プラスミド

プラスミドは細胞内の小さな染色体外DNA分子であり、染色体DNAから物理的に分離されており、独立して複製することができます。細菌では小さな環状の二本鎖DNA分子として最も一般的に見られますが、古細菌や真核生物にもプラスミドが存在することがあります。^{[1] [2]プラスミドは}抗生物質耐性などの有用な遺伝子を持っていることがよくあります。染色体は大きく、通常の条件下で生きるために必要な遺伝情報をすべて含んでいますが、プラスミドは通常は非常に小さく、特別な状況のための追加の遺伝子を含んでいます。

人工プラスミドは分子クローニングのベクターとして広く使用されており、宿主生物内で組み換えDNA配列の複製を促進する役割を果たしている。実験室では、プラスミドは形質転換によって細胞に導入されることがある。合成プラスミドはインターネットで入手できる。^{[3] [4] [5]}

プラスミドはレプリコン、つまり適切な宿主内で自律的に複製できる DNA の単位であると考えられている。しかし、ウイルスと同様に、プラスミドは一般に生命としては分類されない。^[6]プラスミドは、ある細菌から別の細菌（別の種のものも含む）に、主に接合を介して伝わる。^[7]この宿主間の遺伝物質の移動は、水平遺伝子移動の 1 つのメカニズムであり、プラスミドはモビロームの一部であると考えられている。カプシドと呼ばれる保護タンパク質の殻で遺伝物質を包むウイルスとは異なり、プラスミドは「裸の」 DNA であり、新しい宿主に伝達するために遺伝物質を包むのに必要な遺伝子をコードしていない。しかし、一部のクラスのプラスミドは、自身の伝達に必要な接合性の「性」ピルスをコードしている。プラスミドのサイズは 1 kbp から 400 kbpを超えるものまで様々であり、^[8]単一細胞内の同一のプラスミドの数は 1 から数千に及ぶことがある。

プラスミドという用語は、1952年にアメリカの分子生物学者 ジョシュア・レーダーバーグによって「染色体外の遺伝決定因子」を指すために導入されました。^[9]この用語の初期の用法には、複製サイクルの少なくとも一部で染色体外に存在する細菌の遺伝物質が含まれていましたが、その説明には細菌ウイルスも含まれていたため、プラスミドの概念は時間の経過とともに、自律的に複製する遺伝要素を指すように洗練されました。^[10] その後、1968年に、プラスミドという用語を染色体外遺伝要素の用語として採用することが決定され、^[11]ウイルスと区別するために、定義は染色体の外側に排他的または主に存在し、自律的に複製できる遺伝要素に狭められました。^[10]

プラスミドが細胞内で独立して複製するためには、複製起点として機能できる DNA 領域を持たなければならない。自己複製単位、この場合のプラスミドはレプリコンと呼ばれる。典型的な細菌レプリコンは、プラスミド特異的複製開始タンパク質 (Rep) の遺伝子、イテロンと呼ばれる繰り返し単位、DnaAボックス、隣接する AT に富む領域など、いくつかの要素から構成される。^{[10]より小さなプラスミドは宿主の複製酵素を利用して自身のコピーを作成するが、より大きなプラスミドはそれらのプラスミドの複製に特異的な遺伝子を持っている場合がある。いくつかの種類のプラスミドは宿主染色体に挿入することもでき、これらの統合プラスミドは}原核生物ではエピソームと呼ばれることがある。^[12]

プラスミドは、ほとんどの場合、少なくとも 1 つの遺伝子を持っています。プラスミドが運ぶ遺伝子の多くは、宿主細胞にとって有益です。たとえば、宿主細胞が、本来であれば致命的であったり、成長が制限されたりする環境で生き残れるようにするなどです。これらの遺伝子の中には、抗生物質耐性や重金属耐性などの形質をコードするものもあれば、細菌が宿主に定着してその防御を克服できるようにする毒性因子を生成するものや、細菌が特定の栄養素を利用できるようにするための特定の代謝機能を持つもの（難分解性または有毒な有機化合物を分解する能力など）もあります。^{[13]プラスミドは、細菌に}窒素固定能力を与えることもできます。ただし、一部のプラスミドは、宿主細胞の表現型に目立った影響を及ぼさなかったり、宿主細胞への利点が判断できなかったりするため、これらのプラスミドは隠れたプラスミドと呼ばれています。^[14]

