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Cas9（CRISPR関連タンパク質9）は、細菌や古細菌のCRISPR免疫システムの一部であるDNA切断エンドヌクレアーゼです。これはCRISPRゲノム編集ツールとして応用されています。CRISPR-Cas9システムは、遺伝子工学、医学、農業、バイオテクノロジーなど 幅広い分野で利用されています。
Cas9エンドヌクレアーゼは、DNAに部位特異的な二本鎖切断を導入し、非相同末端結合や相同組換えなどの細胞修復機構を介して遺伝子の不活性化、除去、または挿入を可能にする。[ 2 ]
Cas9はS. pyogenesで発見され、後にS. thermophilusでも発見された。[ 3 ] Cas9は2つの小さなRNAと協働して機能する。s— crRNAとtracrRNA—が結合して4成分複合体を形成する。[ 4 ] [ 5 ] 2012年、DoudnaとCharpentierはRNAを融合させてシングルガイドRNAを作り、Cas9が特定のDNA配列を切断できるようにした。これらの進展は、ヒト細胞でのゲノム編集を示したZhangとChurchが率いるグループを含むゲノム改変の取り組みを刺激した。 [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]
Cas9の変異体、例えば一本鎖切断を引き起こすCas9ニッカーゼ（Cas9n）や、異なるPAM配列を認識するバージョンは、Cas9の特定の制限に対処するものである。[ 9 ]
CRISPR-Cas9技術は、特にヒト生殖細胞系列の編集や遺伝子強化に関して、倫理的および規制上の懸念を引き起こしている。
CRISPR/Casシステムは、細菌が侵入してくるウイルスやバクテリオファージから身を守る手段として自然界で進化しました。このシステムは、細菌のDNA断片を宿主ゲノムに挿入することで、その後の感染に対して適応免疫系が適切に対応できるようにしたものです。このシステムは化膿レンサ球菌で発見され、後に他の多くの種でも確認されました。
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ゲノム編集ツールとしてのCas9の開発
Cas9は、細菌の適応免疫系に関与するCRISPR関連タンパク質として、最初に化膿レンサ球菌で同定され、当初はCas5と呼ばれていました。研究により、Cas9にはヌクレアーゼドメインが含まれており、これはII型CRISPRシステムで二本鎖DNA切断を生成するエフェクター酵素であることがわかりました。[ 10 ]
研究者らは、Cas9の活性は2つのRNA分子に依存していることを特定した。1つは酵素を標的DNA配列に誘導するCRISPR RNA（crRNA）、もう1つはヌクレアーゼ活性に必要なトランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）である。[ 11 ]
2012年、ジェニファー・ダウドナとエマニュエル・シャルパンティエは、2つのRNA分子を融合させて単一のガイドRNAを作成することで、Cas9エンドヌクレアーゼを簡略化された2成分システムに再設計しました。このガイドRNAは、Cas9と組み合わせることで、ガイドRNAによって指定されたDNA標的を見つけて切断することができます。[ 12 ]同年、CRISPR Cas9コンポーネントは、試験管内で部位特異的な二本鎖DNA切断をプログラムできることが研究で示され、ゲノム編集の基礎が築かれました。
ガイドRNAのヌクレオチド配列を操作することで、人工Cas9システムは、分離のためにDNA配列を標的として切断するようにプログラムできる。[ 12 ]ほぼ同時期に、Virginijus Šikšnys 、Gasiūnas、Barrangou、Horvathを含む共同研究により、 S. thermophilus CRISPRシステムのCas9も、crRNA配列を改変して特定のDNA部位を標的とするように再プログラムできることが示された。
2013年、 Feng ZhangとGeorge Churchが率いる研究グループは、ヒトゲノムにおける標的DNA編集の成功を報告し、真核生物系における標的改変のためのCRISPR-Cas9の最初の使用例となった。[ 10 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]これらの発見は、幅広い生物種にわたる汎用的なゲノム編集ツールとしてのCRISPR-Cas9の開発を促進した。[ 16 ]
