原則 PCR用の旧型3温度サーマルサイクラー PCRは、DNA鎖の特定領域（DNAターゲット）を増幅します。ほとんどのPCR法は、長さ0.1～10キロ塩基対 （kbp）のDNA断片を増幅しますが、一部の技術では最大40kbpの断片を増幅できます。[ 7 ] 基質 によって決まりますが、反応が進むにつれて基質が制限要因となります。[ 8 ]
基本的なPCRセットアップには、以下のものを含むいくつかのコンポーネントと試薬が必要です[ 9 ]
反応は通常、サーマルサイクラー内で、10～200 μL の容量で小型反応チューブ (0.2～0.5 mL 容量)で行われます。サーマルサイクラーは、反応の各段階で必要な温度に達するように反応チューブを加熱および冷却します (下記参照)。多くの最新のサーマルサイクラーはペルチェ素子 を使用しており、デバイスの電流を反転させるだけで PCR チューブを保持するブロックの加熱と冷却の両方が可能です。薄壁の反応チューブは熱伝導率が高く、迅速な熱平衡を可能にします。ほとんどのサーマルサイクラーには、反応チューブの上部での 結露を 防ぐために加熱蓋が付いています。加熱蓋のない古いサーマルサイクラーでは、反応混合物の上に油の層を敷くか、チューブ内にワックスのボールを入れる必要があります。 [ 15 ]
手順 通常、PCRは、サーマルサイクルと呼ばれる20～40回の繰り返し温度変化のシリーズで構成され、各サイクルは通常、2つまたは3つの個別の温度ステップで構成されます（下図参照）。サイクリングの前には、非常に高い温度（> 90 °C（194 °F） ）での単一の温度ステップがあり、最後に最終産物の伸長または短時間の保存のために1回の保持があります。各サイクルで使用される温度と適用時間は、DNA合成に使用される酵素、反応中の二価イオンとdNTPの濃度、プライマーの融解温度 （T m ）など、さまざまなパラメーターに依存します。 [ 16 ]
初期化：このステップは、 ホットスタートPCR による熱活性化を必要とするDNAポリメラーゼにのみ必要です。[ 17 ] 反応チャンバーを94～96 ℃（201～205 °F） に加熱するか、極めて耐熱性の高いポリメラーゼを使用する場合は98 ℃（208 °F） に加熱し、1～10分間保持します。[ 4 ] 変性 94～98 ℃（201～208 °F） に20～30秒間加熱することからなります。これにより、相補的な塩基間の水素結合 が切断され、二本鎖DNAテンプレートのDNAが融解 、すなわち変性し、2つの一本鎖DNA分子が生成されます。 アニーリング 50～65 ℃（122～149 °F） に20～40秒間下げ、プライマーを各一本鎖DNAテンプレートにアニーリングさせます。通常、反応混合物には2種類のプライマーが含まれています。1つは、標的領域を含む2つの一本鎖相補鎖それぞれに対応します。プライマー自体は一本鎖配列ですが、標的領域の長さよりもはるかに短く、各鎖の3'末端の非常に短い配列のみを相補します。 [ 18 ] アニーリングステップの適切な温度を決定することは非常に重要です。なぜなら、効率と特異性はアニーリング温度に大きく影響されるからです。この温度は、プライマーが鎖にハイブリダイズできるほど低くなければなりませんが、ハイブリダイゼーションが特異的であるほど高くなければなりません。つまり、プライマーは鎖の完全に相補的な部分に のみ 結合し、他の場所には結合しない必要があります。温度が低すぎると、プライマーの結合が不完全になる可能性があります。温度が高すぎると、プライマーがまったく結合しない可能性があります。一般的なアニーリング温度は、使用するプライマーのT m より 3～5 °C 低い値です。相補的な塩基間の安定した水素結合は、プライマー配列がテンプレート配列と非常によく一致する場合にのみ形成されます。このステップでは、ポリメラーゼがプライマー-テンプレートハイブリッドに結合し、DNA 形成を開始します。[ 19 ] 伸長/伸長 : このステップの温度は使用する DNA ポリメラーゼによって異なります。