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| CRISPR関連タンパク質12a | |
|---|---|
 アシダミノコッカス属 Cas12a PDB : 5B43 | |
| 識別子 | |
| シンボル | Cas12a |
| インタープロ | 著作権 |
Cas12a ( C RISPR- as関連タンパク質12a、以前はCpf1と呼ばれていました) は、一部の細菌や古細菌に見られるCRISPRシステムの必須コンポーネントを形成するRNA 誘導エンドヌクレアーゼです。自然環境では、Cas12a はウイルスやその他の外来可動性遺伝要素の遺伝物質を標的にして破壊し、それによって宿主細胞を感染から保護します。他の Cas 酵素と同様に、Cas12a は「ガイド」RNA ( crRNAまたはCR ISPR RNAと呼ばれる) に結合し、特定のプログラム可能な方法で DNA 配列にターゲットを定めます。宿主生物では、crRNA には Cas12a タンパク質によって認識される定常領域と、以前に細胞に感染した外来核酸 (ファージゲノムの一部など) と相補的な「スペーサー」領域が含まれています。[1]
Cas9や他のCasタンパク質と同様に、Cas12aのプログラム可能なDNA標的活性は、バイオテクノロジーや生物学研究の用途に有用なツールとなっている。crRNAのスペーサー配列を変更することで、研究者はCas12aを特定のDNA配列に標的化することができ、DNAの高度に標的化された変更が可能になる。[2] Cas12aは、単一のRuvCエンドヌクレアーゼ活性部位、5'プロトスペーサー隣接モチーフの優先、切断部位での平滑末端ではなく粘着末端の形成によってCas9と区別される。これらの違いやその他の違いにより、特定の用途にはより適している可能性がある[要出典] 。基礎研究での使用を超えて、CRISPR-Cas12aは遺伝性疾患の治療や遺伝子ドライブの実装にも応用できる可能性がある。[2]
説明
発見
CRISPR-Cas12aは、細菌の遺伝子配列の公開データベースを検索して有望なDNA断片を見つけることで発見されました。バイオインフォマティクスによるCRISPRシステムタンパク質としての識別、命名、および検出のための隠れマルコフモデル（HMM）は、2012年にTIGRFAMsタンパク質ファミリーデータベースのリリースで提供されました。Cas12aは多くの細菌種に出現します。ゲノム編集ツールとして開発された最終的なCas12aエンドヌクレアーゼは、それを保持することが知られている最初の16種のうちの1つから採取されました。[3] AcidaminococcusとLachnospiraceaeからの2つの候補酵素は、ヒト細胞で効率的なゲノム編集活性を示します。[2]
分類
CRISPR-Casシステムは2つのクラスに分けられます。クラスIでは、複数のCasタンパク質がcrRNAと結合して機能的なエンドヌクレアーゼを構築し、クラスIIでは、単一のCasエンドヌクレアーゼがcrRNAと結合します。クラスIIはさらにタイプII、タイプV、タイプVIシステムに分けられます。Cas12aはクラスII、タイプVのCRISPR-Casシステムとして識別されます。[4]
ネーミング
CRISPR（ Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ）の頭字語は、細菌や古細菌に見られる不変DNA配列を指し、Casタンパク質とそのcrRNAをコード化しています。Cas12aはもともとCRISPRの略称であるCpf1と、それが出現する2つの細菌属、PrevotellaとFrancisellaとして知られていました。Cas（C RISPR as sociated ）タンパク質の名前を配列相同性に対応するように広範に合理化した後、2015年に改名されました。[4]
構造
Cas12aタンパク質には、混合アルファ/ベータドメイン、Cas9のRuvCドメインに類似したRuvC様エンドヌクレアーゼドメイン（2つの非連続セグメント、RuvC-IとRuvC-IIに分割）、およびジンクフィンガー様ドメインが含まれています[5]。Cas9とは異なり、Cas12aにはHNHエンドヌクレアーゼドメインがなく、Cas12aのN末端領域にはCas9に見られるようなアルファヘリカル認識ローブがありません。[4]
Cas12a遺伝子座は、タイプIIシステムよりもタイプIおよびIIIに類似したCas1、Cas2、およびCas4タンパク質をコードします。データベース検索では、多くの細菌種にCas12aファミリータンパク質が豊富に存在することが示唆されています。[4]
また、Cas9とは異なり、Cas12aはtracrRNA（天然のCRISPRシステムではCasタンパク質に結合する前に別のcrRNAと塩基対を形成する必要がある）を必要とせず、代わりに単一のcrRNAに結合します。Cas12aとそのガイドRNAは両方とも、Cas9システムのタンパク質およびRNAコンポーネントよりも小さく、Cas12aのcrRNAはCas9で使用されるsgRNAの約半分の長さです。[6]この小型化により、Cas12aは、カプシドが小さいためにDNAパッケージング容量が限られているアデノ随伴ウイルス（AAV）を介した生体内送達などの用途により適しています。