DNA切断以外にも、CRISPR Cas9は標的遺伝子の活性化またはサイレンシングを可能にするプログラム可能な転写因子として機能するように改変されている。 [ 17 ]このシステムの開発の重要性は、2020年にエマニュエル・シャルパンティエとジェニファー・ダウドナがCRISPR Cas9ゲノム編集の研究でノーベル化学賞を受賞した際に正式に認められた。 [ 10 ]
ネイティブCas9は160キロダルトンのエンドヌクレアーゼであり、2つの異なるRNA分子、CRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化crRNA（tracrRNA ）からなるガイドRNAを必要とする。[ 18 ]
2013年、MaliらとGilbertらは、切断しないCas9変異体が特定のDNA配列で転写活性化因子または抑制因子を制御できることを報告した。 [ 19 ]同年、Bikardらは、dCas9がプロモーターまたは伸長中にRNAポリメラーゼをブロックし、遺伝子をサイレンシングできることを報告した。[ 20 ]
2014年に、Esvelt、Smidler、Catteruccia、およびChurchは、Cas9ベースの遺伝子ドライブが生物集団全体に遺伝子改変を広める可能性があることを示唆した。[ 21 ]
2017年、LiらはCas9がB型肝炎ウイルスゲノム末端を標的にすることで感染を減少させることができると報告した。[ 22 ]
Jensenらは、dCas9がクロマチンリモデリング因子と融合するとクロマチン構造が変化すると報告した。[ 23 ] O'Geenらは、FOG1とdCas9がH3K27をメチル化することで遺伝子を抑制すると報告した。[ 24 ]
Lowderらは、dCas9が抑制ドメインと融合するとAtCSTF64などの植物遺伝子を抑制することを報告した。[ 25 ]
2018年に、Leeらは、改変されたCas9が反応速度を変化させることでオフターゲット効果を低減することを報告した。[ 26 ]
2019年、ChenとPage-McCawは、Cas9がHIV-1の長末端反復配列を抑制し、ウイルスゲノムに変異を引き起こすことを報告した。[ 27 ]
2020年に、Uddin、Rudin、およびSenは、Cas9ニッカーゼなどのCas9変異体がオフターゲット効果を低減することでゲノム編集を改善することを報告した。[ 28 ]
2025年、Zhou、Diao、Liらは、 CRISPR RNAレベルが低い場合、 apoNmeCas9（NmeCas9のRNAフリー形態）がタイプII-CシステムにおけるCas1–Cas2を介したCRISPRスペーサー獲得を刺激できることを報告した。[ 29 ]
細菌や古細菌のCRISPRシステムは、ウイルスやプラスミドに対抗するプログラム可能な制限酵素として機能する。[ 30 ] CRISPR遺伝子座は、短い回文配列と、外来DNAの配列を格納する可変スペーサー（24～48ヌクレオチド）から構成される。[ 31 ]隣接するcas遺伝子（普遍的なcas1およびcas2、およびII型特異的cas9を含む）は、免疫のためのタンパク質をコードする。Cas9はcrRNAとtracrRNAを使用して複合体を形成し、スペーサー配列に一致する外来DNAを標的として切断する。[ 18 ]
適応段階では、CRISPRシステムはウイルスの「プロトスペーサー」からスペーサーをCRISPR遺伝子座に組み込みます。認識にはPAM （ S.pyogenesのNGGなど）の存在が必要です。 [ 32 ] Cas9は機能的なスペーサーの獲得を保証します。[ 33 ]しかし、スペーサーは相同組換えによって失われる可能性があります。[ 31 ]
ApoCas9は、II-C型システムにおいてスペーサー獲得を促進し、獲得活性をCRISPR RNA量に連動させることが報告されている。crRNA量が少ない場合（例えば、アレイ新生や自然なアレイ収縮を起こしている細胞など）は獲得が増加し、crRNA量が多い場合（拡張したアレイ）は獲得が減少する。ヌクレアーゼローブだけでも獲得を促進するのに十分であるが、crRNA依存性制御には全長Cas9が必要である。この活性は、いくつかのII-C型Cas9オルソログ間で進化的に保存されている。[ 29 ]
RNAポリメラーゼはCRISPR遺伝子座をpre-crRNAに転写し、pre-crRNAは特定のエンドリボヌクレアーゼによって処理されて成熟crRNAとなり、それぞれ1つのスペーサーと部分的な反復配列を含む。[ 30 ]
干渉段階では、crRNAはtracrRNAとともにCas9を相補的なフォアイングDNA配列へと誘導します。ターゲット配列がスペーサーと一致し、PAMが存在する場合、Cas9はDNAに二本鎖切断を導入し、ウイルスの複製を停止させます。[ 34 ]
