電気穿孔法

電気穿孔法（電気透過法とも呼ばれる）は、細胞に電場を印加して細胞膜の透過性を一時的に高める微生物学的および生物工学的手法である。^{[ 1 ]}高電圧電場を印加すると、脂質二重層が一時的に不安定化し、高分子の出入りを可能にするナノスケールの細孔が形成される。^{[ 2 ]}

この方法は、小分子、DNA、RNA、タンパク質などの分子を細胞内に導入するために広く用いられています。電気穿孔法は、電気穿孔キュベットを用いて懸濁細胞に対して行うことも、培養容器内の付着細胞に直接行うこともできます。 ^{[ 3 ]}

微生物学では、エレクトロポレーションは細菌や酵母細胞の形質転換によく利用され、^{[ 4 ]}しばしばプラスミドDNAが用いられます。^{[ 5 ]}また、植物プロトプラストや哺乳類細胞のトランスフェクションにも用いられます。 ^{[ 2 ]}特に、エレクトロポレーションはCAR T細胞療法などの細胞療法開発のための免疫細胞の体外操作において重要な役割を果たしています。^{[ 6 ] [ 7 ]}さらに、エレクトロポレーションの生体内応用は様々な組織タイプで成功裏に実証されています。^{[ 8 ]}

バルク電気穿孔法は、マイクロインジェクションや遺伝子銃技術などの他の物理的送達方法に比べて利点があります。しかし、細胞生存率の低下によって制限されます。これらの問題に対処するために、研究者たちはマイクロ電気穿孔法^{[ 9 ]}やナノトランスフェクション^{[ 10 ]}などの小型化されたアプローチを開発しました。これらの技術は、ナノチャネルを介した電気穿孔を利用して、分子カーゴをより制御された、侵襲性の低い方法で細胞に送達します。

細胞内送達の代替方法としては、細胞透過性ペプチドの使用^{[ 11 ]}、細胞圧迫技術^{[ 12 ]}、化学変換^{[ 13 ]}などがあり、選択は特定の細胞タイプと積荷の特性に応じて行われる。

電気穿孔法は細胞融合を誘導するためにも用いられる。^{[ 14 ]}細胞融合の代表的な応用例としてハイブリドーマ技術があり、抗体産生Bリンパ球を不死化骨髄腫細胞株と融合させてモノクローナル抗体を産生する。^{[ 15 ] [ 16 ]}

電気穿孔法は、特にプラスミドDNAに対して高い形質転換効率を達成できるため、実験室環境で広く利用されており、報告されている収量はDNAマイクログラムあたり10 ¹⁰コロニー形成単位に迫る。電気穿孔法は、必要な特殊な装置のため、一般的に化学的形質転換法よりもコストがかかる。これには、細胞懸濁液用に制御された静電場を生成するように設計された装置である電気穿孔装置^{[ 17 ]}と、通常はガラスまたはプラスチックで作られ、平行なアルミニウム電極を含む電気穿孔キュベット^{[ 18 ] [ 19 ]}が含まれる。

標準的な細菌形質転換プロトコルにはいくつかのステップがあります。まず、アーク放電を引き起こす可能性のあるイオンを除去するために洗浄して、電気コンピテント細胞を準備します。次に、これらの細胞をプラスミドDNAと混合し、電気穿孔キュベットに移します。電圧やパルス持続時間などの特定のパラメータを、使用する特定の細胞タイプに合わせて調整し、高電圧の電気パルスを印加します。電気穿孔後、回復培地を加え、細胞を適切な温度で培養して増殖させます。最後に、細胞を選択寒天プレートに播種して、形質転換効率を評価します。^{[ 20 ]}

電気穿孔の成功は、プラスミドDNA溶液の純度^{[ 21 ]} 、塩濃度、電気穿孔パラメータ^{[ 22 ]}など、いくつかの要因に依存します。高塩濃度はアーク放電（電気放電）を引き起こし、電気穿孔された細胞の生存率を著しく低下させる可能性があります。したがって、細胞生存率とDNA取り込みの効果的なバランスを達成するには、各細胞タイプごとに電気穿孔条件を最適化する必要があります^{[ 23 ] 。}

