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Cas12a（C RISPR関連タンパク質12a、以前はCpf1 ）は、クラスIIタイプVのCRISPR関連エンドヌクレアーゼ・エキソヌクレアーゼである。[ 1 ] F. novicidaなどの細菌[2][3]では、Cas12aはウイルスやその他の外来可動遺伝因子の遺伝物質を標的として破壊する。標的生物では、crRNAはCas12aが認識する定常領域と、以前に細胞に感染した外来核酸（例えば、ファージゲノムの一部）に相補的な「スペーサー」領域を含む。 [ 4 ]
Cas12aはCas9とは異なり、二本鎖DNAに平滑末端とは対照的にずれた切断を生成します。[ 5 ] Cas12aは「Tリッチ」プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）（典型的には5'-TTTV-3'、ここでVはA、C、またはG）に依存しており、Cas9が好む「Gリッチ」PAM（典型的には5'-NGG-3'）とは異なる部位を提供します。[ 6 ]また、効果的なターゲティングにはCRISPR RNA（crRNA）のみが必要ですが、Cas9はcrRNAとトランス活性化crRNA（tracrRNA）の両方を必要とします。[ 7 ]
Cas12aのプログラム可能なDNA標的化活性は、バイオテクノロジーや生物学研究の応用において有用なツールとなる。crRNAのスペーサー配列を改変することで、研究者はCas12aを特定のDNA配列に標的化することができ、標的DNAの改変が可能となる。[ 8 ] Cas12aは、単一のRuvC活性部位、5'プロトスペーサー隣接モチーフへの嗜好性、切断部位における平滑末端ではなく粘着末端の形成によって他のCasタンパク質と区別される。これらの違いやその他の違いにより、特定の用途により適している。基礎研究を超えて、CRISPR-Cas12aシステムは遺伝性疾患や遺伝子ドライブへの応用が期待される。[ 8 ]
Cas12aの特性は、遺伝子編集の文脈においてCas9よりもCas12aに利点をもたらす可能性がある。例えば、Cas12aのcrRNAはサイズが小さいため、多重ゲノム編集に適しており、Cas9の単一ガイドRNA（sgRNA）と比較して、より多くのガイドRNAを単一のベクターにパッケージ化することができる。[ 9 ] Cas12aによって生成される粘着性の5'オーバーハングは、従来の制限酵素クローニングよりも高い標的特異性でDNAアセンブリにも利用できる。さらに、Cas12aはPAM部位から18～23塩基対下流でDNAを切断する。この特性により、修復後も認識配列がそのまま残るため、Cas12aは複数回のDNA切断を実行できる。逆に、Cas9はPAM部位の上流3塩基対のみを切断し、非相同末端結合（NHEJ）経路による挿入・欠失変異を引き起こし、認識配列を破壊することで、その後の切断ラウンドを阻止します。Cas12aの注目すべき特徴は、Cas9とは対照的に、切断後も標的DNAに結合したままで、その後他の1本鎖DNA分子を無差別に切断できることです。この特性は「副次的切断」または「トランス切断」活性と呼ばれ、さまざまな診断技術の開発に利用されています。[ 10 ]
Cas12aはクラスIIタイプV CRISPR関連ヌクレアーゼに分類されますが、Cas9に見られるNHNエンドヌクレアーゼドメインを欠いており、代わりにRuvC様ドメインを使用して連続的なDNA切断を行い、結果としてずれた末端が生成されます。[ 10 ] Cas9とは異なり、Cas12aは独自のジンクフィンガー様ドメインを有しており、これがDNA結合または構造安定性に寄与している可能性があります。Cas12aのCas9に対する大きな利点は、WEDドメイン内の固有のRNase活性であり、これにより前駆体crRNA（pre-crRNA）を成熟crRNAに自己処理することが可能になります。[ 11 ]これにより、トランス活性化crRNA（tracrRNA）の必要性がなくなり、ガイドRNA設計が簡素化され、複数のcrRNAを単一のベクターにパッケージ化することで多重編集が容易になります。
マルチプレックスゲノム編集は、複数の遺伝子を同時に編集できる強力な技術です。Cas12aは、Cas9と比較してその応用を簡素化する特徴があるため、この文脈で特に有用です。[ 12 ]例えば、Cas12aは、遺伝子を標的として編集するために短いCRISPR RNA（crRNA）のみを必要とします。[ 13 ] これらのcrRNAは、単一のデリバリーシステムにまとめてパッケージ化することで簡単にマルチプレックス化でき、複数のゲノム領域の同時編集が可能になります。[ 14 ]
さらに、Cas12aとCas9は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の要件に違いがあります。Cas9は通常Gリッチ配列を探すのに対し、Cas12aはTリッチ配列を標的とします。この違いにより、標的可能なゲノム部位の範囲が広がり、Cas12aはCas9が効率的でない可能性のある領域（植物ゲノムに多く見られるATリッチ領域など）の遺伝子を編集できるようになり[ 15 ] 、研究者にとってより大きな柔軟性がもたらされます。
Cas12aは、Cas9が必要とするtracrRNAのような追加コンポーネントを必要とせずに、自身のcrRNA（CRISPR RNA）を送達できる能力を備えているため、多重編集用のガイドRNAの設計と送達がさらに簡素化される。