天然に存在するプラスミドは、その物理的特性が大きく異なります。その大きさは、1キロ塩基対（kbp）未満の非常に小さなミニプラスミドから、数メガ塩基対（Mbp）の非常に大きなメガプラスミドまであります。上限では、メガプラスミドとミニ染色体の間にほとんど違いはありません。プラスミドは一般的に環状ですが、線状プラスミドの例も知られています。これらの線状プラスミドは、末端を複製するために特殊なメカニズムを必要とします。^[10]

プラスミドは、1 個から数百個まで、さまざまな数で個々の細胞内に存在する可能性がある。 単一細胞内に存在するプラスミドの通常のコピー数は、プラスミドコピー数と呼ばれ、複製開始がどのように制御されているかと分子のサイズによって決まる。 より大きなプラスミドは、コピー数が低くなる傾向がある。^[12]各細菌に 1 つまたは数個のコピーとしてのみ存在する低コピー数のプラスミドは、細胞分裂時に、分離細菌の 1 つで失われる危険がある。 このような単一コピーのプラスミドには、両方の娘細胞にコピーを積極的に分配しようとするシステムがある。 parABS システムやparMRC システムなどのこれらのシステムは、プラスミドの分配システムまたは分配機能と呼ばれることが多い。 ^[15]

線状プラスミドは、ロドコッカス・ファシアン（Rhodococcus fascians）を除いて、植物病原体の中では知られていない。^[16]

プラスミドはいくつかの方法で分類することができます。プラスミドは、接合性プラスミドと非接合性プラスミドに大まかに分類できます。接合性プラスミドには、異なる細胞間の有性接合を促進する一連の転移遺伝子が含まれています。 ^[12]接合の複雑なプロセスでは、プラスミドは、いくつかの転移遺伝子によってコードされている性線毛を介して、ある細菌から別の細菌に転移することがあります(図を参照)。^[17]非接合性プラスミドは接合を開始することができないため、接合性プラスミドの助けを借りてのみ転移できます。中間クラスのプラスミドは可動性があり、転移に必要な遺伝子のサブセットのみを運びます。それらは接合性プラスミドに寄生することができ、その存在下でのみ高頻度で転移します。^[要出典]

プラスミドは不適合性グループに分類することもできる。微生物は異なるタイプのプラスミドを保有することができるが、異なるプラスミドは適合性がある場合に限り、単一の細菌細胞内に存在することができる。2つのプラスミドが適合しない場合、どちらか一方が細胞から急速に失われる。したがって、異なるプラスミドは、共存できるかどうかに応じて、異なる不適合性グループに割り当てられる可能性がある。不適合なプラスミド（同じ不適合性グループに属する）は通常、同じ複製または分割メカニズムを共有しているため、単一の細胞内に一緒に保持することはできない。^{[18] [19]}

プラスミドを分類する別の方法は機能によるものです。主なクラスは次の 5 つです。

• 生殖能Fプラスミドにはtra遺伝子が含まれており、接合が可能で、性線毛の発現をもたらします。
• 耐性 (R) プラスミドは、抗生物質や抗菌剤に対する耐性をもたらす遺伝子を含んでいます。歴史的には、プラスミドの性質が理解される前は R 因子として知られていました。
• 他の細菌を殺すことができるタンパク質であるバクテリオシンをコードする遺伝子を含むColプラスミド。
• トルエンやサリチル酸などの異常な物質の消化を可能にする分解プラスミド。
• 細菌を病原体に変える毒性プラスミド。例：アグロバクテリウム・ツメファシエンスのTiプラスミド

