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トランスフェクションとは、裸の核酸または精製された核酸を意図的に真核細胞に導入するプロセスです。[ 1 ] [ 2 ]また、他の方法や細胞の種類を指す場合もありますが、他の用語が好まれることもよくあります。「形質転換」は、通常、細菌や植物細胞を含む非動物真核細胞における非ウイルス性DNA転送を説明するために使用されます。動物細胞では、「形質転換」という用語は細胞が癌状態（発癌）に進行することを示すためにも使用されるため、トランスフェクションが好ましい用語です。形質導入は、ウイルスを介した原核細胞への遺伝子導入を説明するためによく使用されます。[ 2 ] [ 3 ]
トランスフェクションという言葉は、接頭辞「trans-」と「infection」を組み合わせた造語です。 遺伝物質（超らせん状プラスミドDNAやsiRNA構築物など）をトランスフェクションすることができます。動物細胞へのトランスフェクションでは、通常、細胞膜に一時的な孔または「穴」を開けて物質を取り込ませます。トランスフェクションは、リン酸カルシウム（リン酸三カルシウムなど）を用いる方法、エレクトロポレーション法、細胞圧迫法、またはカチオン性脂質を物質と混合してリポソームを生成し、リポソームが細胞膜と融合して内容物を内部に放出する方法で行うことができます。
トランスフェクションは、標的細胞に予期せぬ形態異常や異常を引き起こす可能性がある。
この用語の意味は変化してきた。[ 4 ] トランスフェクションの本来の意味は「形質転換による感染」、すなわち原核生物に感染するウイルスやバクテリオファージからDNAやRNAなどの遺伝物質を細胞に導入し、感染を引き起こすことであった。細菌や古細菌の細胞を扱う場合、トランスフェクションは形質転換の特殊なケースとして本来の意味を保持している。形質転換という用語は動物細胞生物学では別の意味（培養で長期増殖を可能にする遺伝的変化、または癌細胞に典型的な特性の獲得）を持っていたため、動物細胞の場合、トランスフェクションという用語は、DNAの導入によって引き起こされる細胞特性の変化という現在の意味を獲得した。
真核細胞に外来DNAを導入する方法は様々である。物理的処理（電気穿孔、細胞圧搾、ナノ粒子、磁気注入）を用いる方法もあれば、化学物質や生物学的粒子（ウイルス）をキャリアとして用いる方法もある。細菌から哺乳類まで、様々な種類の細胞や組織向けに開発された遺伝子導入法は数多く存在する。一般的に、これらの方法は物理的、化学的、生物学的の3つのカテゴリーに分類できる。[ 5 ]
物理的方法には、電気穿孔、マイクロインジェクション、ジーンガン、インパレフェクション、静水圧、連続注入、超音波処理などがあります。化学的方法には、リポソームベクターを利用した脂質媒介DNAトランスフェクションプロセスであるリポフェクションなどの方法があります。ポリマー遺伝子キャリア（ポリプレックス）の使用も含まれます。 [ 6 ]生物学的トランスフェクションは通常、ウイルスによって媒介され、ウイルスが宿主細胞内にDNAを注入する能力を利用します。送達を目的とした遺伝子は、複製欠損ウイルス粒子にパッケージ化されます。これまでに使用されたウイルスには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどがあります。
物理的方法は概念的には最も単純で、何らかの物理的手段を用いてトランスフェクトされた物質を標的細胞の核に押し込む。最も広く用いられている物理的方法はエレクトロポレーションであり、短い電気パルスによって細胞膜が破壊され、トランスフェクトされた核酸が細胞内に入ることができる。[ 5 ]他の物理的方法では、細胞膜に穴を開けるために異なる手段が用いられる。ソノポレーションは高強度の超音波（主に近傍の細胞膜と相互作用する気泡のキャビテーションによるもの）を用い、光学的トランスフェクションは高度に集束されたレーザーを用いて 直径約1μmの穴を形成する。[ 7 ]
いくつかの方法では、核酸を細胞内に強制的に導入するツールが用いられており、具体的には、細い針を用いた核酸のマイクロインジェクション[ 5 ] 、核酸を重金属粒子（通常は金）に付着させて高速で細胞内に送り込むバイオリスティック粒子送達[ 8 ]、そして核酸を磁性酸化鉄粒子に付着させて磁石で標的細胞内に送り込むマグネトフェクション[ 8 ]などがある。
ハイドロダイナミックデリバリーは、マウスやラットで使用される方法で、比較的大きな量の核酸を10秒以内に血液中に注入することで肝臓に送達できます。この手順により、DNAのほぼすべてが肝臓で発現します。[ 9 ]