Cas12a-crRNA複合体は、Cas9が標的とするGに富むPAMとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）5'-YTN-3' [7]（「Y」はピリミジン[8]、「N」は任意の核酸塩基）を識別して標的DNAまたはRNAを切断する。PAMの識別後、Cas12aは4または5ヌクレオチドのオーバーハングの粘着末端のようなDNA二本鎖切断を導入する。[5]
機構
CRISPR-Cas12aシステムは、Cas12a酵素とガイドRNAで構成されており、ガイドRNAは標的DNAを切断するために二重らせん上の正しい位置に複合体を見つけて配置します。CRISPR-Cas12aシステムの活動には3つの段階があります。[3]
- 適応: Cas1 および Cas2 タンパク質は、DNA の小さな断片を CRISPR アレイに適応させることを促進します。
- crRNA の形成: pre-cr-RNA の処理により成熟 crRNA が生成され、Cas タンパク質が誘導されます。
- 干渉: Cas12a は crRNA に結合してバイナリー複合体を形成し、標的 DNA 配列を識別して切断します。crRNA-Cas12a 複合体は、dsDNA で 3-6nt 5'プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM) を検索します。PAM が見つかると、タンパク質は dsDNA を局所的に変性させ、crRNA スペーサーと ssDNA プロトスペーサー間の相補性を検索します。十分な相補性により RuvC 活性が引き起こされ、RuvC 活性部位は非標的鎖を切断し、次に標的鎖を切断して、最終的に 5' ssDNA オーバーハング (シス切断) を伴う交互になった dsDNA 切断を生成します。[5] [9]
Cas9 対 Cas12a
Cas9は DNA を切断するのに2 つのRNA分子を必要とするが、Cas12a は 1 つしか必要としない。また、これらのタンパク質は DNA を異なる場所で切断するため、研究者は編集部位を選択する際により多くの選択肢を得ることができる。Cas9 は DNA 分子の両方の鎖を同じ位置で切断し、平滑末端を残す。Cas12a は一方の鎖をもう一方よりも長く残し、粘着末端を作成する。粘着末端は、DNA の非相同末端結合または相同修復中に平滑末端とは異なる特性を持つため、遺伝子挿入を試みる際には Cas9 と比較して Cas12a に一定の利点がある。[3] CRISPR-Cas9 システムは遺伝子を効率的に無効化できるが、遺伝子を挿入したりノックインを生成したりすることは困難である。[1] Cas12a はtracrRNA を欠き、T に富む PAM を利用し、ずらした DNA DSB を介して DNA を切断する。[6]
まとめると、Cas12aとCas9システムの重要な違いは、Cas12a: [10]
- さまざまな PAM を認識し、新しいターゲティングの可能性を実現します。
- Cas9 によって生成される平滑末端の代わりに 4 ～ 5 nt の長さの粘着末端を作成し、 NHEJまたは HDR中の遺伝子挿入の効率と特異性を高めます。
- ターゲット DNA を PAM からさらに離れた場所、Cas9 切断部位からさらに離れた場所で切断することで、DNA を切断する新たな可能性が生まれます。
起源
Cas12エンドヌクレアーゼは、最終的にはIS200/IS605ファミリートランスポゾンのTnpBエンドヌクレアーゼから進化したと考えられます。TnpBは、まだCRISPR免疫システムに「飼いならされ」ていませんが、それ自体がオメガRNAテンプレートシステムを使用してRNA誘導切断を実行できます。[11]
ツール
CRISPRを使用する場合、ガイドRNAの設計など、さまざまな側面が標的の効率と特異性に影響します。ガイドRNAの最適設計のための多くの設計モデルとCRISPR-Casソフトウェアツールが開発されています。これには、SgRNAデザイナー、CRISPRマルチターゲター、SSFinderが含まれます。[12]さらに、Cas12aタンパク質を検出するために使用できる市販の抗体が利用可能です。[13]
知的財産
CRISPR-Cas9は知的財産権紛争の対象となっているが、CRISPR-Cas12aには同様の問題はない。[2]
注記
参考文献
- ^ ab 「CRISPRベースの遺伝子工学がCasでキックを獲得」Meta Science News。2015年9月29日。2017年10月22日時点のオリジナルよりアーカイブ。2016年5月3日閲覧。
- ^ abcd 「Even CRISPR」。エコノミスト。ISSN 0013-0613 。2016年5月3日閲覧。
- ^ abc Ledford H (2015年10月). 「細菌が新たな遺伝子カッターを生み出す」. Nature . 526 (7571): 17. doi : 10.1038/nature.2015.18432 . PMID 26432219.
