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タンパク質スプライシングは、特定のタンパク質の分子内反応であり、前駆体タンパク質から内部タンパク質セグメント（インテインと呼ばれる）が、両側のC末端およびN末端外部タンパク質（エクステインと呼ばれる）の連結によって除去される。前駆体タンパク質のスプライシング接合部は主にシステインまたはセリンであり、これらは求核性側鎖を持つアミノ酸である。現在知られているタンパク質スプライシング反応は、アデノシン三リン酸（ATP）やグアノシン三リン酸（GTP）などの外因性補因子やエネルギー源を必要としない。通常、スプライシングはpre-mRNAスプライシングのみに関連付けられている。この前駆体タンパク質は、 N-エクステイン、インテイン、C-エクステインの3つのセグメントを含む。スプライシングが行われると、結果として得られるタンパク質はN-エクステインがC-エクステインに結合したものとなり、このスプライシング産物もエクステインと呼ばれる。
最初のインテインは、Neurospora crassa [ 1 ]とニンジン[ 2 ]の液胞ATPase（インテインなし）と、最初に推定カルシウムイオン輸送体として記述された酵母の相同遺伝子（インテインあり）との配列比較により、1988 年に発見されました。[ 3 ] 1990 年に Hirataら[ 4 ]は、酵母遺伝子の余分な配列が mRNA に転写され、翻訳後にのみ宿主タンパク質から除去されることを実証しました。それ以来、インテインは生命の 3 つのドメイン（真核生物、細菌、古細菌）とウイルスすべてで発見されています。
タンパク質スプライシングは予想外の現象であり、そのメカニズムは1990年に2つのグループ（安楽[ 5 ]とスティーブンス[ 6 ] ）によって発見された。両グループは、液胞H + -ATPase酵素の前駆体であるSaccharomyces cerevisiae VMA1を発見した。N末端とC末端のアミノ酸配列は、他の生物の液胞H + -ATPaseのDNA配列の70%に相当し、中央のアミノ酸配列は酵母HOヌクレアーゼの全DNA配列の30%に相当した。
多くの遺伝子には、異なる位置に無関係なインテインコードセグメントが挿入されている。これらの理由などから、インテイン（より正確には、インテインをコードする遺伝子セグメント）は利己的な遺伝要素と呼ばれることもあるが、寄生的と呼ぶ方がより正確かもしれない。遺伝子中心の進化観によれば、ほとんどの遺伝子は他の遺伝子や対立遺伝子と競合する限りにおいてのみ「利己的」であり、通常は生物にとって何らかの機能を果たすのに対し、「寄生的な遺伝要素」は、少なくとも初期段階では、生物の適応度にプラスの貢献をしない。[ 7 ] [ 8 ]
2019年12月現在、UniProtKBデータベースには、数十個のアミノ酸残基から数千個のアミノ酸残基まで、手動でインテインとして注釈付けされたエントリが188件含まれています。[ 9 ]最初のインテインは、Saccharomyces cerevisiaeのVMA遺伝子内にコードされているのが見つかりました。その後、真菌（子嚢菌類、担子菌類、接合菌類、ツボカビ類）やさまざまなタンパク質にも見つかりました。既知のインテイン含有タンパク質とは遠縁ですが、後生動物のヘッジホッグタンパク質と密接に関連しているタンパク質が、 Glomeromycota由来のインテイン配列を持つと報告されています。新たに報告されたインテインの多くはホーミングエンドヌクレアーゼを含み、その一部は明らかに活性があります。[ 10 ]真菌におけるインテインの存在量は、インテイン含有遺伝子の水平伝達を示しています。真正細菌と古細菌には、現在知られているインテインがそれぞれ289個と182個ある。当然のことながら、真正細菌と古細菌のインテインのほとんどは、真菌のように核酸代謝タンパク質に挿入されていることがわかっている。[ 10 ]
