オフターゲットゲノム編集

オフターゲットゲノム編集とは、クラスター化、規則的間隔、短い回文反復配列（CRISPR）- Cas9、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）などの人工ヌクレアーゼ技術の使用によって生じる非特異的で意図しない遺伝子改変を指します。 ^{[1]これらのツールは、さまざまなメカニズムを使用して所定の}DNA配列（「ターゲット」）に結合し、それを切断（または「カット」）して二本鎖染色体切断（DSB）を作成し、細胞のDNA修復メカニズム（非相同末端結合（NHEJ）および相同組換え（HR））を呼び出し、部位特異的な改変をもたらします。^[2]これらの複合体が標的に結合しない場合、多くの場合相同配列やミスマッチ許容度の結果として、標的外DSBを切断し、非特異的な遺伝子改変を引き起こします。^{[3] [4] [5]}具体的には、オフターゲット効果は、意図しない点突然変異、^[6]欠失、^{[7] [8]}挿入、 ^[5]逆位、^[5]および転座で構成されます。^{[9] [8]}

CRISPR-cas9 などのデザイナー ヌクレアーゼ システムは、そのシンプルさ、拡張性、手頃な価格から、ますます人気の研究ツールになりつつあります。^{[10] [11]}とはいえ、オフターゲット遺伝子改変は頻繁に発生し、本来は無傷の遺伝子の機能を変更する可能性があります。初期の CRISPR-cas9 エージェントを使用した複数の研究では、RNA 誘導エンドヌクレアーゼ誘導変異の 50% 以上がオンターゲットで発生していないことがわかりました。^{[3] [7]} Cas9ガイド RNA (gRNA)は20 bp のターゲット DNA 配列を認識し、これに結合して切断し、DNA 配列を「編集」します。ただし、ターゲット配列の結合は数塩基対までの不一致を許容できるため、多くの場合、数千の結合可能な部位が存在し、実験上および安全性上の懸念が生じます。^{[12] [3]}研究分野では、オフターゲット効果により生物学的研究の変数が混乱し、誤解を招く可能性があり、再現性のない結果につながる可能性があります。^[2]臨床分野では、重要なコーディング領域の破壊が癌などの遺伝毒性効果につながることが大きな懸念事項となっている。^[13]したがって、ゲノム編集ツールの特異性の向上^{[14] [ 15]}とオフターゲット効果の検出^{[9] [16]は、急速に進歩した研究分野である。このような研究には、デザイナーヌクレアーゼの開発[17]}と発見、^[18]計算予測プログラムとデータベース^{[19] [20]}およびハイスループットシーケンシング^{[9] [16]}が組み込まれており、突然変異の発生を減らして予測する。多くのデザイナーヌクレアーゼツールはまだ比較的初期段階にあり、その分子特性と生体内挙動がよりよく理解されるにつれて、より正確で予測可能なものになるだろう。

CRISPR-Cas9システムは、細菌や古細菌の適応免疫システムとして機能します。^[21]ウイルスが細菌に感染すると、このシステムはウイルスDNAのセグメントを細菌ゲノムに組み込みます。2回目の侵入時には、これらの配列からの転写物が侵入ウイルスの相補配列にヌクレアーゼ活性を誘導し、ウイルスを破壊します。^{[22] [23] [24]}

この方法を真核生物に外挿して遺伝子編集法を開発するには、Cas9タンパク質、認識配列RNA、およびトランス活性化RNAが必要です。認識配列特異性CRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化RNA（tracrRNA）の両方の融合は実験でよく使用され、シングルガイドRNA（sgRNA）と呼ばれています。^[25]これは両方の機能を実行します。sgRNAの最初の20ヌクレオチドはDNAターゲット配列（cr機能）と相補的であり、その後のヌクレオチドはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM、tracr機能）の一部です。^{[26] [27] [28]}

オフターゲットヌクレアーゼ結合は、標的配列との部分的だが十分な一致から始まる。オフターゲット結合メカニズムは、塩基ミスマッチ許容型とバルジミスマッチ型の2つの主な形式に分類できる。^[29]