プラスミドはこれらの機能グループの複数に属することができます。

プラスミドのほとんどは二本鎖DNA分子ですが、一部は一本鎖DNA、または主に二本鎖RNAで構成されています。RNAプラスミドは非感染性の染色体外線状RNAレプリコンであり、カプシド化されているものとされていないものの両方があり、藻類から陸上植物まで、菌類やさまざまな植物で発見されています。しかし、多くの場合、RNAプラスミドをRNAウイルスやその他の感染性RNAと明確に区​​別することは困難または不可能です。^[20]

クロミドは染色体とプラスミドの境界に存在する要素で、2009年までに配列が決定された細菌種の約10％に見られる。これらの要素はコア遺伝子を持ち、染色体と同様のコドン使用法を持ちながら、低コピー数のRepABCなどのプラスミド型の複製メカニズムを使用する。その結果、過去にはミニ染色体やメガプラスミドなどさまざまな分類がなされてきた。^[21]ビブリオでは、細菌は保存されたゲノムサイズ比によって染色体とクロミドの複製を同期させる。^[22]

人工的に構築されたプラスミドは、遺伝子工学のベクターとして使用されることがあります。これらのプラスミドは遺伝学やバイオテクノロジーの研究室で重要なツールとして機能し、特定の遺伝子をクローン化して増幅（多くのコピーを作成）したり、発現させたりするためによく使用されます。 ^[23]このような用途に使用できる多種多様なプラスミドが市販されています。複製される遺伝子は通常、使用するために必要ないくつかの機能を備えたプラスミドに挿入されます。これらには、特定の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子（細菌株にはアンピシリンが最もよく使用されます）、細菌細胞がプラスミド DNA を複製できるようにする複製起点、およびクローニングに適した部位（マルチクローニングサイトと呼ばれる）が含まれます。

DNA構造不安定性は、遺伝物質の予期せぬ再配置、喪失、または獲得に至る一連の自発的なイベントとして定義できます。このようなイベントは、可動要素の転位または非標準（非B）構造などの不安定要素の存在によって引き起こされることがよくあります。細菌バックボーンに関連するアクセサリ領域は、さまざまな構造不安定性現象に関与している可能性があります。遺伝的不安定性のよく知られた触媒には、直接、逆方向、およびタンデムリピートがあり、これらは市販のクローニングベクターや発現ベクターの多くで顕著であることが知られています。^{[24]挿入配列は、}欠失や再配置、近隣の遺伝子発現の活性化、ダウンレギュレーション、または不活性化につながるため、プラスミドの機能と収量に重大な影響を与える可能性があります。^{[25]したがって、余分な}非コードバックボーン配列を削減または完全に排除すると、そのようなイベントが発生する傾向が大幅に減少し、結果的にプラスミドの全体的な組換え能力も低下することになる。^{[26] [27]}

プラスミドは、細菌のクローニングベクターとして最も一般的に使用されている。^[28]これらのクローニングベクターには、DNA断片を挿入できる部位、例えば、 DNA断片を連結できるいくつかの一般的に使用される制限部位を持つ多重クローニング部位またはポリリンカーが含まれている。目的の遺伝子が挿入された後、プラスミドは形質転換と呼ばれるプロセスによって細菌に導入される。これらのプラスミドには選択マーカー（通常は抗生物質耐性遺伝子）が含まれており、細菌に特定の抗生物質を含む選択増殖培地で生存および増殖する能力を与える。形質転換後の細胞は選択培地にさらされ、プラスミドを含む細胞のみが生存できる。このように、抗生物質はフィルターとして機能し、プラスミドDNAを含む細菌のみを選択する。ベクターには、クローン化された挿入物を含むプラスミドの選択を容易にするための他のマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含まれている場合がある。その後、プラスミドを含む細菌を大量に増殖させて収穫し、さまざまなプラスミド調製方法を使用して目的のプラスミドを分離することができる。

プラスミドクローニングベクターは、通常、15 kbpまでのDNA断片のクローニングに使用されます。^[29]より長いDNAをクローニングするには、溶原性遺伝子が削除されたラムダファージ、コスミド、細菌人工染色体、または酵母人工染色体が使用されます。

