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低分子干渉RNA（siRNA ）は、短鎖干渉RNAまたはサイレンシングRNAとも呼ばれ、マイクロRNA（miRNA）に似た、通常20～24塩基対の長さの二本鎖非コードRNA分子の一種で、 RNA干渉（RNAi）経路内で機能します。相補的なヌクレオチド配列を持つ特定の遺伝子の発現を、転写後にメッセンジャーRNA（mRNA）を分解し、翻訳を阻害することによって妨害します。[ 1 ] [ 2 ]これは、1998年にワシントンDCのカーネギー科学研究所のアンドリュー・ファイアと、ウースターのマサチューセッツ大学のクレイグ・メロによって発見されました。
天然に存在するsiRNAは、リン酸化された5'末端と水酸化された3'末端、および2つの突出ヌクレオチドを持つ短い（通常20～24 bp）二本鎖RNA（dsRNA）という明確な構造を持っています。 2001年の時点で、Dicerと呼ばれる酵素が「RNA干渉の開始段階」（長いdsRNAと短いヘアピンRNAからのsiRNAの生成）を触媒することが示唆されていました。[ 3 ]
siRNAはトランスフェクションによって細胞に導入することもできます。原理的には、相補配列を持つ合成siRNAによってあらゆる遺伝子をノックダウンできるため、 siRNAは「ポストゲノム時代」における遺伝子機能の検証や薬剤標的化のための重要なツールとなっています。
1998年、ワシントンDCのカーネギー科学研究所のアンドリュー・ファイアと、ウースターのマサチューセッツ大学のクレイグ・メロは、線虫Caenorhabditis elegansの遺伝子発現の研究中にRNAiメカニズムを発見した。[ 4 ] 2人は2006年にRNAiの研究でノーベル賞を受賞した。 [ 5 ] siRNAとその転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）における役割は、イギリスのノーウィッチにあるセインズベリー研究所のデビッド・ボールコムの研究グループによって植物で発見され、 1999年にScience誌で報告された。[ 6 ]トーマス・トゥシュルらはすぐにNature誌で、合成siRNAが哺乳類細胞でRNAiを誘導できることを報告した。[ 7 ]これらの発見により、生物医学研究や医薬品開発にRNAiを活用することへの関心が急激に高まった。
2017年の時点で、siRNAのヒトへの応用は成功に向けて大きな障害に直面しており、その1つが「オフターゲット効果」であった。[ 2 ]その10年が終わる頃には、これらの治療法が自然免疫を誘発する可能性が議論されていた。[ 4 ]2019年の時点では、動物モデルはヒトにおけるこの反応の程度を正確に再現することに成功していなかった。[ 4 ]そのため、siRNA療法の効果を研究することは困難であった。
2020年現在、siRNA療法は（例えば米国ではFDAによって）承認されており、課題を克服するための新しい方法が確立されています。これには、承認され市販されている治療法、承認を目指してパイプラインにあるいくつかの治療法、および開発の初期段階にあるその他の治療法が含まれます。[ 8 ][ 9 ]
天然siRNAが翻訳抑制を介して遺伝子サイレンシングを引き起こすメカニズムは以下のとおりである。
siRNAもmiRNAに似ていますが、miRNAはより短いステムループRNA産物から派生しています。miRNAは通常、翻訳の抑制によって遺伝子をサイレンシングし、作用の特異性はより広いのに対し、siRNAは通常、翻訳前にmRNAを切断することで100%の相補性をもってより高い特異性で作用します。[ 10 ] [ 11 ]