耐熱性 DNA ポリメラーゼであるTaqポリメラーゼの最適 活性 温度は約75～80 °C (167～176 °F) ですが、[ 20 ] [ 21 ] この酵素では72 °C (162 °F) が一般的に使用されます。このステップでは、DNA ポリメラーゼは、反応混合物からテンプレートに5' から 3' の方向 に相補的な遊離 dNTP を付加し、 dNTP の5'リン酸基を新生 (伸長中) DNA 鎖の末端の 3' ヒドロキシ基と 縮合させる ことにより、 DNA テンプレート鎖に相補的な新しい DNA 鎖を合成します。伸長に必要な正確な時間は、使用する DNA ポリメラーゼと増幅する DNA ターゲット領域の長さの両方に依存します。経験則として、ほとんどのDNAポリメラーゼは最適温度で毎分1000塩基を重合します。最適条件下（つまり、基質や試薬の制限による制約がない場合）では、各伸長ステップでDNA標的配列の数が2倍になります。連続するサイクルごとに、元の鋳型鎖と新たに生成されたすべての鎖が次の伸長ラウンドの鋳型鎖となり、特定のDNA標的領域の指数関数的（幾何級数的）増幅につながります。[ 22 ] 変性、アニーリング、伸長の過程は1サイクルを構成します。DNA標的を数百万コピーに増幅するには、複数のサイクルが必要です。所定のサイクル数後に形成されるDNAコピー数を計算する式は 2 n で、n はサイクル数です。したがって、30サイクルの反応では、2 30 、つまり元の二本鎖DNA標的領域が1,073,741,824コピー生成されます。 最終伸長 ：このステップはオプションですが、 PCRの最後のサイクル後、 70～74 ℃（158～165 °F） （PCRで使用されるほとんどのポリメラーゼの最適な活性に必要な温度範囲）で5～15分間実行し、残っている一本鎖DNAが完全に伸長されるようにします。 最終保持 ：最終ステップでは、反応チャンバーを4～15 ℃（39～59 °F） に無期限に冷却し、PCR産物の短期保存に利用できます。 完全なPCRサイクルの模式図 ゲル電気泳動後の エチジウムブロミド 染色PCR産物。3つの異なる組織サンプルから標的配列を増幅するために、2組のプライマーが使用された。サンプル#1では増幅は認められず、サンプル#2と#3のDNAバンドは標的配列の増幅が成功したことを示している。ゲルには陽性対照と、実験用PCRにおけるバンドのサイズ決定のために、一定の長さのDNA断片を含むDNAラダーも示されている。PCRによって目的のDNA標的領域（アンプリマーまたはアンプリコン とも呼ばれる）が正常に生成されたかどうかを確認するために、 PCR産物のサイズ分離にアガロースゲル電気泳動が 用いられることがある。PCR産物のサイズは、既知のサイズのDNA断片を含む分子量マーカーであるDNAラダー と比較することによって決定される。DNAラダーは、PCR産物とともにゲル上を移動する。
タッカーPCR
段階 指数関数的増幅 他の化学反応と同様に、 PCRの反応速度 と効率は制限要因によって影響を受ける。したがって、PCRプロセス全体は、反応の進行状況に基づいてさらに3つの段階に分けることができる。
指数関数的増幅 ：サイクルごとに、生成物の量は2倍になります（反応効率が100%であると仮定）。30サイクル後には、1つのDNAコピーを1,000,000,000（10億）コピーまで増やすことができます。つまり、制御された条件下でチューブ内でDNAの個別の鎖の複製が操作されていると言えます。[ 23 ] 反応速度が鈍化する段階 ：DNAポリメラーゼの活性が低下し、dNTPやプライマーなどの試薬の消費によってそれらの供給が制限されるにつれて、反応速度が遅くなる。プラトー ：試薬と酵素が枯渇したため、それ以上生成物が蓄積されなくなる。
最適化 実際には、PCR は感度や汚染などさまざまな理由で失敗する可能性があります。[ 24 ] [ 25 ] 外部の DNA による汚染は 偽の産物につながる可能性があり、PCR 前の混合物を潜在的な DNA 汚染物質から分離するラボ プロトコルと手順で対処されます。[ 9 ]