電気穿孔法は、体外への応用に加えて、注射や外科手術中に細胞膜の透過性を高めるために生体内でも用いられています。生体内電気穿孔法の有効性は、電圧、パルス持続時間、パルス数などの選択されたパラメータに大きく依存します。発達中の中心神経系は、脳室が核酸注射の視認性を高め、分裂中の細胞が透過性の増加を示すため、生体内電気穿孔法に特に適しています。子宮内に注入された胚への電気穿孔は、子宮壁を通して行われ、胚への損傷を最小限に抑えるために鉗子型の電極がよく使用されます。^{[ 24 ]}

低コストで持ち運び可能な電気穿孔装置も報告されており、圧電ライター由来のハンドヘルド電気穿孔装置（「ElectroPen」）^{[ 25 ]}や、携帯型DNAワクチン接種研究用に設計されたマイクロニードルアレイ皮膚電気穿孔システム（「ePatch」）^{[ 26 ]などがある。}

生物学におけるパルス電場の初期の研究では、膜の損傷と微生物の不活性化が調べられた。1970年代には、臨界膜電位に達すると細胞膜が破壊され、その後回復することがわかった。^{[ 27 ]} 1980年代には、この一時的な膜破壊が、さまざまな分子を細胞内に導入するために利用された。^{[ 28 ]}

SaleとHamilton（1967～1968）は、高強度の電場パルスが細菌や酵母を殺傷できることを報告し、膜の破壊が重要なメカニズムであると提唱した。^{[ 29 ] [ 30 ]}

1970年代半ば、Zimmermannらは、赤血球と細菌を用いた可逆的な電場誘起膜透過化（「誘電破壊」/電気透過化）について報告した。これには、開口部ベースのCoulterカウンター装置を用いた実験や、電極とコンデンサ放電パルスを用いた追跡測定が含まれる。^{[ 31 ] [ 32 ]}

赤血球の研究により、制御された条件下で孔が形成され、再び閉じることができることが明らかになった。^{[ 33 ] [ 34 ]}同時に、Auer、Brandner、およびBodemerは、誘電破壊中に赤血球にSV40 DNAと哺乳類RNAが取り込まれることを報告した。^{[ 35 ]}

電気穿孔法（エーベルハルト・ノイマンが造語）という用語は、哺乳類細胞における電場を介した遺伝子導入を実証する研究とともに一般的に使用されるようになった。^{[ 36 ]}

生体内遺伝子電気穿孔法は1991年に初めて報告された。 ^{[ 37 ]}この方法は、免疫疾患、腫瘍、代謝性疾患、単一遺伝子疾患、心血管疾患、鎮痛など、さまざまな疾患の治療に利用できる多様な治療遺伝子を。 ^{[ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]}

不可逆電気穿孔法に関しては、マウスに移植された悪性皮膚腫瘍の最初の治療成功例は、2007年に科学者グループによって達成され、13匹のマウスのうち12匹で腫瘍の完全除去に成功しました。彼らは、2500 V/cmの電界強度で0.3 Hzで100マイクロ秒のパルスを80回送ることで皮膚腫瘍を治療しました。^{[ 41 ]}

電気穿孔法を最初に適用したグループは、不透過性高分子と組み合わせた可逆的な手順を使用しました。ナノ秒パルスをヒト細胞にどのように使用できるかについての最初の研究は、2003年に発表されました。^{[ 42 ]}

電気穿孔法の最初の医療応用は、腫瘍結節に浸透しにくい抗がん剤を導入するために使用されました。^{[ 43 ]}遺伝子電気導入は、低コスト、実施の容易さ、および安全性が主張されていることから、すぐに注目を集めるようになりました。その後、ウイルスベクターは、DNA導入に使用した場合、免疫原性および病原性の点で限界があることがわかりました。^{[ 44 ]}

不可逆電気穿孔法は、心臓の特定の部位の心筋を死滅させる心臓アブレーション療法として使用され、評価されています。これは、不整脈を治療するために行われます。心臓カテーテルは、細胞膜に不可逆的な孔を形成する高電圧の超高速電気パルス列を送り込み、細胞死を引き起こします。^{[ 45 ]}