プラスミドのもう一つの主な用途は、大量のタンパク質を作ることです。この場合、研究者は目的の遺伝子を宿したプラスミドを含む細菌を培養します。細菌が抗生物質耐性を付与するためにタンパク質を生成するのと同じように、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を生成するように誘導することもできます。これは、例えばインスリンなど、遺伝子がコードするタンパク質を大量生産する安価で簡単な方法です。

プラスミドは、遺伝子治療における潜在的な治療法として遺伝子移入にも使用され、細胞に欠けているタンパク質を発現させる可能性があります。遺伝子治療のいくつかの形態では、ヒトゲノム内の事前に選択された染色体標的部位に治療遺伝子を挿入する必要があります。プラスミドベクターは、この目的に使用できる多くのアプローチの1つです。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、DNAゲノムに部位特異的な二重鎖切断を引き起こし、相同組換えを引き起こす方法を提供します。ZFNをコードするプラスミドは、細胞損傷、癌を引き起こす突然変異、または免疫反応を回避するために、治療遺伝子を特定の部位に送達するのに役立ちます。^[30]

プラスミドは歴史的に、ラットの胚性幹細胞を遺伝子操作してラットの遺伝性疾患モデルを作成するために使用されていました。プラスミドベースの技術の効率が限られていたため、より正確なヒト細胞モデルの作成には使用できませんでした。しかし、アデノ随伴ウイルスの組み換え技術とジンクフィンガーヌクレアーゼの発達により、新世代の同質遺伝子ヒト疾患モデルの作成が可能になりました。

エピソームという用語は、 1958年にフランソワ・ジャコブとエリー・ウォルマンによって、自律的に複製されるか染色体に組み込まれる可能性のある染色体外遺伝物質を指すために導入されました。^{[31] [32]}しかし、この用語が導入されて以来、その使用法は変化し、自律的に複製する染色体外DNAにはプラスミドという用語が好まれるようになりました。1968年にロンドンで開催されたシンポジウムでは、参加者の一部がエピソームという用語を廃止することを提案しましたが、意味を変えてこの用語を使い続けた人もいました。^{[33] [34]}

今日、一部の著者は、原核生物の文脈でエピソームを、染色体に組み込むことができるプラスミドを指すために使用しています。組み込みプラスミドは、複製され、複数の世代を通じて細胞内で安定して維持される場合がありますが、ある段階では、独立したプラスミド分子として存在するようになります。 ^{[35]真核生物の文脈では、}エピソームという用語は、核内で複製される可能性のある、統合されていない染色体外の閉環状DNA分子を意味するために使用されます。^{[36] [37]}ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポリオーマウイルスなどのウイルスは、この最も一般的な例ですが、一部はプラスミドです。他の例としては、人工的な遺伝子増幅中または病理学的プロセス（癌細胞の形質転換など）で発生する可能性がある二重微小染色体などの異常な染色体断片があります。真核生物のエピソームは、DNA が安定して維持され、宿主細胞とともに複製されるという点で、原核生物のプラスミドと同様に機能します。細胞質ウイルスのエピソーム (ポックスウイルス感染症など) も発生する可能性があります。ヘルペスウイルスなどの一部のエピソームは、バクテリオファージ(細菌ファージウイルス)と同様に、ローリングサークルメカニズムで複製します。他のエピソームは、双方向の複製メカニズム (シータ型プラスミド) によって複製します。いずれの場合も、エピソームは宿主細胞の染色体から物理的に分離されたままです。エプスタイン・バーウイルスやカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのいくつかの癌ウイルスは、癌細胞内で潜在的な、染色体が異なるエピソームとして維持され、癌細胞の増殖を促進する癌遺伝子を発現します。癌では、細胞が分裂すると、これらのエピソームが宿主の染色体とともに受動的に複製されます。これらのウイルスエピソームが溶解複製を開始して複数のウイルス粒子を生成すると、通常、宿主細胞を殺す 細胞内の自然免疫防御機構が活性化されます。