特異性は 実験条件によって調整できるため、偽産物が生成されません。プライマー設計技術は、PCR産物収量を向上させ、非特異的産物の形成を回避するために重要です。代替バッファー成分（ DNA変性を助けるDMSO など）やポリメラーゼ酵素の使用は、長いDNA領域やその他の問題のあるDNA領域の増幅に役立ちます。たとえば、Q5ポリメラーゼはTaqポリメラーゼよりも約280倍エラーが少なく、プロセス性が高いと言われています。[ 26 ] [ 27 ] 実行パラメータ（サイクルの温度と持続時間など）またはホルムアミド などの試薬の添加は、PCRの特異性と収量を向上させる可能性があります。[ 28 ] 電子PCR ）は、プライマー設計を支援するために実行できます。[ 29 ]
アプリケーション
選択的DNA分離 PCRは、DNAの特定領域を選択的に増幅することにより、ゲノムDNAからDNA断片を分離することを可能にする。このPCRの使用は、特定のDNA領域を表すより多くのDNAを必要とするサザンハイ ブリダイゼーションやノーザンハイ ブリダイゼーション用のハイブリダイゼーションプローブの生成や DNAクローニング などの技術を増強する。PCRはこれらの技術に高濃度の純粋なDNAを供給するため、非常に少量の出発材料からでもDNAサンプルを分析することが可能となる。[ 30 ]
PCR のその他の用途には、増幅プライマーの 1 つをサンガー シーケンシングに使用できる未知の PCR 増幅配列を決定するための DNA シーケン シング、 プラスミド 、ファージ 、コスミド (サイズに応じて) または他の生物の遺伝物質への DNA 配列の挿入を含む組換え DNA 技術を迅速化するための DNA 配列の単離などがあります。細菌コロニー (大腸菌 など )は、正しい DNA ベクター 構築物について PCR によって迅速にスクリーニングできます。[ 31 ] 遺伝子フィンガープリンティング にも使用できます。 [ 32 ]
PCR増幅DNA断片の電気泳動：その子供は両親それぞれの指紋の一部を受け継いでいるが、全てを受け継いでいるわけではないため、独自の新しい指紋を持っている。 PCRフィンガープリント法の中には、識別力が高く、親子関係や兄弟姉妹関係など、個体間の遺伝的関係を特定するために使用できるものがあり、親子鑑定に用いられています（図4）。この技術は、特定の分子時計（例えば、微生物の 16S rRNA 遺伝子やrecA遺伝子）を用いることで、生物間の進化関係を決定するためにも使用できます。[ 33 ]
医療および診断用途 将来の親は遺伝子保因者 であるかどうかを検査されるか、子供が実際に病気 に罹患しているかどうかを検査されることがあります。[ 2 ] 出生前検査 用のDNAサンプルは、羊水穿刺 、絨毛膜絨毛採取 、あるいは母親の血流中を循環するまれな胎児細胞の分析によって採取できます。PCR分析は、発生中の胚の個々の細胞を検査して突然変異を調べる着床前遺伝子診断 にも不可欠です。
PCRは、臓器移植 に不可欠な組織型判定 2008年現在 、 血液型判定 のための従来の抗体検査をPCR検査に置き換えるという提案さえある。[ 43 ] 多くの癌は、癌遺伝子 白血病 やリンパ腫 などの悪性 疾患の早期診断を可能にし、これは現在癌研究で最も発展しており、すでに日常的に使用されています。PCRアッセイは、ゲノムDNAサンプルに直接実行して、転座特異的な悪性細胞を他の方法よりも少なくとも10,000倍高い感度で検出できます。[ 44 ] タンパク質の 確認と組み合わせを認識したりするために使用できます。[ 36 ]
感染症への応用 PCRは、細菌やウイルスによって引き起こされるものを含む感染症の迅速かつ非常に特異的な診断を可能にする。[ 45 ] PCRはまた、組織培養 アッセイや動物モデル から、マイコバクテリア 、嫌気性細菌 、ウイルス などの培養不可能または増殖の遅い微生物の同定も可能にする。微生物学におけるPCR診断アプリケーションの基礎は、特定の遺伝子によって感染性病原体を検出し、非病原性株と病原性株を区別することである。[ 45 ] [ 46 ]