Cas9の特異性は20ntのsgRNAとPAMによって制御されていると考えられていますが、オフターゲット変異は依然として蔓延しており、sgRNAと標的DNA配列の間で3〜5塩基対（20塩基対中）ものミスマッチが発生することがあります。^{[25] [30]}さらに、sgRNAの二次構造もオンターゲット部位とオフターゲット部位の切断に影響を与える可能性があります。前述のように、sgRNAは標的配列に相補的な配列（約20nt）で構成され、これにエンドヌクレアーゼ活性を活性化するPAM配列が続きます。PAMに隣接する10〜12nt（「シード配列」と呼ばれる）でCas9の特異性には十分であることが示されましたが、Wuらは、触媒的に不活性なCas9では、特異性には1〜5塩基対のシード配列のみが必要であることを示しました。^[31]これは後に他の研究でも証明されました。 Cas9 タンパク質の結合は、さらにいくつかのメカニズムによって影響を受けます。

• シード配列は、ゲノム内のシードと PAM の頻度を決定し、Cas9 sgRNA 複合体の有効濃度を制御します。
• ウラシルを多く含む種子はsgRNAレベルが低く、配列中の複数のウラシルがsgRNA転写の終結を引き起こす可能性があるため、特異性が高くなる可能性が高い。^{[31] [32]}
• crRNA の 5' 末端のミスマッチは、重要な部位が PAM マトリックスに隣接しているため、より許容されます。配置方法に基づいて、単一および二重のミスマッチも許容されます。
• 最近の研究では、Renらは変異誘発効率とsgRNAのGC含有量の間に関連があることを観察した。良好な編集にはPAMに隣接する少なくとも4〜6bpが必要である。^[33]
• gRNAを選択する際、PAMに隣接するシードの最初の塩基としてシトシンよりもグアニンが優先され、5'の最初の塩基としてシトシンが優先され、配列の中央にはアデニンが優先されます。この設計は、G四重鎖の形成に関連する安定性に基づいています。^{[31] [32] [34]}
• KimらはChIPを実施し、精製したCas9をsgRNAとともに添加するとオフターゲット効果が低くなることを示しました。これは、これらの効果を引き起こす要因がさらに存在することを意味します。^[35]

CpG部位のDNAメチル化は、細胞内のCas9と他の因子の結合効率を低下させることに注意することが重要です。したがって、エピゲノム編集の将来に向けてさらに研究されるエピジェネティックなつながりがあります。^[36]

PAM 配列内の変異は sgRNA の活性にも影響を及ぼし、ひいては sgRNA 自体にも影響を及ぼす可能性があります。一般的に使用されている Cas9 システムでは、PAM モチーフは 5' NGG 3' であり、N は 4 つの DNA ヌクレオチドのいずれかを表します。PAM 配列の要件は、一部の領域に目的の遺伝子改変を行うための利用可能なターゲット配列があるため、特異性の問題を引き起こす可能性があります。あるレポートでは、これまでヒトエクソン内の固有の Cas9 ターゲットであると想定されていたサイトの 99.96% に、NAG または NGG PAM とシード配列内の 1 つの塩基の不一致を含む潜在的なオフターゲット効果がある可能性があると述べられています。^[37]

塩基が欠落している（または削除されている）オフターゲット部位と余分な塩基（または挿入されている）オフターゲット部位は、それぞれRNAバルジとDNAバルジと呼ばれ、Cas9の特異性と切断活性に影響を及ぼします。Linらは、 sgRNA配列から塩基を追加または削除することでこれらのバルジを模倣し、sgRNAの塩基削除によってRNAバルジが生成され、塩基挿入によってDNAバルジが生成されるようにしました。^[7] NHEJを介して変異率を研究することで、彼らは次の結果を得ました。

• 純粋な DNA バルジの場合、突然変異は十分に許容されました (つまり、Cas9 切断活性は依然として優勢でした)。バルジ許容領域には、PAM からの 7 つの塩基とシード配列の 5' 末端および 3' 末端が含まれていました。これにより、バルジがゼロの場合と同等か、または若干高い (場合によっては) 突然変異が発生しました。
• 純粋にRNAバルジの場合、DNAバルジと比較して多くの位置でCas9活性が高く誘導されました。この特徴は、RNAがDNAよりも柔軟性が高く、RNAバルジとの結合ペナルティが小さく、結果として耐性が高くなり、オフターゲット変異が多くなるという事実に起因しています。^[38]
• sgRNA 配列の GC 含有量が高いほど、耐性が高くなり、オフターゲット変異率が高くなります。
• 2bp-5bp のバルジは、単一の 2bp バルジよりも耐性が高く、突然変異を誘発しやすいことが顕著でした。