外来性siRNAのトランスフェクションによる遺伝子ノックダウンは、特に急速に分裂する細胞では一時的なものにすぎない。これは、siRNAの発現ベクターを作成することで克服できる可能性がある。siRNA配列は、2つの鎖の間に短いループを導入するように改変される。結果として得られる転写産物は短いヘアピンRNA（shRNA）であり、これは通常の方法でDicerによって機能的なsiRNAに処理される。 [ 12 ]典型的な転写カセットは、RNAポリメラーゼIIIプロモーター（例えばU6またはH1）を使用して、小型核RNA（snRNA、ここでU6はRNAスプライシングに関与し、H1はヒトRNase PのRNase成分である）の転写を指示する。結果として得られるsiRNA転写産物は、その後Dicerによって処理されると考えられている。
細胞を圧迫することによって遺伝子ノックダウン効率を向上させることもできる。[ 13 ]
RNAiにおけるsiRNAの活性は、主にRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）への結合能力に依存している。二本鎖siRNAがRISCに結合すると、エンドヌクレアーゼによってセンス鎖がほどけて切断される。残ったアンチセンス鎖-RISC複合体は、標的mRNAに結合して転写サイレンシングを開始することができる。[ 14 ]
siRNAはRNAiにおける役割に加えて、遺伝子発現を活性化することもあり、この現象は「RNA活性化」またはRNAaと呼ばれています。これは、遺伝子プロモーターを標的とする合成siRNA（「小型活性化RNA」（saRNA）と呼ばれる）が標的遺伝子の強力な転写活性化を誘導することが発見されたときに初めて観察されました。[ 15 ] RNAaは保存されたメカニズムであることが実証されており、昆虫、C. elegans、植物から哺乳類（ヒトを含む）まで、種を超えて観察されています。[ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]
RNAaのメカニズムは、saRNAによるプロモーター領域の標的化を伴い、転写機構の動員と遺伝子発現を促進するエピジェネティックな変化につながります。このプロセスには、多くの場合、アルゴノートタンパク質（特にAgo2）、RNAヘリカーゼA（RHA）、およびCTR9を含むRNA誘導転写活性化（RITA）複合体が関与します。[ 20 ] [ 21 ]内因性miRNAもRNAaを媒介することができ、これらの小さなRNAの調節的役割は遺伝子サイレンシングを超えて拡大します。
現在、いくつかのsaRNAベースの治療薬が臨床開発段階にある。MiNA Therapeuticsが開発したMTL-CEBPAはCEBPA遺伝子を標的とし、肝臓がんの第II相臨床試験段階にある。[ 22 ] Ractigen Therapeuticsが開発したRAG-01はp21遺伝子を標的とし、非筋層浸潤性膀胱がん（NMIBC）の第I相臨床試験段階にある。[ 23 ]これらの臨床試験は、RNAa現象を新たな治療戦略へと応用する上で重要な一歩となる。
リチャード・カーシューらは、2004年のショウジョウバエにおけるsiRNA/miRNAサイレンシング経路の研究において、siRNA誘導転写後遺伝子サイレンシングはRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）の組み立てによって開始されると述べている。RISCは、特定の遺伝子をコードするmRNA分子を切断することによって、その遺伝子の発現をサイレンシングする。[ 24 ]このシステムでプロセスを開始するには、2本のsiRNA鎖のうちの1本であるアンチセンスガイド鎖がRISCにロードされ、もう1本の鎖であるセンスパッセンジャー鎖が分解されると彼らは述べている。さらに、ショウジョウバエの特定のDicer酵素がガイド鎖をRISCにロードする役割を担っている可能性があると述べている。[ 24 ]その後、2009年の展望では、「siRNAはRISCをスキャンして、 mRNA分子上の完全に相補的な配列に誘導する」という見解が提示されている。 [ 25 ]