インテインは大きく異なりますが、多くの種で同じインテイン含有タンパク質が見られます。たとえば、スプライソソームに重要な役割を果たすプレmRNAプロセシング因子8 （Prp8）タンパク質は、真核生物種全体で7つの異なるインテイン挿入部位を持っています。[ 11 ]インテイン含有Prp8は、真菌で最も一般的に見られますが、アメーバ類、緑藻類、カプサスポラ、襟鞭毛虫類でも見られます。多くのマイコバクテリアは、 DnaB（細菌複製ヘリカーゼ）、RecA（細菌DNAリコンビナーゼ）、およびSufB（FeSクラスターアセンブリタンパク質）内にインテインを含んでいます。[ 12 ] [ 13 ]マイコバクテリウム属内および属外の両方で、DnaBインテインの構造と数には著しい多様性があります。興味深いことに、インテイン含有DnaBは藻類の葉緑体にも見られます。[ 14 ]古細菌に見られるインテイン含有タンパク質には、RadA (RecA ホモログ)、RFC、PolB、RNR などがあります。[ 15 ]同じインテイン含有タンパク質 (またはそのホモログ) の多くは、生命の 2 つまたは 3 つのドメインすべてに見られます。インテインは、バクテリオファージや真核生物ウイルスによってコードされるプロテオームにも見られます。ウイルスは、インテイン含有生物の幅広い範囲にわたってインテインを拡散させるベクターとして関与していた可能性があります。[ 15 ]
クラス1インテインの生成過程は、前駆体タンパク質のインテイン部分の最初の残基（セリン、トレオニン、またはシステイン）の側鎖が、その直上流の残基（すなわち、N-エクステインの最後の残基）のペプチド結合を求核攻撃して線状エステル（またはチオエステル）中間体を形成するNOまたはNSシフトから始まります。C-エクステインの最初の残基の側鎖が新たに形成された（チオ）エステルを攻撃してインテインのN末端を遊離させると、エステル交換反応が起こります。これにより、N-エクステインとC-エクステインがペプチド結合を介してではないものの結合した分岐中間体が形成されます。インテインの最後の残基は常にアスパラギン（Asn）であり、この側鎖のアミド窒素原子がインテインとC-エクステイン間のペプチド結合を切断し、末端に環状イミドを持つ遊離インテインセグメントが生成されます。最後に、 C-エクステインの遊離アミノ基がN-エクステインとC-エクステインを連結する（チオ）エステルを攻撃する。ONまたはSNシフトによりペプチド結合と機能的な連結タンパク質が生成される。[ 16 ]
クラス2インテインは求核性第一側鎖を持たず、アラニンのみを持つ。代わりに、反応は求核置換反応から直接始まり、C-エクステインの最初の残基がN-エクステインの最後の残基のペプチドカルボキシルを攻撃する。残りの反応は通常通り進行し、アスパラギンが環状イミドに変化するところから始まる。[ 17 ]
クラス3インテインは求核性第一側鎖を持たず、アラニンのみを持つが、内部に非連続的な「WCT」モチーフを持つ。内部のC（システイン）残基がN-エクステインの最終残基上のペプチドカルボキシルを攻撃する（求核置換）。トランスエステル化は、C-エクステインの最初の残基が新たに形成されたチオエステルを攻撃するときに起こる。残りは通常どおり進行する。[ 18 ]
スプライシング効果のメカニズムは、ネイティブケミカルライゲーションと呼ばれる、中サイズのタンパク質を化学的に生成する技術と自然界で類似した現象である。
インテインは、 タンパク質スプライシング中に自身を切り離し、残りの部分（エクステイン）をペプチド結合で結合できるタンパク質のセグメントです。 [ 19 ]インテインは、（RNA）イントロンとの類似性から、タンパク質イントロンとも呼ばれています。
インテイン名の前半部分は、それが発見された生物の学名に基づき、後半部分は対応する遺伝子またはエクステインの名前に基づいています。例えば、サーモプラズマ・アシドフィラムに見られ、液胞ATPaseサブユニットA（VMA）と関連するインテインは「Tac VMA」と呼ばれます。