エンドヌクレアーゼ活性を持たない不活性Cas9（dCas9）は、DNAに結合して転写を調節することができる。[ 35 ]真核細胞 では、dCas9はエンハンサー配列を標的として転写因子の結合と遺伝子発現を阻害する。[ 36 ] dCas9ベースの抑制を用いたゲノムワイドスクリーニングが、遺伝子機能を体系的に特定するために実施されている。[ 37 ]
Cas9はDNA標的化に加えて、PAM相補配列を含む相補的な一本鎖DNAとハイブリダイズするとmRNAを切断することが示されている。[ 38 ]転写活性化因子と融合させたdCas9は、遺伝子を活性化するために使用できる（CRISPRa）。[ 37 ]
Cas9は、αヘリックスローブ（REC）とHNHドメインおよびRuvCドメインを含むヌクレアーゼローブ（NUC）からなる二葉構造で、ブリッジヘリックスで連結されています。[ 39 ]ヌクレアーゼローブには、標的DNA鎖を切断するHNHドメインと、非標的鎖を切断するRuvCドメインが含まれています。[ 1 ] PAM相互作用ドメインはNGG PAM配列を認識します。シングルガイドRNA（sgRNA）はcrRNA-tracrRNA複合体と置き換わり、標的DNAとT字型構造を形成します。[ 40 ] 2014年の研究では、REC1ドメインとブリッジヘリックスドメインがsgRNA認識に重要であることが報告されています。[ 1 ]
細菌の制限修飾系は、細胞内に導入された外来DNAを分解することができる。これらのシステムは特定のDNA配列を認識し、Cas9によって導入された遺伝子を含む外来DNAを切断し、ゲノム編集を阻害する。[ 41 ]
Cas9は、酵母（Saccharomyces cerevisiae）[ 42 ] 、カンジダ・アルビカンス[ 43 ] 、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）[44]、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）[ 45 ] 、アリ（Harpegnathos saltatorおよびOoceraea biroi）[ 46 ] [ 47 ] 、蚊（Aedes aegypti）[ 48 ] 、線虫（Caenorhabditis elegans ） [ 49 ]、植物[ 50 ]、マウス（Mus musculus domesticus）[51]、サル[ 52 ]など、さまざまな種のゲノムを編集します。
CRISPR/Cas9は、バクテリオファージ、プラスミド、DNAウイルスなどの侵入者に対する細菌の防御に役立つ。Cas9はRNAに誘導され、エンドヌクレアーゼ酵素として働き、外来DNAを標的として切断する。[ 18 ] [ 40 ]外来DNAをほどき、一致する部位を切断する。これは真核生物のRNA干渉機構と似ている。
Cas9の他のバージョンはDNAに結合することはできるが、DNAを切断することはできない。これらは転写活性化因子または抑制因子遺伝子を制御し、遺伝子の活性化と抑制を管理するために使用できる。[ 53 ] [ 54 ]
より技術的に言えば、Cas9 はStreptococcus pyogenesのClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ( CRISPR )適応免疫システムに関連するRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素です。[ 18 ] [ 40 ] [ 55 ] S. pyogenes は、CRISPR を利用して、侵入してきたバクテリオファージDNA やプラスミドDNAなどの外来 DNA を記憶し、Cas9 で後から調べて切断します。 [ 40 ] [ 33 ] [ 56 ] [ 32 ] Cas9 は、外来 DNA をほどき、ガイド RNA (gRNA) の 20 ヌクレオチドのスペーサー領域に相補的な部位をチェックすることで、この調べを実行します。DNA 基質がガイド RNA に相補的であれば、Cas9 は侵入してきた DNA を切断します。この意味で、CRISPR-Cas9 メカニズムは、真核生物のRNA 干渉(RNAi) メカニズムと類似しています。 Cas9は、細菌の免疫における本来の機能とは別に、DNAに部位特異的な二本鎖切断を誘導するゲノム編集ツールとして利用されてきた。これらの切断は、モデル生物において、それぞれ非相同末端結合および相同組換えを介して、遺伝子の不活性化または異種遺伝子の導入につながる可能性がある。Cas9変異体に関する研究は、CRISPR-Cas9ゲノム編集の限界を克服する有望な方法となっている。例としては、一本鎖切断（SSB）を誘導する変異体であるCas9ニッカーゼ（Cas9n）や、異なるPAM配列を認識する変異体などがある。[ 57 ]亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよび転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）タンパク質とともに、Cas9はゲノム編集分野で重要なツールになりつつある。