mRNA分子の切断はRISCのアルゴノートタンパク質のPiwiドメインによって触媒されると考えられており、5'末端から数えてsiRNA残基10と11に対合する標的ヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断することによってmRNA分子が正確に切断される。 [ 26 ]オルバンとイザウラルデはショウジョウバエ細胞でのさらなる研究に関して、「この最初のエンドヌクレアーゼ切断の後、mRNAは細胞エキソヌクレアーゼによってさらに分解される」と述べている。彼らは、このシステムでは5'断片は「エキソソームによって3'末端から急速に分解される」のに対し、3'断片は5'-3'エキソリボヌクレアーゼであるXRN1によって5'末端から分解されることを示している。[ 27 ]切断後に標的mRNA鎖がRISCから解離することで、より多くのmRNAがサイレンシングされることが可能になる。この解離プロセスは、ATP加水分解によって駆動される外因性因子によって促進されると考えられる。[ 26 ]
標的mRNA分子の切断が起こらない場合もある。場合によっては、切断部位付近のsiRNAと標的mRNAのミスマッチによって、ホスホジエステル骨格のエンドヌクレアーゼ切断が抑制されることがある。また、標的mRNAとsiRNAが完全にペアリングされていても、RISCのアルゴノートタンパク質がエンドヌクレアーゼ活性を持たない場合もある。[ 26 ]このような場合、代わりにmiRNA誘導機構によって遺伝子発現が抑制される。[ 2 ] [ 25 ]
Piwi相互作用RNA（piRNA）は、最近発見された長さ21～35ヌクレオチドの小型非コードRNA（ncRNA）の一種です。これらは遺伝子発現調節、トランスポゾンサイレンシング、ウイルス感染阻害に関与しています。MongaとBanerjeeが最初の報告の要約で述べたように、「かつてはncRNAの『ダークマター』と考えられていたpiRNAは、さまざまな生物の複数の細胞機能において重要な役割を担うことが明らかになりました。」[ 28 ]特に、2019年時点ではsiRNAではなく、トランスポゾンのサイレンシングに関与していることが特徴づけられています。[ 29 ]
植物（ Arabidopsis thaliana）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、線虫（C. elegans ）などの多くのモデル生物が、小型非コードRNAによる転写遺伝子サイレンシングの研究に用いられてきた。ヒト細胞では、10年前に外来siRNAが緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子を駆動するトランスジェニック伸長因子1αプロモーターをサイレンシングした際に、RNAによる転写遺伝子サイレンシングが観察された。[ 30 ] RNAi機構が関与する転写遺伝子サイレンシング（TGS）の主なメカニズムには、DNAメチル化、ヒストン翻訳後修飾、標的遺伝子周辺のクロマチンリモデリングによるヘテロクロマチン状態への移行などが含まれる。[ 30 ]
siRNAは、RNA誘導性転写抑制（RITS）複合体に組み込まれる。活性化されたRITS複合体は、siRNAと一致するDNAの周囲にヘテロクロマチンの形成を誘発し、そのDNA領域の遺伝子を効果的に抑制する。
siRNAの強力な応用例の1つは、標的配列と非標的配列を1ヌクレオチドの違いで区別できることです。このアプローチは、疾患を引き起こす変異アレルが野生型アレルと1ヌクレオチド（nt）だけ異なる優性機能獲得型（GOF）疾患のサイレンシングにおいて治療的に非常に重要であると考えられています。このような1ヌクレオチドの違いを区別できるタイプのsiRNAは、アレル特異的siRNAと呼ばれます。[ 2 ]