PCRは、感染症の原因となる病原体の特性解析と検出を、以下の点で革新的に変革しました。
ヒト免疫不全ウイルス （HIV 検査は 、50,000 個以上の宿主細胞の DNA の中にわずか 1 つのウイルス ゲノムを検出できるほどに開発されました。[ 47 ] 定量化 できます。 結核菌 培養 にも時間がかかります。PCR法を用いた検査により、少量の病原体（生菌・死菌を問わず）を簡便な検体 から検出することが可能になりました。詳細な遺伝子解析によって抗生物質耐性を検出することで、迅速かつ効果的な治療が可能になります。また、治療効果も即座に評価できます。PCR検査を用いることで、家畜 や野生 動物の集団における病原体 の拡散を監視することができる。多くの場合、新たな毒性の強い亜型の出現を検出し、監視することが可能である。また、過去の流行を 引き起こした病原体の亜型もPCR分析によって特定できる。ウイルスDNAはPCRで検出できます。使用するプライマーはウイルスDNAの標的配列に特異的である必要があり、PCRは診断分析やウイルスゲノムのDNAシーケンスに使用できます。PCRの高い感度により、感染後すぐに、さらには発症前にもウイルスを検出できます。[ 45 ] ウイルス負荷」）もPCRベースのDNA定量技術によって定量できます（下記参照）。PCRの変種（ RT-PCR ）は、DNAではなくウイルスRNAを検出するために使用されます。この検査では、逆転写酵素を使用してウイルスRNAに一致するDNA配列を生成し、このDNAを通常のPCR法に従って増幅します。RT-PCRはSARS-CoV-2ウイルスゲノムの検出に広く使用されています。[ 48 ] 百日咳などの病気は、百日咳菌（Bordetella pertussis）によって引き起こされます。 百日咳毒素は、2つの二 量体 で細胞受容体に結合し、細胞免疫に関与するTリンパ球などのさまざまな細胞型と反応するタンパク質外毒素です。 [ 49 ] [ 50 ]
法医学的応用 PCRに基づく遺伝子 （またはDNA ）フィンガープリンティングプロトコルの開発は、法医学分野 で広く応用されている。
DNAサンプルは犯罪現場で採取され、PCR法によって分析されることが多い。 遺伝子指紋鑑定は 世界中 のあらゆる人々の中から特定の個人を識別することが可能です。犯罪現場 から微量のDNAサンプルを採取し、容疑者のDNA、あるいは過去の証拠や有罪判決を受けた人々のDNAデータベースと 比較します 。こうした検査の簡略版は、犯罪捜査において容疑者を迅速に除外するためにしばしば用いられます。数十年前の犯罪の証拠を検査することで、当初有罪判決を受けた人々の無罪を証明したり、あるいは無罪を立証したりすることも可能です。 法医学的DNA型鑑定は、犯罪現場で発見された証拠の分析により、犯罪容疑者の特定や無罪を証明する効果的な方法となっています。ヒトゲノムには、遺伝子配列内またはゲノムの非コード領域に存在する反復領域が多数あります。具体的には、ヒトDNAの最大40%が反復配列です。[ 6 ] [ 6 ] [ 6 ] 毛包 が付いた1本の人間の毛髪には、分析を行うのに十分なDNAが含まれています。同様に、少数の精子、爪の下の皮膚サンプル、または少量の血液から、決定的な分析を行うのに十分なDNAが得られます。[ 6 ] 識別力の低いDNAフィンガープリンティングは、 DNA親子鑑定 確認 （または否定）することも可能です。 PCR AMGX/AMGY設計は、非常に微量のゲノムからDNA配列を増幅するのに役立つだけでなく、法医学的な骨サンプルからのリアルタイムの性別判定にも使用できることが示されています [ 51 ]
研究応用 PCRは分子遺伝学 における多くの研究分野に応用されている。