広く使用されているStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）ヌクレアーゼは効果的ですが、高頻度で望ましくないオフターゲット変異を引き起こします。ゲノム全体のオフターゲット変異を減らすために、ヌクレアーゼ変異、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列の改変、ガイドRNA（gRNA）の切断、新しいヌクレアーゼの発見など、いくつかのエンジニアリングおよびスクリーニング方法が説明されています。^[39]たとえば、2013年にFuらは、 gRNAを20 bp未満の長さから17または18 bpに切断することで、ヌクレアーゼのターゲット特異性が最大5,000倍に増加し、3塩基を超えるミスマッチの発生はほとんど発生しないと報告しました。^[14]

spCas9ヌクレアーゼは、特異性と制御性を向上させるために、さまざまな方法で変異させることもできます。ヌクレアーゼドメインは、互いに独立して、Cas9ニッカーゼと呼ばれるものに変異させることができます。これらのヌクレアーゼには、1つの活性ヌクレアーゼドメインと1つの不活性ヌクレアーゼドメインがあり、1本鎖切断を実行する複合体を形成します。^[4] Cas9ニッカーゼはタンデムで使用することができ（ペアニッカーゼと呼ばれます）、これは交互の鎖で2つの一本鎖「切断」を実行します。^[4]この戦略を使用すると、両方のCas9ニッカーゼがターゲットに共存し、結合して切断する必要があり、これにより、オフターゲットインデルの可能性が大幅に減少します。^[4]また、ペアニッカーゼによって切断されたDSBは、平滑末端ではなく長いオーバーハングを持つため、標的挿入の制御が向上します。

モノマーヌクレアーゼはオフターゲット効果が高いことが多いため、二量体化は魅力的な戦略です。二量体システムでは、両方のヌクレアーゼがそれぞれのターゲットまたは「半分の部位」に結合し、相互作用して二量体化して切断を開始する必要があります。これにより、オフターゲット効果の可能性が大幅に減少します。ZFNおよびTALENで使用される二量体化依存性FokIヌクレアーゼドメインの信頼性と、CRISPR-cas9のシンプルさを組み込んだ方法が開発されました。^{[17] FokIヌクレアーゼはもともと}Flavobacterium okeanokoitesで発見され、二量体化が活性化された場合にのみDNAを切断します。基本的に、研究者らはこのヌクレアーゼを、不活性なCas9ヌクレアーゼ（Fok1-dCas9）を含むCRISPR複合体に融合しました。^[17] gRNAはCRISPR複合体をターゲット部位に導きますが、「切断」は二量体化したFok1によって行われます。 Fok1-dCas9戦略は、検出可能なオフターゲット効果を10,000倍減少させると推定されており、非常に正確で特異的なゲノム編集を必要とするアプリケーションに効果的です。^{[17] [40]}

gRNA標的に加えて、Cas9は特定の2〜6ヌクレオチド配列PAMに結合する必要がある。一般的に使用されるSpCas9システムでは、PAMモチーフは5' NGG 3'であり、Nは4つのDNAヌクレオチドのいずれかを表す。PAM配列の要件は、一部の領域に目的の遺伝子改変を行うための利用可能な標的配列がないため、特異性の制限を引き起こす可能性がある。PAM配列は、非標準的なNAGおよびNGAモチーフに編集することができ、これにより特異性が向上するだけでなく、オフターゲット効果も減少する。^[41] D1135E変異体はPAMの特異性を変えるように見える。D1135E変異体はオフターゲット効果を減らし、SpCas9の特異性を高める。^[41]追加の変異体であるSpCas9-HF1も、Cas9の特異性に好ましい改善をもたらす。^[42]非特異的DNA接触を形成することが知られている置換の組み合わせがいくつか特定されています（N497A、R661A、Q695A、およびQ926A）。^[42]これらの残基の4重置換（後にSpCas9-HF1と命名）は、GUIDE-seq実験で検出されたように、オフターゲット効果が極めて低いです。^[42] SpCas9-HF1やD1135Eなどのバリアントは、オフターゲット変異の割合を減らすために、組み合わせてテストし、既存のSpCas9ベクターに簡単に追加できます。さらに、上記のエンジニアリング戦略の多くを組み合わせて、ますます堅牢で信頼性の高いRNA誘導ヌクレアーゼ編集ツールを作成できます。指向性進化を使用して、特定のターゲット配列に対するヌクレアーゼ活性を減らすこともできます。これにより、SpartaCas（野生型SpCas9と比較してD23A、T67L、Y128V、およびD1251Gの変異を含む）などのバリアントが生まれます。^[43]