ASP-RNAiは、RNAiの革新的なカテゴリーであり、2つの遺伝子間の単一ヌクレオチドの違いを特異として、対応する正常アレル発現を維持しながら優性変異アレルを抑制することを目的としています。[ 2 ] ASP-siRNAは、常染色体優性遺伝性疾患の治療のための新規かつより優れた治療法となる可能性があり、特にハンチントン病（HD）、DYT1ジストニア（Gonzalez-Alegre et al. 2003, 2005）、アルツハイマー病（Sierant et al. 2011）、パーキンソン病（PD）（Takahashi et al. 2015）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）（Schwarz et al. 2006）、マチャド・ジョセフ病（Alves et al. 2008）など、野生型アレル発現が生物の生存に不可欠な場合において有効です。これらの薬剤の治療効果は、表皮水疱症単純型（Atkinson et al. 2011）、表皮剥離性掌蹠角化症（EPPK）（Lyu et al. 2016）、格子状角膜ジストロフィーI型（LCDI）（Courtney et al. 2014）などの様々な皮膚疾患に対しても評価されている。[ 2 ]
RNAiは他の多くの経路と交差します。2010年の時点では、siRNAの実験的導入によって非特異的な効果が引き起こされることは驚くべきことではありませんでした。[ 31 ] [ 32 ]哺乳類細胞がsiRNAなどの二本鎖RNAに遭遇すると、それをウイルスの副産物と誤認して免疫応答を起こす可能性があります。さらに、構造的に関連するマイクロRNAは、標的mRNAとの不完全な相補性塩基対相互作用を介して遺伝子発現を調節するため、siRNAの導入は意図しないオフターゲットを引き起こす可能性があります。siRNAの化学修飾は、単一ヌクレオチド特異性の喪失につながる熱力学的特性を変化させる可能性があります。[ 33 ]
siRNA を過剰に導入すると、自然免疫応答の活性化により非特異的な事象が発生する可能性がある。[ 34 ]これまでの証拠のほとんどは、これがおそらく dsRNA センサー PKR の活性化によるものであることを示唆しているが、レチノイン酸誘導性遺伝子 I (RIG-I) も関与している可能性がある。[ 35 ]トール様受容体 7 (TLR7) を介したサイトカインの誘導も報告されている。siRNA の化学修飾は、遺伝子機能および治療用途における自然免疫応答の活性化を低減するために用いられる。非特異的効果を低減する有望な方法の 1 つは、siRNA をマイクロ RNA に変換することである。[ 36 ]マイクロ RNA は自然に存在し、この内因性経路を利用することで、比較的低濃度の siRNA で同様の遺伝子ノックダウンを達成し、非特異的効果を最小限に抑えることができるはずである。
siRNAを遺伝子ノックダウンツールとして使用する際のもう一つの課題はオフターゲットです。[ 32 ]この場合、不完全な相補性を持つ遺伝子がsiRNAによって意図せずダウンレギュレーションされ（実際にはsiRNAがmiRNAとして作用する）、データ解釈の問題や潜在的な毒性につながります。しかし、これは適切な対照実験を設計することで部分的に対処でき、現在、オフターゲットのないsiRNAを生成するためのsiRNA設計アルゴリズムが開発されています。マイクロアレイ技術などによるゲノムワイド発現解析を使用してこれを検証し、アルゴリズムをさらに改良することができます。アナスタシア・クヴォロワの研究室による2006年の論文では、siRNAの2番目の位置以降の6または7塩基対の長さの領域が、オフターゲット遺伝子の3'UTR領域と一致することが示唆されています。[ 37 ] siRNAオフターゲット予測ツールはhttp://crdd.osdd.net/servers/aspsirna/asptar.phpで利用可能であり、ASPsiRNAリソースとして公開されています。[ 2 ]
プレーンRNAは免疫原性が低い可能性があるが、RNA-タンパク質複合体に対しては抗体が容易に生成される。このような抗体は多くの自己免疫疾患で見られる。タンパク質に結合したsiRNAに対する抗体の報告はまだない。siRNA送達法の中には、ポリエチレングリコール（PEG）をオリゴヌクレオチドに結合させて排泄を減らし、循環半減期を改善するものがある。しかし、因子IXに対するPEG化RNAアプタマーの大規模な第III相臨床試験は、RNAのPEG部分に対する重篤なアナフィラキシー反応のため、Regado Biosciencesによって中止せざるを得なかった。この反応は一部の症例で死亡に至り、PEG化オリゴヌクレオチドが関与する場合のsiRNA送達について重大な懸念を引き起こしている。[ 38 ]