一部のプラスミドまたは微生物宿主には、大腸菌のプラスミドR1のhok/sok（宿主殺害/殺害抑制）システムのような依存性システムまたは分離後殺害システム（PSK）が含まれます。^[38]この変異体は、長寿命の毒と短寿命の解毒剤の両方を生成します。いくつかのタイプのプラスミド依存性システム（毒素/抗毒素、代謝ベース、ORTシステム）が文献に記載されており、^[39]バイオテクノロジー（発酵）またはバイオメディカル（ワクチン療法）の用途で使用されています。プラスミドのコピーを保持している娘細胞は生き残りますが、プラスミドを継承できなかった娘細胞は、親細胞からの毒が残っているため死ぬか、成長率が低下します。最終的に、全体的な生産性が向上する可能性があります。

対照的に、pUC18、pBR322、および派生ベクターなどのバイオテクノロジーで使用されるプラスミドには、毒素-抗毒素依存システムが含まれることはほとんどないため、プラスミドの損失を避けるために抗生物質の圧力下で維持する必要があります。

酵母は天然に様々なプラスミドを持っています。その中でも注目すべきは、2μmプラスミド（酵母の遺伝子工学によく使われる小さな環状プラスミド）と、キラー表現型の原因となるKluyveromyces lactis由来の線状pGKLプラスミドです。^[40]

その他のタイプのプラスミドは、多くの場合、酵母クローニングベクターに関連しており、次のようなものがあります。

• 酵母統合プラスミド (YIp) は、生存と複製のために宿主染色体への統合に依存する酵母ベクターであり、通常、単独遺伝子の機能性を研究する場合や遺伝子が有毒である場合に使用されます。ピリミジンヌクレオチド (T、C) の生合成に関連する酵素をコードする遺伝子 URA3 とも関連しています。
• 酵母複製プラスミド (YRp) は、複製起点を含む染色体 DNA 配列を輸送します。これらのプラスミドは出芽中に失われる可能性があるため、安定性が低くなります。

多くの高等植物のミトコンドリアには、プラスミドと考えられている自己複製する染色体外線状または環状DNA分子が含まれています。これらのサイズは0.7 kbから20 kbの範囲です。プラスミドは一般的に環状と線状の2つのカテゴリに分類されています。^[41]環状プラスミドは単離されており、さまざまな植物で発見されていますが、ソラマメとアカザのプラスミドが最も研究されており、複製のメカニズムがわかっています。環状プラスミドは、θ複製モデル（ソラマメの場合）とローリングサークル複製（ C.albumの場合）を使用して複製できます。^{[42]線状プラスミドは、} Beta vulgaris、Brassica napus、Zea maysなどの一部の植物種で特定されていますが、環状プラスミドよりもまれです。

これらのプラスミドの機能と起源は、ほとんどわかっていません。環状プラスミドは共通の祖先を持っていると示唆されており、ミトコンドリアプラスミドのいくつかの遺伝子は核DNAに対応しており、コンパートメント間の交換を示唆しています。一方、線状プラスミドは、ウイルスDNAや真菌プラスミドとインベルトロンなどの構造的類似性を共有しており、真菌プラスミドと同様にGC含有量も低いため、これらの観察から、これらの線状プラスミドはウイルス起源であるか、病原性真菌からの水平遺伝子伝達によって植物ミトコンドリアに到達したという仮説が立てられています。^{[41] [43]}

プラスミドはゲノムの残りの部分から簡単に分離して精製できるため、特定の配列を精製するためによく使用されます。ベクターとして使用したり、分子クローニングを行うには、プラスミドを分離する必要があることがよくあります。

細菌からプラスミドDNAを分離する方法には、ミニプレップからマキシプレップまたはバルクプレップまでいくつかあります。^[23]前者は、いくつかの細菌クローンのいずれかでプラスミドが正しいかどうかを迅速に調べるために使用できます。得られるのは不純なプラスミドDNAの少量で、制限酵素消化による分析やいくつかのクローニング技術には十分です。