CRISPR干渉（CRISPRi）とCRISPR活性化（CRISPRa）も開発されている。^[44]これらのシステムは、不可逆的な遺伝子改変を引き起こすことなく、DNAレベルで遺伝子転写を正確に変更することができる。^[44]さらに、DNAに直接作用することにより、RNAiに比べて一般的に特異性と予測可能性が高くなる。^[45] CRISPRi/aはすべての実験でゲノム編集を置き換えることはできませんが、場合によっては効果的な代替手段として機能することができます。CRISPRiとCRISPRaは、DNAを切断できない不活性化Cas9（dCas9）酵素を使用しますが、転写活性化因子と抑制因子を送達して、目的の遺伝子発現を高精度で調節することができます。^[44] 現在、CRISPRiのオフターゲット効果は最小限であり、一塩基のミスマッチに対する応答と感度が低下しています。^[44]重要なのは、非特異的な効果が必然的に発生した場合、それらは可逆的で、時間依存的であり、DNA編集よりも損傷が少ないため、可能であればオフターゲットの負担を制限できる効果的な代替手段となることです。CRISPR-cas13bは、タイプIV CRISPR-Casシステム（一般的に使用されるタイプIIとは対照的）を使用して、特定のRNA配列をターゲットにして編集できます。^[46]このようなRNA編集プラットフォームは、DNAを変更することなく、mRNA、したがってタンパク質の翻訳を特異的に編集する能力を備えています。これは、成功すれば不可逆なオフターゲット変異の負担を軽減できる有望な技術を表しています。

オフターゲット変異を回避するために慎重な措置を講じたとしても、また成功したとしても、意図しない変異をスクリーニングするために確認スクリーニングを行う必要があります。現在、そのようなスクリーニングにはバイアスのある方法とバイアスのない方法が多数ありますが、in vitro方法は 2 つしかありません。これらはすべて以下にリストされています。

通常の標的シーケンシングの場合、偏ったアプローチでは意図したキャプチャ領域の結果しか得られず、予期しない変異が画面に表示されないため検索が妨げられます。簡単で安価ですが、ターゲットサイトが追加されると時間がかかり、高価になります。エクソームシーケンシングは、エクソームキャプチャを利用してゲノムのタンパク質コード領域を取得します。偏りはありませんが、ゲノムの非コード領域にオフターゲット変異は得られません。全ゲノムシーケンシングの場合、オフターゲット変異についてゲノム全体がスクリーニングされます。現在、この方法は高価であり、エクソームシーケンシングと同様に、全ゲノムでも推論を行うために参照ゲノムが必要です。^[47]

BLESSは、ゲノム内のDSBをスクリーニングすることで、オフターゲット変異を検出し定量化する最も簡単な方法です。この方法は、ストレプトアビジン上で直接インサイチュー切断標識濃縮に依存しています。2013年に開発された^[48] BLESSは、DSB末端をビオチンで連結することによって実行されます。つまり、ビオチン化です。その後、ストレプトアビジンを使用して、連結された末端を分離/収集します。連結された配列をビオチン化された配列に追加し、この最終混合物を配列決定して、オフターゲット変異の位置を取得します。BLESSは本質的に偏りがないため、DSBに関与または関連するタンパク質ではなく、ゲノム内の変異部位に関する情報を提供します。ただし、BLESSは実験時の変異のみを検出でき、以前に形成されて修復された変異は検出できません。^[49]

線形増幅介在ハイスループットゲノムワイド転座シーケンシング（LAM-HTGTS）は、DSB間の結合によって引き起こされる転座イベントを追跡するために開発された方法です。^[50] TALENとCRISPR-Cas9のオフターゲット変異を検出するために開発されたこの技術は、DSBの末端結合によるDNA修復に基づいています。ヌクレアーゼが追加されると、オンターゲット変異とオフターゲット変異が生成されます。これとともに、切断されるベイト配列があります。したがって、ベイト配列染色体以外の染色体上に別のDSBが発生した場合、両方が結合して転座につながります。ベイト配列はわかっているので、この転座配列はプライマーで増幅されます。転座がない場合、ベイト配列のみが増幅されるのを防ぐために、その中に切断される制限部位があります。増幅された DNA は、その後、オフターゲット変異による大規模なゲノム再編成を研究するために配列決定されます。1 つの欠点は、ベイトと別の DSB が同時に存在する必要があることです。