siRNAを細胞に導入すると、通常、多くの遺伝子の発現が低下しますが、遺伝子の発現上昇も観察されます。遺伝子発現の上昇は、内因性miRNAの予測される標的遺伝子によって部分的に説明できます。150を超えるsiRNA導入実験の計算解析は、外因性siRNAが内因性RNAi機構を飽和させ、内因性miRNA制御遺伝子の脱抑制を引き起こすというモデルを支持しています。[ 39 ]したがって、siRNAは、siRNAと標的との部分的な配列一致によるmRNAの意図しないダウンレギュレーションなど、望ましくないオフターゲット効果を引き起こす可能性がありますが、RNAi機構の飽和は、miRNA制御遺伝子の脱抑制を伴う別の明確な非特異的効果であり、データ解釈や潜在的な毒性において同様の問題を引き起こします。[ 40 ]
siRNAは、その治療特性を高めるために化学的に修飾されてきた。RNAiが治療効果を発揮するためには、短鎖干渉RNA（siRNA）を標的組織の細胞内の作用部位に送達する必要がある。このような化学修飾の詳細なデータベースは、siRNAmodとして科学文献で手動でキュレーションされている。[ 41 ] siRNAの化学修飾は、意図せず単一ヌクレオチド特異性の喪失につながる可能性もある。[ 42 ]
siRNAによるRNAiは、基本的にあらゆる目的遺伝子をノックダウンできるため、基礎生物学[ 43 ]と応用生物学[ 44 ]の両方で大きな注目を集めている。
siRNAおよびRNAiベースの治療法における最大の課題の1つは、細胞内送達である。[ 45 ] siRNAは安定性と薬物動態特性も弱い。[ 46 ]ナノ粒子を介したsiRNAの送達は有望であることが示されている。[ 45 ]生体内のsiRNAオリゴは、血漿および組織のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる分解を受けやすく[ 47 ]、ヒトの眼などの局所的な送達部位ではわずかな効果しか示していない。[ 48 ]純粋なDNAを標的生物に送達することは、その大きなサイズと構造により膜を容易に通過できないため困難である。[ 45 ] siRNAオリゴは、21～23ヌクレオチドという小さなサイズのため、この問題を回避する。[ 49 ]これにより、ナノベクターと呼ばれるナノスケールの送達媒体を介した送達が可能になる。[ 48 ]
siRNA送達に適したナノベクターは、siRNAの分解を防ぎ、標的臓器にsiRNAを濃縮し、siRNAの細胞内取り込みを促進する必要がある。[ 47 ] siRNAナノベクターの主な3つのグループは、脂質ベース、非脂質有機ベース、無機である。[ 47 ]脂質ベースのナノベクターは固形腫瘍へのsiRNA送達に優れているが、[ 47 ]他の癌では、シクロデキストリンベースのナノ粒子などの異なる非脂質ベースの有機ナノベクターが必要になる場合がある。[ 47 ] [ 50 ]
脂質ベースのナノ粒子を介して送達されるsiRNAは、中枢神経系（CNS）疾患の治療に有効であることが示されている。[ 51 ]中枢神経疾患は珍しいものではないが、血液脳関門（BBB）が潜在的な治療薬の脳へのアクセスを阻害することが多い。[ 51 ] BBB表面の排出タンパク質を標的としてサイレンシングするsiRNAは、BBB透過性の増加を引き起こすことが示されている。[ 51 ]脂質ベースのナノ粒子を介して送達されるsiRNAは、BBBを完全に通過することができる。[ 51 ]
siRNA送達における大きな難点は、オフターゲットの問題である。[ 45 ] [ 48 ]遺伝子は両方向に読み取られるため、意図したアンチセンスsiRNA鎖が読み取られて標的mRNAをノックアウトしたとしても、センスsiRNA鎖が別の機能に関与する別のタンパク質を標的にする可能性がある。[ 52 ]