Cas9は、ガイドRNAに相補的なほぼすべての配列を切断できるため、近年注目を集めています。[ 40 ] Cas9の標的特異性は、ガイドRNAとDNAの相補性に由来し、タンパク質自体の改変（TALENやジンクフィンガーなど）によるものではないため、Cas9を新しいDNAを標的とするように設計することは簡単です。[ 58 ] Cas9の標的化は、キメラ単一ガイドRNA（chiRNA）の設計によって簡素化されました。科学者たちは、Cas9ベースの遺伝子ドライブが生物集団全体のゲノムを編集できる可能性があると示唆しています。[ 21 ] 2015年には、Cas9が初めてヒト胚のゲノムを改変するために使用されました。[ 59 ]
バクテリオファージが蔓延する、過酷で住みにくい様々な環境で生き残るために、バクテリアやアーキアは捕食性ウイルスを回避し撃退する方法を進化させてきた。その一つが適応免疫のCRISPRシステムである。実際には、CRISPR/Casシステムは自己プログラム可能な制限酵素として機能する。CRISPR遺伝子座は、24～48ヌクレオチド長のCRISPRリピートと可変CRISPRスペーサーが交互に並んだ短い回文配列から構成され、一定の間隔で出現する。これらのCRISPR遺伝子座には通常、隣接するCRISPR関連（cas）遺伝子が付随する。2005年、3つの独立した研究グループによって、スペーサー領域がプラスミドやウイルスなどの外来DNA要素と相同性があることが発見された。これらの報告は、CRISPRが免疫システムとして機能する可能性を示す最初の生物学的証拠となった。
Cas9はゲノム編集ツールとして頻繁に使用されています。Cas9は、ウイルスが宿主のDNAを操作するのを防ぐ最近の開発で使用されています。CRISPR-Cas9は細菌ゲノムシステムから開発されたため、ウイルスの遺伝物質を標的にすることができます。Cas9酵素の使用は、多くのウイルス感染症の解決策となる可能性があります。Cas9は、ウイルスの遺伝情報の特定の鎖を標的にすることで、特定のウイルスを標的にする能力を持っています。より具体的には、Cas9酵素は、ウイルスが通常の機能を実行するのを妨げるウイルスゲノムの特定のセクションを標的にします。[ 60 ] Cas9は、病気や突然変異したDNA鎖を引き起こす有害なDNAおよびRNA鎖を破壊するためにも使用されています。Cas9はすでにHIV-1の影響を阻害する有望性を示しています。Cas9は、HIV-1の長い末端反復配列の発現を抑制することが示されています。HIV-1ゲノムに導入されると、Cas9はHIV-1の鎖を突然変異させる能力を示しています。[ 61 ] [ 62 ] Cas9は、 B型肝炎ウイルスゲノムの特定の長い末端反復配列の末端を標的とすることで、B型肝炎の治療にも使用されています。 [ 22 ] Cas9は、マウスの白内障を引き起こす変異を修復するために使用されています。
CRISPR-Casシステムは、遺伝子構成と構造の違いに基づいて、3つの主要なタイプ（タイプI、タイプII、タイプIII）と12のサブタイプに分類されます。しかし、すべてのCRISPR-Casシステムに共通する核となる特徴は、cas遺伝子とそのタンパク質です。cas1とcas2はタイプとサブタイプを問わず共通していますが、cas3、cas9、cas10はそれぞれタイプI、タイプII、タイプIIIに特有の遺伝子です。
適応には、CRISPR遺伝子座内の隣接する2つの反復配列間のスペーサーの認識と統合が含まれます。「プロトスペーサー」とは、スペーサーに対応するウイルスゲノム上の配列を指します。プロトスペーサーの近位には、保存されたヌクレオチドの短い領域が存在し、これはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれます。PAMは、DNA断片を取得するために使用される認識モチーフです。[ 32 ]タイプIIでは、Cas9は適応中にPAMを認識し、機能的なスペーサーの取得を確実にします。[ 33 ]