通常、この例のように、生物種を特定するには3文字で十分ですが、バリエーションもあります。例えば、株を示すために追加の文字が加えられることがあります。対応する遺伝子に複数のインテインがコードされている場合、インテインには5 ′から3 ′までの数字の接尾辞、または識別された順に番号が付けられます（例：「Msm dnaB-1」）。
インテインをコードする遺伝子のセグメントは通常、インテインと同じ名前が付けられますが、混乱を避けるために、インテイン自体の名前は通常大文字で表記され（例：Pfu RIR1-1）、対応する遺伝子セグメントの名前はイタリック体で表記されます（例：Pfu rir1-1）。別の曖昧さを解消する慣例として、ソースタンパク質名の後に小文字の「i」を付けます（例：「Msm DnaBi1」）。[ 20 ]
インテインは、多くの基準に基づいて分類することができる。
インテインは、スプライシングドメインに加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子（HEG）ドメインを含むことがあります。このドメインは、相同染色体のインテインフリーアレルでDNAを切断し、DNA二本鎖切断修復（DSBR）システムを活性化することで、インテインの拡散に関与しています。DSBRシステムは切断を修復し、インテインをコードするDNAを以前はインテインフリーだった部位にコピーします。[ 17 ] HEGドメインはインテインスプライシングには必須ではないため、これを失って最小インテインまたはミニインテインを形成することができます。いくつかの研究では、HEGドメインを追加または削除して新しい構築物の活性を決定することにより、インテインのモジュール性を示しています。
前駆体タンパク質のインテインは、2つの遺伝子から生じる場合がある。この場合、インテインはスプリットインテインと呼ばれる。例えば、シアノバクテリアでは、DNAポリメラーゼIIIの触媒サブユニットαであるDnaEは、 dnaE-nとdnaE-cという2つの別々の遺伝子によってコードされている。dnaE -n産物はN-エクステイン配列とそれに続く123アミノ酸のインテイン配列からなり、dnaE-c産物は36アミノ酸のインテイン配列とそれに続くC-エクステイン配列からなる。[ 21 ]
インテインはタンパク質スプライシングに非常に効率的であり、そのためバイオテクノロジーにおいて重要な役割を担っている。現在までに200種類以上のインテインが同定されており、そのサイズは100 ～ 800アミノ酸に及ぶ。インテインは、タンパク質半合成[ 22 ]や、大型タンパク質のNMR研究に役立つタンパク質セグメントの選択的標識[ 23 ]などの特定の用途向けに設計されている。
インテイン切除を薬理学的に阻害することは、創薬開発において有用な手段となる可能性がある。インテインが切除されない場合、その構造が破壊されるため、インテインを含むタンパク質は正常な機能を果たすことができない。
インテインは、例えば遺伝子治療において、ミトコンドリアゲノムによって通常コードされる特定の高度に疎水性のタンパク質の異所的発現を達成するのに役立つ可能性があることが示唆されている。[ 24 ]これらのタンパク質の疎水性は、ミトコンドリアへの輸送の障害となる。したがって、非疎水性インテインを挿入することで、この輸送が進む可能性がある。輸送後にインテインを切除すると、タンパク質は野生型に戻る。