2005年末に報告された最初の2つの治療用RNAi試験（加齢黄斑変性症、別名AMDを適応とする）の第I相結果では、siRNAは忍容性が高く、適切な薬物動態特性を有することが示された。[ 53 ]
第 1 相臨床試験では、肝臓に転移した進行癌患者 41 名に、脂質ナノ粒子を介して送達されるRNAi が投与された。RNAi は、癌細胞の増殖における重要なタンパク質をコードする 2 つの遺伝子、血管内皮増殖因子 ( VEGF ) およびキネシン紡錘体タンパク質 ( KSP ) を標的とした。結果は臨床的利益を示し、6 か月後に癌が安定するか、一部の患者では転移が退縮した。患者の生検サンプルの薬力学的分析により、サンプル中に RNAi 構築物が存在することが明らかになり、分子が目的の標的に到達したことが証明された。[ 54 ] [ 55 ]
概念実証試験では、エボラウイルスを標的としたsiRNAがヒトにおける曝露後予防として有効である可能性が示されており、最も致死性の高い株であるザイールエボラウイルスの致死量に対して非ヒト霊長類の100%が生存している。[ 56 ]
現在、siRNAは化学合成されているため、EUおよび米国では単純な医薬品として法的に分類されています。しかし、バイオエンジニアリングされたsiRNA（BERA）が開発中であるため、少なくともEUでは、これらは生物学的医薬品に分類されるでしょう。BERA技術の開発は、同じ作用機序を持つが化学的または生物学的に製造される医薬品の分類に関する問題を提起します。この一貫性の欠如に対処する必要があります。[ 57 ]
RNA干渉（RNAi）は、あらゆる遺伝子を可逆的にサイレンシングする治療法として大きな可能性を秘めている。RNAiが治療効果を発揮するためには、低分子干渉RNA（siRNA）を標的組織の細胞内の作用部位に送達する必要がある。しかし、安全かつ効率的な送達メカニズムを見つけることは、siRNAベースの治療法の可能性を最大限に引き出す上で大きな障害となっている。未修飾のsiRNAは血流中で不安定であり、免疫原性を引き起こす可能性があり、細胞膜を容易に通過することが難しい。[ 58 ]そのため、siRNAを安全に作用部位に送達するためには、化学的修飾や送達ツールが必要となる。[ 58 ] siRNAの送達には、効率と毒性が異なる3つの主要な技術がある。
この技術では、まず標的遺伝子に対するsiRNAを設計する必要があります。siRNAが遺伝子に対して構成されたら、トランスフェクションプロトコルによって効果的に送達する必要があります。送達は通常、カチオン性リポソーム、ポリマーナノ粒子、および脂質結合によって行われます。[ 59 ]この方法は、ほとんどの種類の細胞にsiRNAを送達でき、効率と再現性が高く、市販されているため有利です。siRNAのトランスフェクションに最も一般的に使用される市販の試薬は、 LipofectamineとNeon Transfectionです。ただし、すべての細胞タイプと互換性があるわけではなく、生体内での効率が低いです。[ 60 ] [ 61 ]
電気パルスは、siRNAを細胞内に送達するためにも利用されます。細胞膜はリン脂質で構成されているため、電場の影響を受けやすい性質があります。高速かつ強力な電気パルスを印加すると、脂質分子は加熱による熱相転移を起こしながら再配向します。これにより、細胞膜の脂質二重層に親水性の孔が形成され、局所的な構造変化が生じ、半透性が一時的に失われます。その結果、細胞内物質（イオン、代謝物など）の漏出が可能になるとともに、薬剤、分子プローブ、核酸などの細胞内への取り込みも可能になります。
形質導入が困難な細胞の場合、エレクトロポレーションは有利ですが、この技術では細胞死が起こりやすくなります。この方法は、VEGFを標的とするsiRNAをヌードマウスの異種移植腫瘍に導入するために使用され、腫瘍の増殖を大幅に抑制しました。[ 62 ]