スペーサーの消失、さらには複数のスペーサーのグループの消失も、Aranaz et al. 2004 および Pourcel et al. 2007 によって観察されている。これはおそらく、反復配列間の相同組換えによって起こる。[ 63 ]
CRISPRの発現には、RNAポリメラーゼによってCRISPR遺伝子座から転写されるCRISPR RNA（pre-crRNA）と呼ばれる一次転写産物の転写が含まれます。その後、特定のエンドリボヌクレアーゼがpre-crRNAを小さなCRISPR RNA（crRNA）に切断します。[ 30 ]
干渉には、CASCADEと呼ばれる多タンパク質複合体内のcrRNAが関与しており、挿入された相補的な外来DNAの領域を認識して特異的に塩基対を形成することができる。crRNA-外来核酸複合体はその後切断されるが、スペーサーと標的DNAの間にミスマッチがある場合、またはPAMに突然変異がある場合は、切断は開始されない。後者の場合、外来DNAは細胞による攻撃の標的とならないため、ウイルスの複製が進行し、宿主はウイルス感染に対して免疫を持たない。干渉段階は、CRISPRの獲得および発現とは機構的にも時間的にも区別できるが、防御システムとして完全に機能するためには、3つの段階すべてが機能する必要がある。[ 34 ]
ステージ 1: CRISPR スペーサーの統合。プロトスペーサーとプロトスペーサー関連モチーフ (赤色で表示) は、宿主 DNA 内の CRISPR アレイの「リーダー」末端で取得されます。CRISPR アレイは、リピート (黒色のひし形) に挟まれたスペーサー配列 (色付きの四角で表示) で構成されています。このプロセスには Cas1 と Cas2 (およびタイプ II では Cas9 [ 33 ] ) が必要であり、これらは通常 CRISPR アレイの近くに位置する cas 遺伝子座にコードされています。
ステージ2：CRISPRの発現。pre-crRNAは、宿主RNAポリメラーゼによってリーダー領域から転写され、その後Casタンパク質によって切断され、単一のスペーサーと部分的な反復配列を含むより小さなcrRNA（色付きのスペーサーを持つヘアピン構造として示されている）になる。
ステージ3：CRISPR干渉。侵入してきた外来DNAと強い相補性を持つスペーサーを持つcrRNAが、Casタンパク質を必要とする切断イベント（ハサミで示されている）を開始します。DNAの切断はウイルスの複製を阻害し、宿主に免疫を与えます。この干渉段階は、CRISPRの獲得と発現（細胞を分割する白い線で示されている）とは機能的にも時間的にも区別できます。
dCas9（エンドヌクレアーゼ欠損Cas9とも呼ばれる）は、遺伝子の目的のセクションの転写結合部位に適用すると、遺伝子発現の編集に利用できます。dCas9の最適な機能は、その作用機序に起因します。ヌクレオチドがRNA鎖に追加されなくなり、その結果鎖の伸長が終了すると、遺伝子発現が阻害され、転写プロセスに影響します。このプロセスは、dCas9が大量生産され、配列特異的なガイドRNA分子を介していつでも最も多くの遺伝子に影響を与えることができるときに発生します。dCas9は遺伝子発現を下方制御するようであるため、抑制性クロマチン修飾ドメインと組み合わせて使用すると、この作用はさらに増幅されます。[ 64 ] dCas9タンパク質は、遺伝子発現の制御以外にも機能があります。プロモーターをdCas9タンパク質に追加することで、互いに協力して、DNA鎖に沿ったさまざまな配列で転写を開始または停止する効率を高めることができます。これら2つのタンパク質は、遺伝子に作用する場所が特異的です。これは、プロモーターとdCas9が整列してヌクレオチドポリマーの伸長を阻害し、転写されたDNA断片を形成する特定の種類の原核生物でよく見られます。プロモーターがない場合、dCas9タンパク質は単独でも遺伝子本体と一緒でも同じ効果を発揮しません。[ 65 ]
転写抑制の効果をさらに詳しく調べると、ヒストンのアミノ酸成分であるH3K27は、dCas9とFOG1と呼ばれるペプチドの相互作用によってメチル化される。本質的に、この相互作用は、遺伝子の特定の接合部にあるアミノ酸複合体のC+N末端部分で遺伝子抑制を引き起こし、結果として転写を終結させる。[ 66 ]
dCas9は、病気を引き起こす可能性のある特定のタンパク質を改変する際にも効果的であることが証明されています。dCas9がガイドRNAと呼ばれるRNAに結合すると、生物のゲノムに有害となる可能性のある反復コドンやDNA配列の増殖を抑制します。具体的には、複数の反復コドンが生成されると、dCas9が大量に動員され、これらのコドンの過剰生成に対抗し、転写を停止させます。dCas9はgRNAと相乗的に作用し、DNAポリメラーゼIIによる転写の継続を直接的に阻害します。