PCRは、2つのプライマーの配列しか分かっていない場合でも、短いDNA断片を迅速に生成することを可能にする。このPCRの能力は、サザンブロット やノーザンブロット などのハイブリダイゼーション プローブの DNA配列決定 遺伝性疾患の 変異を 持つ患者から、既知のDNA断片を容易に得ることができる。増幅技術を改良することで、全く未知のゲノムから断片を抽出したり、関心のある領域の1本鎖のみを生成したりすることも可能になる。PCRは、より伝統的なDNAクローニング 変異を導入できる。 配列タグ付き部位 ヒトゲノムプロジェクトで は、この手法が、配列決定中のコスミドクローンのマッピングや、異なる研究室からの結果の調整に不可欠であることが判明した。PCRの応用例としては、ネアンデルタール人 の骨、マンモス の凍結組織、エジプトのミイラの脳など、古代の供給源 系統解析が挙げられる。 [ 23 ] PCRの一般的な応用例の一つは、遺伝子発現 定量PCR を用いて実際の発現レベルを定量化することも可能です。PCR は個々の精子から複数の遺伝子座を同時に増幅する能力[ 52 ] により、減数分裂 後の染色体交叉 を研究することで、より伝統的な遺伝子マッピング 部位特異的変異導入 ：PCRを用いることで、科学者が自由に選択した変異を持つ変異遺伝子を作製することができる。これらの変異は、タンパク質がどのように機能を発揮するのかを理解するため、またタンパク質の機能を変化させたり改善したりするために選択することができる。
利点 PCRには多くの利点があります。理解しやすく、使いやすく、結果も迅速に得られます。この技術は非常に高感度で、特定の産物を数百万から数十億コピー生成し、シーケンス、クローニング、分析に利用できます。qRT-PCRはPCRと同じ利点を持ち、さらに合成産物の定量化という利点があります。そのため、腫瘍、微生物、その他の疾患状態における遺伝子発現レベルの変化を分析するのに利用できます。[ 36 ]
PCRは非常に強力で実用的な研究ツールです。多くの疾患の未知の病因の配列はPCRによって解明されています。この技術は、既知のウイルスに関連するこれまで知られていなかったウイルスの配列を特定するのに役立ち、それによって疾患自体の理解を深めることができます。手順がさらに簡素化され、高感度な非放射性検出システムが開発されれば、PCRは今後何年にもわたって臨床検査室で重要な位置を占めることになるでしょう。[ 23 ]
制限事項 PCR の大きな制約の 1 つは、選択的増幅を可能にするプライマーを生成するために、標的配列に関する事前の情報が必要であることです。[ 36 ] [ 53 ] [ 54 ] この制約は、 DNA 増幅フィンガープリンティング (DAF) [ 55 ] 多型 DNA (RAPD) [ 56 ] 任意増幅 DNA 技術を使用すると相殺されます。これらの DNA プロファイリング法は、配列の知識を必要としない任意プライマーを PCR 反応で使用します。
すべての酵素と同様に、DNAポリメラーゼもエラーを起こしやすく、その結果、生成されるPCR断片に突然変異が生じる。[ 57 ]
PCRのもう1つの制限は、ごく微量の汚染DNAでも増幅されてしまい、誤解を招く結果や曖昧な結果が生じる可能性があることです。汚染の可能性を最小限に抑えるため、研究者は試薬の 調製、PCR、および生成物の分析用に別々の部屋を用意する必要があります。試薬は使い捨ての分注液 に分注する必要があります。使い捨てのプランジャーと長いピペットチップを備えたピペットを日常的に使用する必要があります。[ 23 ] [ 58 ]
腐植 酸を含む環境サンプルはPCR増幅を阻害し、不正確な結果につながる可能性がある。[ 59 ]
バリエーション アレル特異的PCR または増幅抵抗性変異システム（ARMS） ：単一ヌクレオチド変異（SNV、SNP と混同しないように）（患者における単一塩基の違い）に基づく診断またはクローニング技術。単一塩基の変化を伴うあらゆる変異をこのシステムで検出できます。このシステムでは、アレル 間の違いを含むDNA配列の事前知識が必要であり、3'末端がSNVを含むプライマーを使用します（通常、SNVの周囲の塩基対バッファーが組み込まれます）。[ 60 ] [ 61 ] SNPジェノタイピングを 参照してください。任意増幅DNA DNAプロファイリング 手法の総称です。