トランスフェクトされた設計siRNAの遺伝子サイレンシング効果は一般的に一時的ですが、この問題はRNAiアプローチによって克服できます。DNAテンプレートからのsiRNAの送達は、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスに基づくいくつかの組換えウイルスベクターを介して行うことができます。[ 63 ] 2006年の初期研究の時点では、後者のウイルスは、非分裂細胞を形質導入したり、核を直接標的にしたりするために使用できるため、siRNAを標的細胞に安定的に送達するのに最も効率的でした。[ 64 ]これらの特定のウイルスベクターは、細胞へのトランスフェクトに適さないsiRNAを効果的に促進するために合成されています。
場合によっては、合成ウイルスベクターを用いてsiRNAを細胞ゲノムに組み込むことで、siRNAの安定発現と長期的な遺伝子ノックダウンが可能となる。この技術は生体内法であるため、トランスフェクションが困難な細胞にも有効であるという利点がある。しかしながら、一部の細胞種では抗ウイルス応答が誘発され、変異原性や免疫原性といった影響を及ぼす可能性があるという問題点も存在する。
この方法は、例えばハンチントン病の治療など、中枢神経系遺伝子の遺伝子サイレンシングに利用できる可能性が示されている。[ 65 ]
1998年にRNAiメカニズムが発見されてから10年後、製薬業界はsiRNA療法の研究開発に多額の投資を行った。この療法には、低分子化合物や抗体に比べていくつかの利点がある。投与は四半期ごと、または6か月ごとでよい。もう1つの利点は、特定のタンパク質構造を認識する必要がある低分子化合物やモノクローナル抗体とは異なり、siRNAはmRNAとのワトソン・クリック塩基対形成によって機能することである。したがって、適切なヌクレオチド配列があれば、高い親和性と特異性で治療する必要のある標的分子は何でも選択できる。[ 46 ]研究者が克服しなければならなかった最大の課題の1つは、治療薬が体内に入るための送達システムの特定と確立であった。もう1つは、免疫系がRNAi療法を感染性病原体の残骸と誤認し、免疫反応を引き起こす可能性があることである。[ 4 ]動物モデルはヒトに見られる免疫反応の程度を正確に表しておらず、治療の可能性にもかかわらず、投資家はRNAiから撤退した。[ 4 ]
しかし、ヒト向けのRNAi療法の開発を継続した企業もいくつかありました。Alnylam Pharmaceuticals、Sirna Therapeutics、Dicerna Pharmaceuticalsは、RNAi療法を市場に投入するために現在も開発を続けている企業です。血流に投与されたsiRNA療法のほぼすべてが肝臓に蓄積することが判明しました。そのため、初期の薬剤標的のほとんどは肝臓に影響を与える疾患でした。繰り返し行われた開発作業により、RNA分子の化学組成を改善して免疫反応を抑制し、結果として副作用をほとんど、あるいは全く引き起こさないことも明らかになりました。[ 66 ]以下に、承認された治療法またはパイプラインにある治療法の一部を示します。
2018年、アルニラム・ファーマシューティカルズは、 FDAによって承認されたsiRNA療法を開発した最初の企業となりました。オンパトロ（パチシラン）は、成人の遺伝性トランスサイレチン介在性（hATTR）アミロイドーシスの多発神経障害の治療薬として承認されました。hATTRは、まれで進行性の衰弱性疾患です。hATTRアミロイドーシスでは、ミスフォールドしたトランスサイレチン（TTR）タンパク質が細胞外空間に沈着します。通常のフォールディング条件下では、TTRテトラマーは4つのモノマーから構成されています。遺伝性ATTRアミロイドーシスは、遺伝するトランスサイレチン（TTR）遺伝子の欠陥または変異によって引き起こされます。たった1つのアミノ酸の変化でも、テトラマーのトランスサイレチンタンパク質が変化し、不安定なテトラマーのトランスサイレチンタンパク質がモノマーに凝集して不溶性の細胞外アミロイド沈着物を形成します。さまざまな臓器系におけるアミロイドの蓄積は、心筋症、多発性神経障害、および消化器機能障害を引き起こします。世界中で5万人が影響を受けています。薬剤を肝臓に直接届けるために、siRNAは脂質ナノ粒子に包まれます。siRNA分子は、異常なTTRタンパク質のRNA産生を阻害することにより、アミロイドタンパク質の産生を停止します。これにより、これらのタンパク質が体内のさまざまな臓器に蓄積するのを防ぎ、患者がこの病気を管理するのに役立ちます。[ 67 ] [ 68 ]