dCas9タンパク質の働きに関するさらなる説明は、植物の遺伝子産生を調節して特定の特性を増減させることで植物ゲノムを利用する点に見出すことができる。CRISPR-CAS9システムは、遺伝子の発現を上方制御または下方制御する能力を持つ。dCas9タンパク質はCRISPR-CAS9システムの構成要素であり、これらのタンパク質は植物遺伝子の特定の領域を抑制することができる。これは、dCAS9が抑制ドメインに結合するときに起こり、植物の場合、AtCSTF64などの調節遺伝子の不活性化が起こる。[ 67 ]
細菌もまた、dCas9タンパク質の利用対象の一つである。真核生物はDNA構成とゲノムが大きいため、はるかに小さい細菌は操作しやすい。その結果、真核生物はdCas9を使用してRNAポリメラーゼによる遺伝物質の転写プロセスの継続を阻害する。[ 68 ]
Cas9は、ガイドRNAがαヘリックスローブ（青）とヌクレアーゼローブ（シアン、オレンジ、グレー）の間に挟まれた二葉構造を特徴としています。これら2つのローブは、1本のブリッジヘリックスを介して接続されています。多ドメインヌクレアーゼローブには、非標的DNA鎖を切断するRuvC（グレー）と標的DNA鎖を切断するHNHヌクレアーゼドメイン（シアン）という2つのヌクレアーゼドメインが存在します。RuvCドメインは、三次構造内で相互作用してRuvC切断ドメインを形成する、配列が異なる部位によってコードされています（右図参照）。
標的DNAの重要な特徴は、3つのヌクレオチド配列NGGからなるプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含んでいる必要があることです。このPAMは、Cas9のC末端付近に位置するPAM相互作用ドメイン（PIドメイン、オレンジ色）によって認識されます。Cas9は、アポ（アポ酵素）、ガイドRNA結合状態、およびガイドRNA:DNA結合状態の間で明確な構造変化を起こします。
Cas9は、crRNA-tracrRNAリボヌクレオプロテイン複合体の成熟を媒介するCRISPR遺伝子座に固有のステムループ構造を認識します。[ 69 ] Cas9は、CRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）と複合体を形成し、標的dsDNAをさらに認識して分解します。[ 70 ]ここに示す共結晶構造では、crRNA-tracrRNA複合体は、天然のRNA複合体と同じ機能を持つことが証明されているキメラシングルガイドRNA（sgRNA、赤色）に置き換えられています。[ 40 ]標的ssDNAと塩基対を形成したsgRNAは、Cas9によってT字型構造として固定されます。DNAに結合したCas9酵素のこの結晶構造は、ヌクレアーゼローブに対するαヘリックスローブの明確な構造変化と、HNHドメインの位置を明らかにしています。このタンパク質は、認識ローブ（REC）とヌクレアーゼローブ（NUC）から構成される。HNHドメインを除くすべての領域は、互いに、そしてsgRNA-ssDNA複合体と密接な相互作用を形成する一方、HNHドメインはタンパク質の残りの部分とはほとんど接触しない。結晶構造解析で観察されたCas9複合体の別のコンフォメーションでは、HNHドメインは確認できない。これらの構造は、HNHドメインのコンフォメーションの柔軟性を示唆している。
現在までに、少なくとも3つの結晶構造が研究され、発表されている。1つはアポ状態のCas9のコンフォメーションを表し、[ 39 ]、2つはDNA結合状態のCas9を表している。[ 71 ] [ 1 ]
sgRNA-Cas9複合体では、結晶構造に基づくと、REC1、BH、PIドメインは、反復領域とスペーサー領域の両方でバックボーンまたは塩基と重要な接触を持っています。[ 1 ] [ 71 ] REC1またはREC2ドメインの欠失やBHの残基変異を含むいくつかのCas9変異体がテストされています。REC1およびBH関連の変異体は、野生型と比較して活性が低いか、まったくないことを示しており、これらの2つのドメインが反復配列でのsgRNA認識と複合体全体の安定化に重要であることを示しています。スペーサー配列とCas9、およびPIドメインと反復領域間の相互作用についてはさらに研究が必要ですが、共結晶はCas9とsgRNA間の明確な界面を示しています。