アフィニティタグは、不純物の少ない組換えタンパク質を蓄積できるため、組換えタンパク質の精製に広く使用されています。しかし、アフィニティタグは最終精製ステップでプロテアーゼによって除去する必要があります。追加のプロテオリシスステップは、組換えタンパク質からアフィニティタグを除去する際のプロテアーゼの特異性、および消化産物の除去の問題を引き起こします。この問題は、制御された環境でアフィニティタグを自己切断可能なインテインに融合することで回避できます。この種の最初の世代の発現ベクターは、改変されたSaccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA) インテインを使用しました。Chong ら[ 25 ] は、 Bacillus circulansのキチン結合ドメイン (CBD) をアフィニティタグとして使用し、このタグを改変されたSce VMA インテインに融合しました。改変されたインテインは、低温で幅広いpH範囲において、1,4-ジチオスレイトール（DTT）、β-メルカプトエタノール（β-ME）、またはシスチンとのN末端ペプチド結合部で自己切断反応を起こします。組換えタンパク質を発現させた後、細胞ホモジネートをキチンを含むカラムに通します。これにより、キメラタンパク質のCBDがカラムに結合します。さらに、温度を下げて上記の分子がカラムを通過すると、キメラタンパク質は自己スプライシングを起こし、目的のタンパク質のみが溶出されます。この新しい技術により、タンパク質分解ステップが不要になり、改変されたSce VMAはCBDを介してキチンに結合した状態でカラム内に留まります。[ 25 ]
近年、自己凝集ペプチドに基づくタンパク質の精製にインテインが使用されている。エラスチン様ポリペプチド（ELP）はバイオテクノロジーにおいて有用なツールである。標的タンパク質と融合すると、細胞内で凝集体を形成する傾向がある。[ 26 ]これにより、タンパク質精製に必要なクロマトグラフィー工程が不要になる。ELPタグはインテインの融合タンパク質に使用されており、凝集体をクロマトグラフィーなしで（遠心分離によって）分離し、その後、インテインとタグを制御された方法で切断して標的タンパク質を溶液中に放出することができる。このタンパク質分離は連続培地フローを使用して行うことができ、大量のタンパク質が得られるため、このプロセスは従来の方法よりも経済的に効率的である。[ 26 ]別の研究者グループは、標的タンパク質を分離するために、より小さな自己凝集タグを使用した。小さな両親媒性ペプチド18AとELK16（図5）を使用して、自己切断凝集タンパク質を形成した。[ 27 ]
過去 20 年間、抗菌用途にインテインを活用することへの関心が高まっています。[ 12 ]インテインスプライシングは単細胞生物にのみ見られ、特に病原性微生物に多く存在します。[ 28 ]さらに、インテインは一般的にハウスキーピングタンパク質や、ヒト宿主内での生物の生存に関与するタンパク質内に見られます。タンパク質が適切に折り畳まれ機能するためには、翻訳後のインテイン除去が必要です。たとえば、Gaëlle Huetらは、結核菌において、スプライシングされていない SufB が SUF 機構の構成要素である SufBCD 複合体の形成を阻害することを実証しました。 [ 29 ]このように、インテインスプライシングの阻害は、抗菌剤開発のための強力なプラットフォームとなる可能性があります。
インテインスプライシング阻害剤に関する現在の研究は、抗マイコバクテリア剤（M. tb.は 3 つのインテイン含有タンパク質を持つ）の開発、および病原性真菌であるクリプトコッカスとアスペルギルスに有効な薬剤の開発に焦点を当てています。[ 13 ]シスプラチンおよび同様の白金含有化合物は、触媒残基に配位することにより、M. tb. RecA インテインのスプライシングを阻害します。[ 30 ]銅（II）イオンや亜鉛（II）イオンなどの二価カチオンは、同様にスプライシングを可逆的に阻害します。[ 12 ]しかし、これらの方法はいずれも、現在、効果的で安全な抗生物質には適していません。真菌の Prp8 インテインも、触媒 Cys1 残基に干渉することにより、二価カチオンとシスプラチンによって阻害されます。[ 12 ] 2021 年、Liらは、 Prp8インテインスプライシングの低分子阻害剤がC. neoformansとC. gattiiの増殖を遅らせるのに選択的かつ効果的であることを示し、インテインスプライシング阻害剤の抗菌ポテンシャルに関する興味深い証拠を提供した。[ 31 ]