ヌクレアーゼ活性によるオフターゲット変異を見つけるもう 1 つの方法は、GUIDE-Seq法です。GUIDE-seq (Genome Wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing) は、NHEJ を介して二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド (dsODN) を DSB に組み込むことに基づいています。その増幅の後にシーケンスが行われます。dsODN のシーケンスには 2 つのプライマーが使用されるため、DSB の両側の領域が DSB とともに増幅されます。これにより、オフターゲット変異のマッピングが可能になります。この技術は、以前に知られているすべてのオフターゲット サイトと、頻度が 0.03% という低い新しいサイトを特定するために適用されています。ただし、BLESS と同様に、GUIDE-seq は調査時に存在する DSB のみを検出できます。

現在のin vitro法の 1 つである Digenome-Seq は、ゲノムを切断する Cas9 の特性を利用して、ゲノム全体の偏りのないプロファイルを取得します。この方法では、Cas9 を gDNA に追加し、その後の効果をハイスループット シーケンシングを使用して研究します。同じヌクレアーゼによってフラグメントが形成されるため、これらのフラグメントの末端をマッピングして整列させることができます。2 つの大きな利点は、一度に最大 10 個の gRNA を研究できることと、0.01% という低い頻度でターゲットを識別できることです。^[9]ただし、主な利点は、この方法がin vitro であることです。つまり、Cas9 によって導入された DSB は DNA 修復機構によって処理されないため (BLESS や GUIDE-seq とは異なります)、すべての可能性のあるオフターゲット変異体が含まれます。ただし、大量の偽陽性につながる可能性もあります。^[51]

オフターゲット変異を検出するin vitro法に最近追加されたのがCIRCLE-seqです。Beacon genomics（GUIDE-seqと共に）によってライセンス供与されている^[52] CIRCLE-seqは、大きなサンプルサイズと読み取り深度（約4億回の読み取り）の必要性や、低頻度の切断イベントの特定を困難にする高いバックグラウンドなど、Digenome-seqの欠点を解消することを目的としています。^{[53]ランダムに切断されたDNAの変換を作成して選択するために、}制限酵素に依存しない戦略を採用しています。切断時に、ターゲットDNAはステムループを形成し、これにアダプターを追加してシーケンスできます。これは可能であることが証明されましたが、他の可能性では検出に何倍もの差が生じました。2番目のケースでは、シーケンスはCas9を使用して切断され、半分のサイトで再度切断されると、円形のカットを利用できます（これがCIRCLE-seqという名前の理由です）。環状化によって特定されたほぼすべてのサイトには、検出された線形サイトと新しいサイトの両方が含まれています。これは、CIRCLE-seq が切断間で偏りを生じず、強力な低頻度切断も取得することを示唆しています。さらに、読み取り側が 1 つしかない他の方法と比較して、切断の両側から切断部位をシーケンスするのに役立ちます。

Cas9などのヌクレアーゼは、ランダム化された標的ライブラリによってin vitroで攻撃されることもあります。^[54]切断されたライブラリメンバーと切断されていないライブラリメンバーを定量化するアダプターライゲーションにより、ヌクレアーゼの特異性プロファイルを偏りなく測定できます。SpCas9によるバーコード化された標的ライブラリ（BLT）の切断の測定により、特異性プロファイルはガイド特異的であり、ガイド配列とヌクレアーゼ自体に依存することが示されました。それぞれの特定のCas9-gRNA複合体に基づく偏りのない特異性プロファイルは、in vitro切断のガイド特異的予測モデルの構築に使用できます。

遺伝子編集技術が臨床で安全かつ広く使用されるようになるためには、オフターゲット改変の割合を時代遅れにする必要がある。遺伝子治療の安全性は最大の懸念事項であり、特に臨床試験ではオフターゲット改変が候補製品のさらなる開発を妨げる可能性があるためである。^[55]おそらく、現代の遺伝子治療の最もよく知られた例は、B細胞リンパ腫の治療に使用されるCAR-T療法である。オフターゲット切断の割合を制限するために、この療法では、バックグラウンドのオフターゲット相互作用がほとんどまたは全くないことが証明されている、非常に特異的で微調整されたTALENを使用する。^[55] CAR-T免疫療法は体外手順であり、つまり、患者の免疫細胞（この場合はT細胞）を抽出し、デザイナーヌクレアーゼを使用して編集する。^[55] TALENシステムの開発は費用がかかり、時間がかかるが、研究とエンジニアリングの改変により、オフターゲット相互作用の割合は大幅に制限されている。しかし、治療を受けている患者は今後も頻繁にモニタリングされ、オフターゲット効果や免疫原性反応を分析し、新たな遺伝子治療が臨床試験に導入される際に考慮に入れることができるように、今後15年間はモニタリングされる予定である。^[56]