Cas9は、McrA様HNHヌクレアーゼドメインとRuvC様ヌクレアーゼドメインの2つのヌクレアーゼドメインを含んでいます。[ 72 ]これらのHNHドメインは相補的（標的）DNA鎖を切断し、RuvC様ヌクレアーゼドメインは非相補的（非標的）DNA鎖の切断を担当します。[ 40 ]配列類似性は低いものの、RNase Hに相同な領域はRuvCフォールドをとり、HNH領域はHNHエンドヌクレアーゼファミリーのメンバーであるT4 Endo VIIと同様にフォールドします。[ 73 ]
野生型Streptococcus pyogenes Cas9は、RNAを介したDNA切断にマグネシウム（Mg 2+）補因子を必要とするが、他の二価金属イオンの存在下では活性レベルにばらつきが見られる。[ 40 ]例えば、マンガン（Mn 2+）の存在下では、Cas9はRNA非依存的なDNA切断を示すことが示されている。[ 74 ]
DNA切断には、切断部位から3ヌクレオチド下流の非標的鎖に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の存在が必要である。[ 40 ] S. Pyogenes Cas9の標準的なPAM配列はNGGであるが、NAGやNGAなどの代替モチーフも切断活性は低いものの許容される。[ 75 ] [ 76 ] RNA結合Cas9によるDNA切断は
反応速度は比較的速い（k ≥ 700 s −1）が、切断産物の放出は非常に遅い（t 1/2 = ln(2)/ k ≈ 43–91 時間）ため、Cas9 は実質的にシングルターンオーバー酵素となる。[ 77 ] Cas9 の反応速度論に関する追加の研究では、改変されたCas9 は反応速度を変化させることでオフターゲット効果を低減するのに効果的であることが示されている。 [ 26 ] [ 78 ]
切断効率は、PAM認識、gRNAmの20ヌクレオチドスペーサー相補領域のヌクレオチド組成など、いくつかの要因に依存します。効率に影響を与える最も重要なヌクレオチド組成特性は、PAM近傍領域のものです。[ 79 ] [ 80 ] [ 76 ]核酸の自由エネルギー変化も、切断活性を決定する上で非常に重要です。[ 81 ]非常に弱い結合や安定した結合を除外する、結合自由エネルギー変化の制限された範囲に収まる二重らせんを形成するDNAに結合するガイドRNAは、一般的に効率的に機能します。[ 76 ]安定したガイドRNAの折り畳み構造も切断を阻害する可能性があります。[ 82 ]
DNA切断パターン
ヌクレアーゼの先駆的な構造解析により、HNHドメインはプロトスペーサーの18番目と17番目の位置（18|17）の間を正確に切断し、RuvCは非標的鎖を対応する下流の位置で切断することが実証された。[ 40 ]分子動力学シミュレーションでは、標的配列の17|16間のNTSの切断は18|17よりもエネルギー的に有利であり、1ヌクレオチドの5' ssDNAオーバーハングを生成することが報告された。[ 83 ]特に、著者らは、5'オーバーハングがDNA修復中に埋められ、テンプレート挿入が生じることを実証した。この場合、5'オーバーハングはPol4によって修復反応のテンプレートとして使用される。ずれ切断と正確なテンプレート挿入との関連性は、ヒト細胞での追加研究によって裏付けられている。[ 84 ] [ 85 ]
標的配列中の PAM に最も近い 5 つの塩基のヌクレオチド組成も切断プロファイルに影響を与え、DNA 切断が鈍端かずれ端かに影響します。[ 86 ] 2024 年に Cas9 切断プロファイルのハイスループット調査により、標的部位での切断の約 85% が鈍端であるのに対し、約 15% は 1 ヌクレオチドの 5' オーバーハングがあることが明らかになりました。[ 86 ]オフターゲットでは、標的部位と比較してずれ端切断率が高く、オフターゲットの約 1/3 は 1 ～ 3 ヌクレオチドの 5' オーバーハングを示しました。標的領域内の配列パターンは、鈍端またはずれ端の DNA 切断の形成を促進することが示され、ずれ端切断は予測可能な挿入欠失 ( indel ) 結果の形成と関連していました。[ 87 ]
ほとんどの古細菌と細菌は、Cas9によるゲノム編集を頑固に拒否します。これは、これらの細胞が、自身に影響を与えない外来DNAをゲノムに組み込むことができるためです。これらの細胞がCas9に抵抗するもう1つの方法は、制限修飾（RM）システムによるプロセスです。バクテリオファージが細菌または古細菌細胞に入ると、RMシステムによって標的にされます。RMシステムは、制限酵素によってバクテリオファージのDNAを別々の断片に切断し、エンドヌクレアーゼを使用してDNA鎖をさらに破壊します。RMシステムはCas9プロセスによって追加された外来遺伝子も標的にするため、これはCas9編集にとって問題となります。[ 41 ]