化学物質を用いたトランスフェクションは、シクロデキストリン[ 10 ]ポリマー[ 11 ]リポソーム、ナノ粒子[ 12 ] （化学的またはウイルスによる機能化の有無にかかわらず。下記参照）など、いくつかの種類に分類できます。
DNAは、ウイルスをキャリアとして使用して細胞に導入することもできます。このような場合、この技術は形質導入と呼ばれ、細胞は形質導入されたと言われます。アデノウイルスベクターは、さまざまなヒト細胞に遺伝子を導入でき、導入率が高いため、ウイルス形質導入法に有用です。[ 2 ]レンチウイルスベクターも、現在分裂していない細胞に形質導入できるため有用です。
プロトプラスト融合は、形質転換した細菌細胞をリゾチームで処理して細胞壁を除去する技術である。その後、融合促進剤（例えば、センダイウイルス、PEG、エレクトロポレーション）を用いて、目的遺伝子を含むプロトプラストを標的受容細胞と融合させる。この方法の大きな欠点は、細菌成分が標的細胞にも非特異的に導入されてしまうことである。
安定トランスフェクションと一過性トランスフェクションは、細胞への長期的な影響が異なります。安定トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクションされたDNAを継続的に発現し、それを娘細胞に受け継ぎますが、一過性トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクションされたDNAを短期間だけ発現し、娘細胞には受け継ぎません。
トランスフェクションの用途によっては、トランスフェクションされた遺伝物質が一時的に発現するだけで十分です。トランスフェクションプロセスで導入されたDNAは通常、核ゲノムに組み込まれないため、外来DNAは有糸分裂によって希釈されるか、分解されます。[ 5 ]エプスタイン・バーウイルス（EBV）核抗原1（EBNA1）またはSV40ラージT抗原を発現する細胞株は、ウイルスEBV（293E）またはSV40（293T）複製起点を含むプラスミドのエピソーム増幅を可能にし、希釈率を大幅に低下させます。[ 25 ]
導入された遺伝子が細胞とその娘細胞のゲノムに実際に残ることを望む場合、安定したトランスフェクションが起こる必要があります。これを実現するために、マーカー遺伝子が共導入され、細胞に特定の毒素に対する耐性などの選択的利点を与えます。トランスフェクションされた細胞の一部（ごく少数）は、偶然にも外来遺伝物質をゲノムに組み込みます。その後、細胞培養に毒素を加えると、マーカー遺伝子がゲノムに組み込まれた少数の細胞だけが増殖でき、他の細胞は死滅します。この選択的ストレス（選択圧）を一定期間加えると、安定したトランスフェクションを持つ細胞だけが残り、さらに培養することができます。[ 26 ]
RNAは、コードされたタンパク質を一時的に発現させたり、RNAの分解速度を研究したりするために、細胞に導入することもできる。RNA導入は、分裂しない初代細胞でよく用いられる。
siRNAをトランスフェクションすることでRNAサイレンシング（すなわち、標的遺伝子からのRNAおよびタンパク質の消失）を達成することもできます。これは、遺伝子治療への応用が期待される、目的のタンパク質（例：エンドセリン-1 [ 27 ] ）の「ノックダウン」を達成するための研究における主要な応用となっています。サイレンシングアプローチの限界は、細胞に対するトランスフェクションの毒性と、他の遺伝子/タンパク質の発現に対する潜在的な「オフターゲット」効果です。
RNAは、細胞溶解後に細胞から精製するか、遊離ヌクレオチドから化学的に、またはRNAポリメラーゼを使用してDNAテンプレートを転写する酵素的に合成することができます。DNAと同様に、RNAはマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクションなど、さまざまな方法で細胞に導入できます。RNAがタンパク質をコードしている場合、トランスフェクトされた細胞はRNAをコードされたタンパク質に翻訳する可能性があります。 [ 28 ] RNAが調節RNA（miRNAなど）の場合、RNAは細胞内で他の変化（ RNAi媒介ノックダウンなど）を引き起こす可能性があります。
RNA分子を脂質ナノ粒子に封入することは、 RNAワクチンの製造における画期的な進歩であり、RNA分子をヒト細胞に送達する際の多くの重要な技術的障壁を解決した。[ 29 ] [ 30 ]
約25ヌクレオチド（nt）より短いRNA分子は、より長いRNA分子によって活性化される自然免疫系による検出をほとんど回避します。体内のほとんどの細胞は自然免疫系のタンパク質を発現しており、外来性の長いRNA分子に曝露されると、これらのタンパク質がシグナル伝達カスケードを開始し、炎症を引き起こします。この炎症により、曝露された細胞および近傍の細胞は、その後の曝露に対して過敏になります。その結果、細胞は短いRNAを繰り返し導入しても非特異的な影響はほとんど生じませんが、長いRNAを少量でも繰り返し導入すると、自然免疫系を抑制または回避するための対策を講じない限り、細胞死を引き起こす可能性があります（下記の「長いRNAの導入」を参照）。