これには、ランダム増幅多型DNA 任意プライマーPCR DNA増幅フィンガープリンティング アセンブリPCR ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（PCA） ：短い重複セグメントを持つ長いオリゴヌクレオチドのプールに対してPCRを実行することにより、長いDNA配列を人工的に合成する。オリゴヌクレオチドはセンス方向とアンチセンス方向が交互になり、重複セグメントがPCR断片の順序を決定し、それによって最終的な長いDNA産物を選択的に生成する。 [ 62 ] 非対称PCR 2つの相補鎖のうち一方のみの増幅が必要なシーケンス およびハイブリダイゼーションプローブで使用されます。PCRは通常どおり実行されますが、増幅対象鎖のプライマーを大幅に過剰に使用します。制限プライマーが消費された後の反応後半での遅い（算術的）増幅のため、追加のPCRサイクルが必要です。 [ 63 ] Lianear - After - The - Exponential-PCR（LATE-PCR）では、制限プライマーの濃度が反応の途中で減少しても反応効率を維持するために、過剰プライマーよりも高い融解温度（Tm）を 持つ制限プライマーを使用します。 [ 64 ] 対流PCR ：PCRを実行する擬似等温方式。PCR混合液を繰り返し加熱および冷却する代わりに、溶液に温度勾配を印加します。結果として生じる熱不安定性によって駆動される対流流により、PCR試薬が高温領域と低温領域から繰り返し自動的にシャッフルされ、PCRが可能になります。[ 65 ] [ 66 ] ダイアルアウトPCR ：遺伝子合成のための正確なDNA分子を取得するための高度に並列化された方法。複雑なDNA分子ライブラリーは、大規模並列シーケンスの前に、独自のフランキングタグで修飾されます。タグ指向プライマーにより、PCRによって目的の配列を持つ分子を取得できます。[ 67 ] デジタルPCR （dPCR）ヘリカーゼ依存性増幅 熱変性の代わりに、DNAをほどく酵素であるDNAヘリカーゼが 使用されます。 [ 68 ] ホットスタートPCR ポリメラーゼを加える前に反応成分を変性温度（例：95℃）まで加熱することで手動で実行できます。 [ 69 ] 抗体の結合 [ 17 ] [ 70 ] インシリコPCR 配列決定されたゲノム またはトランスクリプ トームからDNA配列を増幅するために、特定の プライマー （プローブ ）。インシリコPCRは、分子生物学の教育ツールとして提案されました。 [ 71 ] インターシークエンス特異的PCR （ISSR）：単純反復配列間の領域を増幅して増幅断片長の固有のフィンガープリントを生成するDNAフィンガープリンティングのためのPCR法。[ 72 ] 逆PCR ：ゲノム 挿入配列の周囲の隣接配列を特定するためによく使用されます。これは、一連のDNA消化 と自己連結 を含み、未知の配列の両端に既知の配列をもたらします。 [ 73 ] ライゲーション媒介PCR ：目的のDNAに連結された小さなDNAリンカーと、DNAリンカーにアニーリングする複数のプライマーを使用します。DNAシーケンス 、ゲノムウォーキング 、DNAフットプリンティング に使用されています。[ 74 ] メチル化特異的PCR スティーブン・ベイリン とジェームズ・G・ハーマンによって開発され [ 75 ] ミニプライマーPCR ：9または10ヌクレオチドという短いプライマー（「スモールイゴ」）から伸長できる耐熱性ポリメラーゼ（S-Tbr）を使用します。この方法は、より小さなプライマー結合領域を標的としたPCRを可能にし、16S（または真核生物の18S）rRNA遺伝子などの保存されたDNA配列を増幅するために使用されます。[ 76 ] マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅法 MLPA ）：単一のプライマーペアで複数のターゲットを増幅できるため、マルチプレックスPCRの解像度制限を回避できます（下記参照）。マルチプレックスPCR 異なるDNA配列に特異的な様々なサイズの増幅産物 を生成します。