Cas9は、ほぼあらゆるゲノムのあらゆる相補配列に結合できるという独自の能力を持つため、研究者たちはこの酵素を用いて様々なゲノム領域の転写を抑制したいと考えました。これを実現するために、RuvCドメインとHNHドメインの2つの重要な触媒残基をアラニンに変異させることで、Cas9のエンドヌクレアーゼ活性を完全に失わせることができます。その結果得られるタンパク質は「デッドCas9」または略して「dCas9」と呼ばれ、二本鎖DNAにしっかりと結合することができます。この触媒活性を失ったCas9変異体は、Cas9のDNA結合機構の研究と、汎用的なプログラム可能なDNA結合RNA-タンパク質複合体の両方に利用されています。
dCas9と標的dsDNAの相互作用は非常に強固であるため、高モル濃度の尿素タンパク質変性剤でもdCas9 RNA-タンパク質複合体をdsDNA標的から完全に解離させることはできません。[ 35 ] dCas9は、プロモーターでRNAポリメラーゼと競合して転写を停止できるあらゆる遺伝子座の転写開始部位に、設計されたシングルガイドRNAで標的化されています。[ 88 ]また、dCas9は、転写の伸長段階でRNAポリメラーゼの阻害が起こるように、遺伝子座のコード領域に標的化することもできます。 [ 88 ]真核生物では、dCas9をエンハンサー配列に標的化することで、遺伝子発現のサイレンシングを拡張できます。エンハンサー配列では、dCas9が転写因子の集合をブロックし、特定の遺伝子発現のサイレンシングにつながります。[ 54 ]さらに、dCas9に提供されるガイドRNAは、その相補的なコグネイト配列との特定のミスマッチを含むように設計することができ、これにより、プログラムされたコグネイト配列に対するdCas9の相互作用が定量的に弱まり、研究者は目的の遺伝子に適用される遺伝子サイレンシングの程度を調整することができます。[ 88 ] この技術は、RNAレベルで遺伝子発現が調節されるという点で、原理的にはRNAiに似ています。しかし、dCas9アプローチは、RNAiスクリーニングと比較して、オフターゲット効果が少なく、一般的にサイレンシング効果が大きく再現性が高いため、大きな注目を集めています。[ 89 ]さらに、dCas9アプローチによる遺伝子サイレンシングは定量的に制御できるため、研究者は目的の遺伝子が抑制される程度を正確に制御できるようになり、遺伝子制御と遺伝子ストイキオメトリーに関するより多くの疑問に答えることができるようになりました。
dCas9は転写感受性遺伝子座に直接結合するだけでなく、さまざまな調節タンパク質ドメインと融合させて、無数の機能を実行できます。最近では、dCas9はクロマチンリモデリングタンパク質（HDAC/HAT）と融合して、さまざまな遺伝子座周辺のクロマチン構造を再編成しています。[ 88 ]これは、ヘテロクロマチン構造がCas9の結合を阻害するため、さまざまな真核生物の目的遺伝子を標的にするのに重要です。さらに、Cas9はヘテロクロマチンに反応できるため、この酵素はさまざまな遺伝子座のクロマチン構造の研究にさらに応用できると考えられています。[ 88 ]また、dCas9はゲノムワイドな遺伝子抑制スクリーニングにも使用されています。数千の遺伝子を標的にできるガイドRNAの大規模なライブラリーを使用することで、dCas9を使用したゲノムワイドな遺伝子スクリーニングが実施されています。[ 37 ]
Cas9 を用いた転写抑制の別の方法として、触媒活性を持つ Cas9 酵素で mRNA 産物を直接切断する方法がある。[ 38 ]この方法は、ssDNA と PAM 相補配列を ssRNA にハイブリダイズさせることで、Cas9 結合用の dsDNA-RNA PAM サイトを形成できるというものである。この技術により、RNA に化学修飾を施したり、RNA タグ付け法を用いる必要なく、細胞内の内因性 RNA 転写産物を単離することが可能になる。
遺伝子のサイレンシングとは対照的に、dCas9は転写活性化因子と融合させることで遺伝子を活性化するためにも使用できる。[ 88 ]これらの因子には、細菌RNAポリメラーゼIIのサブユニットや真核生物の従来の転写因子が含まれる。最近では、活性化用の「CRISPRa」と呼ばれるdCas9融合体を使用して、転写活性化のゲノムワイドスクリーニングも実施されている。[ 37 ]
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