従来、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスの標準治療は肝移植であったが、移植後も野生型トランスサイレチンアミロイドが持続的に沈着するため、その有効性が制限される可能性がある。一時的な緩和をもたらす低分子医薬品もある。オンパトロが発売される前は、hATTRの治療選択肢は限られていた。オンパトロの承認後、FDAはアルニラムに画期的治療薬指定を与えた。これは、重篤な疾患を治療することを目的とし、既存の治療法を大幅に改善する薬剤に与えられるものである。また、20万人未満の患者に影響を与える疾患を安全に治療することを目的とした治療薬に与えられる希少疾病用医薬品指定も受けた。[ 69 ]
オンパトロに加えて、トランスサイレチンの肝臓での合成を阻害する性質を持つ別のRNA干渉治療薬であるパチシランも開発されました。その結果、標的メッセンジャーRNA（mRNA）は、RNA誘導サイレンシング複合体に結合した低分子干渉RNAによって切断されます。RNAi治療薬であるパチシランは、このプロセスを利用して、トランスサイレチンmRNAの3'非翻訳領域を切断することにより、変異型および野生型トランスサイレチンの産生を減少させます。[ 70 ]
2019年、FDAは急性肝性ポルフィリン症（AHP）の治療薬として、2番目のRNAi療法であるギブラアリ（ギボシラン）を承認した。この疾患は、ヘム生成時に生成される毒性のあるポルホビリノーゲン（PBG）分子の蓄積によって引き起こされる。これらの分子は様々な臓器に蓄積し、AHPの症状や発作を引き起こす可能性がある。
ギブラアリは、ヘム生成の初期段階に関与する肝臓酵素であるアミノレブリン酸シンターゼ1 （ALAS1）の発現を下方制御するsiRNA薬です。ALAS1の発現を下方制御することで、AHP症状を引き起こす神経毒性中間体のレベルが低下します。[ 46 ]
長年の研究により、肝臓に影響を与えるもの以外にもsiRNA療法の理解が深まっています。2019年現在、Alnylam Pharmaceuticalsは、アミロイドーシスやハンチントン病、アルツハイマー病などのCNS疾患を治療する可能性のある治療法に関わっています。[ 4 ]また、 Regeneron Pharmaceuticalsと提携して、CNS、眼、肝臓の疾患の治療法を開発しています。
2020年現在、OnpattroとGivlaariは市販されており、2つのsiRNA、lumasiran（ALN-GO1）とinclisiranがFDAに新薬承認申請されています。いくつかのsiRNAは第3相臨床試験中で、さらに多くの候補が初期開発段階にあります。[ 46 ] 2020年、AlnylamとVir Pharmaceuticalsは提携を発表し、COVID-19の重症例を治療するRNAi療法の開発に着手しました。[ 71 ]
siRNA療法のパイプライン開発に成功した他の企業には、イーライリリー・アンド・カンパニーと提携しているディセルナ・ファーマシューティカルズや、ジョンソン・エンド・ジョンソンと提携しているアローヘッド・ファーマシューティカルズなどがある。アムジェンやアストラゼネカなどの他の大手製薬会社も、この生物学的医薬品の分野での成功の可能性を見出し、siRNA療法に多額の投資を行っている。[ 72 ]
以下は、ほとんどが比較的新しい二次資料であり、この記事を裏付ける信頼できる追加情報として提示するものです。
我々は、ショウジョウバエ細胞における RISC によって標的とされる mRNA の分解経路を調査した。RISC 切断によって生成された 5' mRNA 断片はエクソソームによって 3' 末端から急速に分解されるのに対し、3' 断片は XRN1 によって 5' 末端から分解されることを示した。