電気穿孔法は、疎水性二重層コアを受動的に拡散できない、DNAなどの大きな高電荷分子を細胞内に導入することを可能にする。 ^{[ 56 ]}この現象は、そのメカニズムが膜にナノメートルスケールの水で満たされた穴を作ることであることを示している。^{[ 57 ]}電気孔は、液滴界面二重層^{[ 58 ]}や巨大単層小胞^{[ 59 ]}などの脂質二重層モデルで光学的に画像化されているが、巨大単層小胞にアクチンネットワークなどの細胞骨格タンパク質を加えると、目に見える電気孔の形成が妨げられるようだ。^{[ 60 ]}細胞膜透過性を制御するアクチンネットワークの実験的証拠も現れている。^{[ 61 ]}電気穿孔法と誘電破壊はどちらも電場の印加によって生じるが、関与するメカニズムは根本的に異なる。誘電破壊では、バリア材料がイオン化され、導電経路が作られる。したがって、材料の変化は化学的性質のものである。対照的に、電気穿孔法では、脂質分子は化学的に変化するのではなく、単に位置を移動し、二重層を貫通する導電経路として機能する細孔が開いて、そこに水が満たされる。

電気穿孔は、細胞膜上の各点における局所的な膜間電圧に依存する動的な現象です。一般的に、特定のパルスの持続時間と形状に対して、電気穿孔現象の発現には特定の膜間電圧閾値（0.5 V～1 V）が存在すると考えられています。これにより、電気穿孔の電界強度閾値（E _{th ）が定義されます。つまり、E≧E th}の領域内の細胞のみが電気穿孔されます。第2の閾値（E _ir）に達するかそれを超えると、電気穿孔によって細胞の生存能力が損なわれ、不可逆電気穿孔（IRE）となります。^{[ 62 ]}

電気穿孔は、いくつかの異なる段階からなるプロセスです。^{[ 63 ] [ 64 ]}まず、短い電気パルスが印加されます。典型的なパラメータは、膜全体に 300～400 mV を1 ms未満印加することです (注: 細胞実験で使用される電圧は、バルク溶液までの距離が長いため、実際の膜全体に生じる電場は印加バイアスのほんの一部にすぎないため、通常ははるかに大きくなります)。この電位を印加すると、周囲の溶液からイオンが膜に移動し、膜はコンデンサのように充電されます。臨界レベルに達すると、脂質形態の局所的な急速な再配列が起こります。結果として生じる構造は、電気伝導性はありませんが、急速に導電性の孔の形成につながるため、「プレポア」であると考えられています。^{[ 65 ]}このようなプレポアの存在の証拠は、主に孔の「ちらつき」から得られ、これは導電性状態と絶縁性状態の間の遷移を示唆しています。^{[ 66 ]}これらのプレポアは小さな（約3Å）疎水性欠陥であると示唆されている。この理論が正しければ、導電性状態への移行は、ポアの端での再配置によって説明できる。この再配置では、脂質ヘッドが折り畳まれて親水性界面が形成される。最終的に、これらの導電性ポアは修復されて二重層を再封鎖するか、拡大して最終的に破裂する。結果として生じる運命は、臨界欠陥サイズを超えたかどうかによって決まる^{[ 67 ]。}これは、印加された電場、局所的な機械的応力、および二重層の端のエネルギーに依存する。

遺伝子電気導入

細胞に十分な強度の電気パルスを印加すると、膜電位差が増加し、膜の不安定化が引き起こされます。細胞膜の透過性が増加し、通常は透過しない分子が細胞内に入ります。^{[ 68 ] [ 69 ]}遺伝子電気導入のメカニズムはまだ完全には解明されていませんが、DNAの導入は陰極に面した膜の部分でのみ起こり、トランスフェクションを成功させるには、DNAの細胞への電気泳動移動、膜へのDNA挿入、スポーク膜を横切る転座、核へのDNAの移動、核膜を横切るDNAの転送、そして最終的な遺伝子発現など、いくつかのステップが必要であることが示されています。^{[ 70 ]}遺伝子電気導入の効率に影響を与える可能性のある要因は数多くあり、例えば、温度、電気パルスのパラメータ、DNA濃度、使用する電気穿孔バッファー、細胞サイズ、およびトランスフェクションされた遺伝子を発現する細胞の能力などがあります。^{[ 71 ]}生体内遺伝子電気導入では、細胞外マトリックスを通じたDNA拡散、組織の特性、および組織全体の導電率が重要となる可能性がある。^{[ 72 ]}