CRISPR-Cas12aは、細菌の遺伝子配列の公開データベースから有望なDNA断片を検索することによって発見されました。バイオインフォマティクスによるCRISPRシステムタンパク質としての同定、命名、およびその検出のための隠れマルコフモデル（HMM）は、2012年にTIGRFAMsタンパク質ファミリーデータベースのリリースで提供されました。Cas12aは多くの細菌種に存在します。ゲノム編集ツールとして開発された究極のCas12aエンドヌクレアーゼは、それを保有することが知られている最初の16種の1つから得られました。[ 16 ] AcidaminococcusとLachnospiraceaeの2つの候補酵素は、ヒト細胞で効率的なゲノム編集活性を示します。[ 8 ]
CRISPR-Casシステムは2つのクラスに分けられます。クラスIでは、複数のCasタンパク質がcrRNAと結合して機能的なエンドヌクレアーゼを構築し、クラスIIでは、単一のCasエンドヌクレアーゼがcrRNAと結合します。クラスIIはさらにタイプII、タイプV、タイプVIシステムに分けられます。Cas12aはクラスII、タイプVのCRISPR-Casシステムとして同定されています。[ 17 ]
CRISPR（ Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ）という頭字語は、細菌や古細菌に見られる不変のDNA配列を指し、Casタンパク質とそのcrRNAをコードしています。Cas12aは元々Cpf1として知られていましたが、これはCRISPRの略語であり、それが出現する2つの細菌属、 PrevotellaとFrancisellaに由来しています。2015年に、Cas（ C RISPR as associated）タンパク質の名称を配列相同性に合わせてより広範に合理化した後に改名されました。[ 17 ]
Cas12aタンパク質は、混合α/βドメイン、 Cas9のRuvCドメインに類似したRuvC様エンドヌクレアーゼドメイン（RuvC-IとRuvC-IIという2つの非連続セグメントに分かれている）、および亜鉛フィンガー様ドメインを含んでいる。[ 18 ] Cas9とは異なり、Cas12aにはHNHエンドヌクレアーゼドメインがなく、Cas12aのN末端領域にはCas9に見られるようなαヘリックス認識ローブがない。[ 17 ]
Cas12a遺伝子座は、タイプIIシステムよりもタイプIおよびIIIに類似したCas1、Cas2、Cas4タンパク質をコードしている。データベース検索によると、Cas12aファミリータンパク質は多くの細菌種に豊富に存在することが示唆されている。[ 17 ]
Cas9とは異なり、Cas12aはtracrRNA（天然のCRISPRシステムではCasタンパク質に結合する前に別のcrRNAと塩基対を形成する必要がある）を必要とせず、代わりに単一のcrRNAに結合します。Cas12aとそのガイドRNAはどちらもCas9システムのタンパク質およびRNAコンポーネントよりも小さく、Cas12aのcrRNAはCas9で使用されるsgRNAの約半分の長さです。[ 19 ]このサイズの縮小により、Cas12aは、カプシドが小さいためDNAパッケージング容量が限られているアデノ随伴ウイルス（AAV）による生体内送達などの用途により適しています。
Cas12a-crRNA複合体は、Cas9が標的とするGリッチPAMとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）5'-YTN-3' [ 20 ]（ここで「Y」はピリミジン[ 21 ]、「N」は任意の核酸塩基）を認識することによって標的DNAまたはRNAを切断します。PAMの認識後、Cas12aは4または5ヌクレオチドの突出部を持つ粘着末端のようなDNA二本鎖切断を導入します。[ 18 ]
CRISPR-Cas12aシステムは、Cas12a酵素とガイドRNAから構成され、ガイドRNAは複合体を二重らせん上の正しい位置に移動させて標的DNAを切断します。CRISPR-Cas12aシステムの活性には3つの段階があります。[ 16 ]
Cas9はDNAを切断するために2つのRNA分子を必要とするが、Cas12aは1つで済む。これらのタンパク質はDNAを異なる場所で切断するため、研究者は編集部位を選択する際により多くの選択肢を得られる。Cas9はDNA分子の両方の鎖を同じ位置で切断し、平滑末端を残す。Cas12aは一方の鎖を他方より長く残し、粘着末端を作る。粘着末端は、DNAの非相同末端結合または相同修復の際に平滑末端とは異なる特性を持ち、遺伝子挿入を試みる際にCas9と比較してCas12aに一定の利点をもたらす。[ 16 ] CRISPR-Cas9システムは効率的に遺伝子を不活性化できるが、遺伝子を挿入したりノックインを生成したりすることは困難である。[ 4 ] Cas12aはtracrRNAを欠き、TリッチPAMを利用し、ずれたDNA二本鎖切断を介してDNAを切断する。[ 19 ]
要約すると、Cas12aシステムとCas9システムの重要な違いは、Cas12a: [ 23 ]
Cas12エンドヌクレアーゼは、最終的にはIS200/IS605ファミリートランスポゾンのTnpBエンドヌクレアーゼから進化した可能性が高い。TnpBはまだCRISPR免疫システムに「取り込まれて」いないが、OmegaRNAテンプレートシステムを使用してRNA誘導切断を実行できる。[ 24 ]
CRISPRを使用する際の標的効率と特異性には、ガイドRNA設計など複数の側面が影響します。ガイドRNAの最適な設計のための多くの設計モデルとCRISPR-Casソフトウェアツールが開発されています。これらには、SgRNA designer、CRISPR MultiTargeter、SSFinderなどがあります。[ 25 ]さらに、Cas12aタンパク質を検出するために使用できる市販の抗体も利用可能です。[ 26 ]