複数の遺伝子を同時に標的とすることで、通常であれば数倍の試薬とより多くの時間を要する検査を、1回の検査で実施できます。各プライマーセットのアニーリング温度は、単一の反応内で正しく機能するように最適化する必要があり、増幅産物のサイズも最適化する必要があります。つまり、ゲル電気泳動 で可視化した際に明確なバンドを形成するには、塩基対の長さが十分に異なっている必要があります。ナノ粒子支援PCR（nanoPCR） ：一部のナノ粒子（NP）はPCRの効率を高めることができ（そのためnanoPCRと呼ばれている）、中には元のPCR増強剤よりも優れた性能を発揮するものもある。量子ドット（QD）はPCRの特異性と効率を向上させることができると報告されている。単層カーボンナノチューブ（SWCNT）と多層カーボンナノチューブ（MWCNT）は、ロングPCRの増幅を増強するのに効果的である。カーボンナノパウダー（CNP）は、繰り返しPCRとロングPCRの効率を向上させることができ、酸化亜鉛 、二酸化チタン 、およびAg NPはPCR収量を増加させることがわかっている。以前のデータでは、非金属NPは許容できる増幅忠実度を維持することが示されている。多くのNPがPCR効率を高めることができることを考えると、nanoPCR技術の改善と製品開発には大きな可能性があることが明らかである。[ 77 ] [ 78 ] ネステッドPCR オーバーラップ伸長PCR オーバーラップ伸長によるスプライシング（SOEing） ：相補的な配列を含む2つ以上のDNA断片を結合するために使用される遺伝子工学 技術。遺伝子、調節配列、または変異を含むDNA断片を結合するために使用され、この技術により、特定の長いDNA構築物を作成できます。また、DNA配列に欠失、挿入、または点変異を導入することもできます。 [ 79 ] [ 80 ] PAN-AC ：等温条件下で増幅を行い、生細胞内でも使用可能である。[ 81 ] [ 82 ] PAN-PCR ：全ゲノム配列データに基づいて細菌タイピングアッセイを設計するための計算手法。[ 83 ] 定量PCR 定量PCRは 非常に高い精度を持っています。定量PCR法では、Sybr Green、EvaGreenなどの蛍光色素、またはTaqManなどの 蛍光色素を 含むDNAプローブ、増幅産物の量をリアルタイムで測定します。RT -PCR （リアルタイムPCR）と略されることもありますが、この略語は 逆転写PCR にのみ使用する必要があります。qPCRは定量PCR （リアルタイムPCR）の適切な略語です逆相補PCR 逆転写PCR （RT-PCR）逆転写酵素は RNAを cDNA に逆転写し、その後PCRによって増幅されます。RT-PCRは、遺伝子の発現を決定したり、転写開始部位や終結部位を含むRNA転写産物の配列を特定したりする発現プロファイリング に広く使用されています。遺伝子のゲノムDNA配列が既知であれば、RT-PCRを使用して遺伝子内のエクソン とイントロン の位置をマッピングできます。遺伝子の5'末端（転写開始部位に相当）は、通常、 RACE-PCR （ Rapid Amplification of cDNA Ends ）によって特定されます。RNase H依存性PCR [ 84 ] 単一特異的プライマーPCR （SSP-PCR）：配列情報が片方の末端のみにある場合でも、二本鎖DNAの増幅を可能にする。この方法は、部分的な配列情報しか得られていない遺伝子の増幅を可能にし、染色体の既知領域から未知領域への一方向のゲノムウォーキングを可能にする。[ 85 ] 固相PCR ：ポロニー増幅 （例えば、PCRコロニーがゲルマトリックス中で得られる場合）、ブリッジPCR [ 86 ] [ 87 ] 自殺PCR ：通常、古遺伝学 や、偽陽性を避け、増幅断片の特異性を確保することが最優先事項となる他の研究で使用されます。これは、中世の黒死病の流行中にペストで死亡したとされる14世紀の人々の墓から採取された歯のサンプルに微生物 Yersinia pestis が存在することを確認する研究で最初に記述されました。