- ^ abcd Makarova KS、Wolf YI、Alkhnbashi OS、Costa F、Shah SA、Saunders SJ、et al. (2015年11月)。「CRISPR-Casシステムの最新の進化分類」。Nature Reviews 。微生物学。13 ( 11): 722–736。doi :10.1038/nrmicro3569。PMC 5426118。PMID 26411297。
- ^ abc Zetsche B、Gootenberg JS、Abudayyeh OO、Slaymaker IM、Makarova KS、Essletzbichler P、et al. (2015年10月). 「Cpf1はクラス2 CRISPR-Casシステムの単一のRNA誘導エンドヌクレアーゼです」. Cell . 163 (3): 759–771. doi :10.1016/j.cell.2015.09.038. PMC 4638220. PMID 26422227 .
- ^ ab 「Cpf1、次世代CRISPRゲノム編集のためにCas9に参入」。epigenie.com。2015年9月29日。 2016年5月3日閲覧。
- ^ Fonfara I、Richter H、Bratovič M、Le Rhun A、Charpentier E (2016 年 4 月)。「CRISPR 関連 DNA 切断酵素 Cpf1 は前駆体 CRISPR RNA も処理する」。Nature。532 ( 7600 ) : 517–521。Bibcode :2016Natur.532..517F。doi :10.1038/nature17945。PMID 27096362。S2CID 2271552 。
- ^ 「ヌクレオチドコード、アミノ酸コード、遺伝コード」。KEGG:京都遺伝子ゲノム百科事典。2014年7月15日。 2016年5月25日閲覧。
- ^ Cofsky JC、Karandur D、Huang CJ、Witte IP、Kuriyan J、Doudna JA（2020年6月）。「CRISPR-Cas12aはRループの非対称性を利用して二本鎖切断を形成する 」eLife。9。doi ： 10.7554 / eLife.55143。PMC 7286691。PMID 32519675。
- ^ Yamano T, Nishimasu H, Zetsche B, Hirano H, Slaymaker IM, Li Y, et al. (2016年5月). 「ガイドRNAおよび標的DNAと複合体を形成したCpf1の結晶構造」. Cell . 165 ( 4): 949–962. doi :10.1016/j.cell.2016.04.003. PMC 4899970. PMID 27114038.
- ^ Altae-Tran H, Kannan S, Demircioglu FE, Oshiro R, Nety SP, McKay LJ, et al. (2021年10月). 「広範囲に広がるIS200/IS605トランスポゾンファミリーは、多様なプログラム可能なRNA誘導エンドヌクレアーゼをコードする」. Science . 374 (6563): 57–65. Bibcode :2021Sci...374...57A. doi :10.1126/science.abj6856. PMC 8929163. PMID 34591643 .
- ^ Graham DB、 Root DE (2015年11月) 。「CRISPR遺伝子編集実験の設計のためのリソース」。 ゲノム生物学。16 :260。doi : 10.1186/s13059-015-0823- x。PMC 4661947。PMID 26612492。
- ^ 「抗CPF1抗体（GTX133301）| GeneTex」www.genetex.com . 2020年10月30日閲覧。