短いRNAトランスフェクションは、生物学的研究において、目的のタンパク質の発現をノックダウンする（siRNAを使用）か、 miRNAの発現または活性を阻害する（細胞のRNAi機構とは独立して作用する短いRNAを使用するため、siRNAとは呼ばれない）ために日常的に使用されている。短いRNA分子をコードするDNAベースのベクター（ウイルス、プラスミド）も使用できるが、短いRNAトランスフェクションは細胞のDNAを改変するリスクがなく、この特性により、短いRNAは新しいクラスの高分子医薬品として開発されてきた。[ 31 ]
長鎖RNAトランスフェクションとは、約25ヌクレオチドより長いRNA分子を意図的に生細胞に導入するプロセスである。短鎖RNAトランスフェクションと長鎖RNAトランスフェクションは区別される。なぜなら、外来性の長鎖RNA分子は細胞内で自然免疫応答を引き起こし、翻訳阻害、細胞周期停止、アポトーシスなど、さまざまな非特異的な影響をもたらす可能性があるからである。
自然免疫系は、病原体関連分子パターン（PAMP）を検出して炎症として知られる一連の複雑な反応を引き起こすことで感染から身を守るように進化しました。多くの細胞は、トール様受容体3、7、8（TLR3、TLR7、TLR8）[ 32 ] [ 33 ] [34][ 35 ]、RNAヘリカーゼRIG1（RARRES3） [ 36 ]、プロテインキナーゼR（PKR、別名EIF2AK2）[ 37 ] [ 38 ] 、オリゴアデニル酸シンターゼファミリータンパク質（OAS1、OAS2、OAS3 ）など、外来RNAに対する特異的なパターン認識受容体（PRR）を発現しています。これらのタンパク質はすべて、外来RNA分子に特異的に結合して免疫応答を引き起こすことができます。 PRRによる認識に必要な長鎖RNA分子の特定の化学的、構造的、またはその他の特性は、集中的な研究にもかかわらず、依然としてほとんど不明である。典型的な哺乳類細胞は、いつでも数十万個のmRNAおよびその他の調節長鎖RNA分子を含んでいる可能性がある。細胞が外来性長鎖RNAを大量の内因性長鎖RNAからどのように区別するかは、細胞生物学における重要な未解決問題である。いくつかの報告では、長鎖RNA分子の5'末端のリン酸化がその免疫原性に影響を与える可能性があり、特に、ウイルス感染中に生成される5'-三リン酸RNAは、5'-二リン酸RNA、5'-一リン酸RNA、または5'リン酸を含まないRNAよりも免疫原性が高いことが示唆されている。[ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ] [ 44 ]しかし、 7-メチルグアノシンキャップ（真核生物のmRNAに存在する）を含む試験管内転写（ivT）長鎖RNAも、5'リン酸基を持たないにもかかわらず高い免疫原性を示しており、[ 45 ] 5'リン酸化以外の特性もRNA分子の免疫原性に影響を与える可能性があることを示唆している。
真核生物のmRNAには、 N6-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、2'-O-メチル化ヌクレオチドなどの化学修飾ヌクレオチドが含まれています。これらの修飾ヌクレオチドは、典型的なmRNA分子にはごく少数しか存在しませんが、ウイルス感染時にのみ細胞内に存在すると考えられている二本鎖RNA（dsRNA）[ 46 ] [ 34 ]に似た二次構造を破壊することにより、mRNAが自然免疫系を活性化するのを防ぐのに役立つ可能性があります。長いRNAの免疫原性は、自然免疫と獲得免疫の両方を研究するために使用されてきました。
インターフェロンβ、STAT2、EIF2AK2の3つのタンパク質のみを阻害することで、長いタンパク質コードRNAによる頻繁なトランスフェクションによって引き起こされるヒト線維芽細胞の細胞死を救済するのに十分である。 [ 45 ]インターフェロンシグナル伝達を阻害すると、通常、外来性の長いRNAに曝露された細胞を過敏にする正のフィードバックループが破壊される。研究者らは最近、この技術を使用して、初代ヒト線維芽細胞で再プログラミングタンパク質を発現させた。[ 47 ]
{{cite web}}: CS1メンテナンス: アーカイブサービスは非推奨になりました (リンク){{cite journal}}: CS1メンテナンス: DOIは2025年7月現在非アクティブです（リンク）