後者では、はるかに大量の細菌懸濁液が培養され、そこからマキシプレップが実行されます。本質的には、これはスケールアップされたミニプレップに続いて追加の精製を行うものです。その結果、比較的大量 (数百マイクログラム) の非常に純粋なプラスミド DNA が得られます。

さまざまな規模、純度、自動化レベルでプラスミド抽出を実行するための市販キットが数多く作成されています。

プラスミド DNA は 5 つの構造のいずれかで現れ、電気泳動中にゲル内を (特定のサイズに対して) 異なる速度で移動します。構造は、電気泳動移動度 (特定の印加電圧に対する速度) の遅い順から速い順に以下にリストされています。

• ニック付きの開環状DNA では 1 本の鎖が切断されます。
• 緩和された環状DNA は、両方の鎖が切断されていない完全な状態ですが、酵素によって緩和されています(スーパーコイルが除去されています)。これは、ねじれた延長コードをほどいて緩和させ、その後コード自体に差し込むことでモデル化できます。
• 線状DNA には自由端があります。これは、両方の鎖が切断されているか、または DNA が生体内で線状であったためです。これは、それ自体に差し込まれていない電気延長コードでモデル化できます。
• 超らせん構造（または共有結合で閉じた環状構造）の DNA は、両方の鎖が切断されずに完全に無傷で、ねじれが組み合わさったコンパクトな形状になっています。これは、延長コードをねじってから、延長コード自体に差し込むことでモデル化できます
• スーパーコイル変性DNA はスーパーコイル DNAに似ていますが、不対領域があるため、ややコンパクトではありません。これは、プラスミド調製時の過度のアルカリ性によって発生する可能性があります。

小さな線状断片の移動速度は、低電圧では印加電圧に正比例します。電圧が高くなると、より大きな断片の移動速度は連続的に増加しますが、速度は異なります。したがって、電圧が増加するとゲルの解像度は低下します。

指定された低電圧では、小さな線状 DNA 断片の移動速度は、断片の長さの関数です。大きな線状断片 (約 20 kb 以上) は、長さに関係なく、一定の速度で移動します。これは、分子が「呼吸」し、分子の大部分が先端を追ってゲル マトリックスを通過するためです。制限酵素消化は、精製されたプラスミドの分析によく使用されます。これらの酵素は、特定の短い配列で DNA を特異的に分解します。結果として生じる線状断片は、ゲル電気泳動後に「バンド」を形成します。バンドをゲルから切り取り、ゲルを溶解して DNA 断片を放出することで、特定の断片を精製することができます。

スーパーコイル DNA は、その密な構造により、線状 DNA や開環状 DNA よりもゲル内をより速く移動します。

分子生物学の技術としてのプラスミドの使用は、バイオインフォマティクス ソフトウェアによってサポートされています。これらのプログラムは、プラスミドベクターのDNA配列を記録し、制限酵素の切断部位を予測し、操作を計画するのに役立ちます。プラスミドマップを処理するソフトウェアパッケージの例には、ApE、Clone Manager、GeneConstructionKit、Geneious、Genome Compiler、LabGenius、Lasergene、MacVector、pDraw32、Serial Cloner、VectorFriends、Vector NTI、WebDSVなどがあります。これらのソフトウェアは、ウェット実験を行う前に、実験全体をコンピューターで実行するのに役立ちます。^[44]

長年にわたり多くのプラスミドが作られ、研究者は非営利団体 Addgene や BCCM/LMBP などのプラスミド データベースにプラスミドを提供してきました。これらのデータベースから研究用のプラスミドを検索したりリクエストしたりできます。研究者はプラスミドの配列を NCBI データベースにアップロードすることもよくあり、そこから特定のプラスミドの配列を取得できます。

• 国際プラスミド生物学会およびその他可動性遺伝要素学会
• バイオテクノロジーとは何か
• プラスミドの歴史とタイムライン