[ 88 ] 熱非対称インターレースPCR（TAIL-PCR） ：既知の配列に隣接する未知の配列を単離するための方法。既知の配列内では、TAIL-PCRはアニーリング温度の異なるネストされたプライマーペアを使用し、未知の配列とは逆方向には縮重プライマーを使用して増幅する。[ 89 ] タッチダウンPCR ステップダウンPCR ）：PCRサイクルの進行に伴ってアニーリング温度を徐々に下げることで非特異的バックグラウンドを低減することを目的としたPCRの変法。最初のサイクルでのアニーリング温度は通常、使用するプライマーのTm より数度（3～5 ℃）高く、後のサイクルではプライマーのTm より数度（3～5 ℃）低い。高温ではプライマー結合の特異性が高くなり、低温では最初のサイクルで形成された特異的産物からの増幅効率が高くなる。 [ 90 ] ツーテールPCRは、ミカエル・クビスタ教授によって開発された技術で、 マイクロRNA などの短いテンプレート分子、さらに短い分子を、3'末端と5'末端の両方で標的にハイブリダイズするヘアピンプライマーを使用して増幅します。[ 91 ] ユニバーサル・ファスト・ウォーキング ： 従来の「片側」アプローチ（遺伝子特異的プライマー1つと汎用プライマー1つのみを使用するため、アーティファクト的な「ノイズ」が発生する可能性がある）よりも特異性の高い「両側」PCRを使用してゲノムウォーキングと遺伝子フィンガープリンティングを行う[ 92 ] [ 93 ] [ 94 ] 、および3'RACE LaNe [ 95 ]
歴史 プライマーペアの一例を図解した図。DNA合成を可能にするためのin vitroアッセイにおけるプライマーの使用は、PCRの開発を可能にした大きな革新であった。 ポリメラーゼ連鎖反応の重要な構成要素である耐熱性酵素は、1960年代にイエロー ストーンのマッシュルームスプリングの超高温水に生息する微生物の産物として発見された。[ 96 ]
1971年にJournal of Molecular Biology に掲載された、 H. Gobind Khorana の研究室のKjell Kleppe と共同研究者による論文は、酵素アッセイを用いて短いDNAテンプレートをプライマーで試験管内で 複製する方法を初めて記述した。[ 97 ] Kary Mullis によるものとされている。[ 98 ]
「ベビーブルー」は、PCRを行うための1986年のプロトタイプ機である。 マリスは1983年にPCRを開発した当時、カリフォルニア州エメリービルにある バイオ テクノロジー 企業の1つであるセタス社で、短いDNA鎖の合成を担当していた。マリスは、ある夜、車でパシフィック・コースト・ハイウェイ をドライブ中にPCRのアイデアを思いついたと記している。 [ 99 ] アメリカン誌 [ 100 ] 親子鑑定に用いられた。 [ 101 ]
マリスは、PCRの開発にLSD の使用が不可欠だったと述べている。「LSDを服用していなかったらPCRを発明できただろうか？私はそうは思わない。私は幻覚剤の影響でそれを部分的に学んだのだ。」[ 102 ]
マリスと、DNAを操作する他の重要な方法を開発した生化学者のマイケル・スミス [ 1 ] の 1985 年の [ 104 ] [ 2 ]。
PCR法の核心は、各複製 サイクル後にDNA二重らせん の2本のDNA鎖を分離するために必要な90 ℃（194 °F） 以上の高温に耐えられる適切なDNAポリメラーゼを使用することです。PCRの前身となる in vitro 実験で最初に使用されたDNAポリメラーゼは、これらの高温に耐えることができませんでした。[ 2 ]
1976年にTaq ポリメラーゼ温泉など の高温（50～80 ℃（122～176 °F） ）環境に自然に生息する好熱性細菌 Thermus aquaticus [ 20 ] 。T . aquaticus から分離されたDNAポリメラーゼは高温でも安定しており、DNA変性後も活性を維持するため[ 21 ] [ 3 ]
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