フェーズ I/II臨床試験では、後天性免疫不全症候群 (AIDS) の患者 12 名を登録し、ZFN 改変自己ヘルパー T 細胞投与の安全性と有効性をテストしました。^[57]標的を欠失させることで、カスタム ZFN は CC ケモカイン受容体 5 ( CCR5 ) 遺伝子を無効にします。この遺伝子は、HIV ウイルスが細胞に侵入するために使用する共受容体をコードしています。^[58] CC ケモカイン受容体間の配列相同性が高いため、この ZFN はCCR2 も切断し、オフターゲットの約 15kb の欠失とゲノム再編成を引き起こします。^{[58] [59]これらの}CCR2改変の影響はまだわかっておらず、現在までに副作用は報告されていません。しかし、CCR2 は神経系や代謝系で多くの重要な役割を果たすことが知られています。^{[60] [61]}

CRISPR-cas9 を使用した遺伝子操作による遺伝子ドライブは現在テスト中であり、侵入種や病原体ベクターを排除するための戦略として提案されています。生物を遺伝子操作して内因性の配列特異的エンドヌクレアーゼを発現させることにより、標的 (生殖遺伝子など) を反対側の染色体で切断することができます。^[62]標的での DSB は相同修復につながり、生物を目的の標的配列に対して効果的にホモ接合にします。ホーミング ドライブとして知られるこの戦略は、重要な遺伝子に影響を与えたり劣性不妊を誘発したりすることで、個体群を抑制できます。ただし、このようなシステムが野生に放出された場合、CRISPR-cas9 システムは無期限に機能し続けます。その後の世代ごとに、オフターゲット突然変異の可能性が高まり、これらの突然変異が種に与える影響は確率的になります。オフターゲット突然変異は、エンドヌクレアーゼの発現を維持しながら、遺伝子ドライブの抑制特性を無効にする可能性があります。このような状況では、標的種と他の種の間で遺伝子流動のリスクが高まり、望ましくない結果につながる可能性があります。^[63]

ゲノム編集の利用増加と、それが最終的に臨床使用へと移行したことで、この技術の真のオフターゲット負担をめぐる論争が巻き起こっています。

2017年5月30日、Nature Methodsに2ページの通信記事が掲載され、以前に生体内遺伝子修復実験に使用されたマウスの配列を解析した後、異常に多くのオフターゲットSNVとインデルが報告されました。 ^[64]同じグループによって完了した以前の実験では、CRISPR-cas9システムを使用してPde6b遺伝子のY347X変異を修正することにより、盲目のマウス系統（ rd1 ）の視力を正常に回復させました。 ^[65]実験の完了後、遺伝子が修正された2匹のマウスの全ゲノム配列が決定され、コントロールおよび既知のマウス系統のゲノムと比較されました。1,600を超えるSNVと128のインデルが発見され、そのうち1,397のSNVと117のインデルは2匹の編集されたマウス間で共有されており、オフターゲット効果がランダムではないことを示唆しています。これらのオフターゲット変異の位置を予測しようとするアルゴリズムは、圧倒的多数の遺伝子座で失敗しました。比較すると、2016年の全エクソーム配列解析研究では、編集されたマウス5匹で19のSNVと3つのインデルが見つかったのに対し、Schaeferらは、編集されたマウス2匹で115のエクソンSNVと9つのインデルを発見した。 ^[66]多くの専門家がこの論文に反対し、ジャーナル記事[ ^66]やソーシャルメディアを通じて批判し、最初の論文では異常なCRISPR処理が使用され、サンプルサイズが有意には小さすぎた（n = 2）と示唆した。Nature Methodsは、この論文について2つの編集ノートを発行し、^[67]、後に撤回した。^[68]それにもかかわらず、オフターゲット率は、細胞培養実験と比較して生体内で一貫してより頻繁に発生し、特にヒトで一般的であると考えられている。^{[3] [7]}

• 物議を醸した CRISPR 論文が 2 度目の編集注記を獲得 - Retraction Watch