン粒子を発射するように改造されたクロスマンのエアピストルでした。これは、1983年から1986年の間に、コーネル大学のジョン・C・サンフォード、エド・ウルフ、ネルソン・アレン^{[ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}とデュポンのテッド・クラインによって発明されました。当初の標的はタマネギ（細胞サイズが大きいことから選ばれた）で、この装置は、DNA転写が適切に挿入された場合に信号を伝達するマーカー遺伝子でコーティングされた粒子を投与するために使用されました。 ^{[ 7 ]}タマネギ細胞内でマーカー遺伝子の発現が観察されたことで、遺伝子形質転換が実証されました。

ネルソン・アレンが製作した初期の特注遺伝子銃は、22口径の釘打ち銃用カートリッジを使用してポリエチレン製の円筒（弾丸）を22口径のダグラス銃身から発射した。遺伝物質をコーティングしたタングステン粉末の液滴を弾丸に付け、下のペトリ皿に撃ち込んだ。弾丸はペトリ皿の下の円盤に溶着し、遺伝物質はドーナツ状にサンプルに噴射され、サンプルの中央部は破壊され、周囲には良好な形質転換の輪が形成された。この銃は真空ポンプに接続され、発射中は真空状態に置かれた。初期の設計は、ラムジー・ルーミス社（当時ニューヨーク州イサカのメクレンバーグ・ロードにあった地元の機械工場）によって限定的に生産された。

バイオリスティクス社は、非爆発性推進剤としてヘリウムを使用することや、サンプル組織への損傷を最小限に抑えるためのマルチディスク衝突送達機構などの改良を加えた改良型デバイスの製造および販売権をデュポン社に売却した。遺伝物質の送達には、金や銀などの他の重金属も使用されており、タングステン製の発射体キャリアと比較して細胞毒性が低いため、金が好まれている。^{[ 8 ]}

バイオリスティック形質転換は、DNA構築物として知られる機能的なDNA断片を標的細胞に組み込むことを伴う。遺伝子構築物は、標的生物内での適切な発現に必要なすべての調節要素を含むDNAカセットである。^{[ 9 ]}遺伝子構築物の設計は、形質転換手順の望ましい結果に応じて異なる場合があるが、すべての構築物は通常、プロモーター配列、ターミネーター配列、目的遺伝子、およびレポーター遺伝子の組み合わせを含む。

プロモーター

プロモーターは遺伝子発現の位置と大きさを制御し、遺伝子の「ハンドルとアクセル」として機能します。^{[ 9 ]}プロモーターはDNA構築物において目的遺伝子の前に配置され、実験室での設計によって変更することで、トランスジーンの発現を微調整できます。カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターは、植物内で強力な構成的遺伝子発現をもたらす、一般的に使用されているプロモーターの一例です。^{[ 10 ]}

ターミネーター

ターミネーター配列は適切な遺伝子発現に必要であり、DNA構築物内の目的遺伝子のコード領域の後に配置される。バイオリスティック形質転換によく用いられるターミネーターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のNOSターミネーターである。遺伝子組み換え植物ではこのターミネーターの使用頻度が高いため、無許可の遺伝子組み換え作物を監視するために、食品供給におけるその存在を検出する戦略が開発されている。^{[ 11 ]}

レポーター遺伝子

選択マーカーをコードする遺伝子は、DNA構築物内の一般的な要素であり、適切に形質転換された細胞を選択するために使用されます。選択される選択マーカーは、形質転換される種によって異なりますが、通常は、カナマイシン、ハイグロマイシンB、グリホサートなどの特定の除草剤や抗生物質に対する解毒能力を細胞に与える遺伝子です^{[ 9 ]}。^{[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]}

追加要素

DNA構築物のオプションの構成要素には、標的ゲノムから構築物を制御して除去できるcre-lox配列などの要素が含まれる。 ^{[ 15 ]}このような要素は、構築物の開発者によって、目的の主要遺伝子と並んで特殊な機能を果たすように選択される。

遺伝子銃は主に植物細胞に用いられているが、人間や他の動物にも大きな応用可能性を秘めている。

バイオリスティクスは、遺伝子改変の汎用性の高い方法であることが証明されており、一般的には、穀物などの形質転換抵抗性作物の遺伝子操作に好まれています。特に、Btトウモロコシはバイオリスティクスの産物です。^{[ 9 ]}プラスチド形質転換は、ベクターを葉緑体に標的化して安定的に発現させることが難しいアグロバクテリウム媒介形質転換などの他の現在の技術と比較して、粒子銃法で大きな成功を収めています。 ^{[ 9 ] [ 18 ]}さらに、遺伝子銃で挿入されたトランスジーンを葉緑体がサイレンシングするという報告はありません。^{[ 19 ]}また、熟練した技術者は、遺伝子銃を1回発射するだけで、特定の種で2つの形質転換生物を生成できます。^{[ 18 ]}この技術は、特定の組織をその場で改変することさえ可能にしましたが、これは多数の細胞を損傷し、組織のすべての細胞ではなく、一部の細胞のみを形質転換する可能性が高いです。 ^{[ 20 ]}

バイオリスティクスは、標的細胞にランダムにDNAを導入します。そのため、DNAは、核、ミトコンドリア、プラスミド、その他のゲノムなど、細胞内に存在するあらゆるゲノムに、任意の組み合わせで変換される可能性がありますが、適切な構築設計によってこれを軽減できます。複数のDNA構築テンプレートの送達と統合は十分に可能であり、その結果、挿入された遺伝子の発現レベルとコピー数が変動する可能性があります。^{[ 9 ]}これは、構築物が他の構築物から遺伝物質を与えたり受け取ったりする能力によるもので、一部の構築物はトランスジーンを持たず、他の構築物は複数のコピーを持つことになります。挿入されたコピーの数は、挿入された構築物が持つトランスジーンのコピー数と、挿入されたコピー数の両方に依存します。^{[ 9 ]}また、真核生物の構築物は相同組換えではなく非相同組換え（類似の遺伝子配列なしにトランスジーンがゲノムに組み込まれるプロセス）に依存しているため、トランスジーンがゲノム編集試薬とともに送達されない限り、ゲノム内の特定の場所に標的化することはできません。 ^{[ 9 ]}

• O'Brien, J; Holt, M; Whiteside, G; Lummis, SC; Hastings, MH (2001). "携帯型遺伝子銃の改良：器官型神経組織のin vitroバイオリスティック形質転換の改善" . Journal of Neuroscience Methods . 112 (1): 57– 64. doi : 10.1016/S0165-0270(01)00457-5 . PMID 11640958 . S2CID 30561105 .  

• ジョン・オブライエンが贈る…バイオリスティクスに関する詳しい情報は、ジーン・ガン・バレルズをご覧ください。