RNase H依存性PCR

RNase H 依存 PCR (rhPCR) ^{[1]は、標準的な}PCR技術の改良版です。rhPCR では、プライマーは 3' 末端に除去可能な増幅ブロックが設計されています。ブロックされたプライマーの増幅は、相補的な標的配列へのハイブリダイゼーション中に超好熱性古細菌タイプ II RNase H酵素の切断活性に依存します。この RNase H 酵素は、PCR を強化するいくつかの有用な特性を備えています。まず、低温では酵素活性が非常に低いため、DNA ポリメラーゼを変更せずに「ホットスタート PCR 」を実行できます。次に、RNA 残基の近くにミスマッチがあると、酵素の切断効率が低下します。これにより、プライマーダイマー形成が減少し、^[1]選択的スプライシング変異体の検出、^[2]^{[3]より多くの PCR プライマーを使用した}マルチプレックス PCR の実行が可能になり、一塩基多型の検出が可能になります。^[4]

原理

rhPCRプライマーは3 つのセクションから構成されます。1) 5' DNA セクションは、長さと融解温度 (Tm) 要件が標準 PCR プライマーと同等であり、RNase HII 酵素による切断後に伸長します。2) 単一の RNA 塩基が RNase HII の切断部位を提供します。3) 4 塩基または 5 塩基の短い 3' 伸長とそれに続くブロッカー (通常はプロパンジオールのような短い伸長しない分子) により、除去されるまで DNA ポリメラーゼによる伸長が防止されます。rhPCR 反応は、プライマーとテンプレートが溶液中に自由に含まれている状態で始まります (図 1)。溶液中に自由に含まれている間は、これらのプライマーは RNase HII 酵素によってブロック解除されません。これは、切断されるテンプレートと RNA:DNA ヘテロ二本鎖になっている必要があるためです。テンプレートに結合すると、rhPCR プライマーは耐熱性 RNase HII 酵素によって切断されます。これによりブロックが解除され、DNA ポリメラーゼがプライマーから伸長できるようになります。 PCR 反応のサイクルによりプロセスが継続されます。rhPCR プライマーは、RNase H2 酵素による切断後もプライマーの Tm が PCR 反応のアニーリング温度よりも高くなるように設計されています。これらのプライマーは、5' ヌクレアーゼTaqmanとSYBR Green の両方のタイプの定量的 PCRで使用できます。

アプリケーション

rhPCR は定量的 PCRや医療または環境研究室で使用できます。

参照

参考文献

^ ab Dobosy JR、Rose SD、Beltz KR、Rupp SM、Powers KM、Behlke MA、Walder JA (2011 年 8 月)。「RNase H 依存 PCR (rhPCR): ブロックされた切断可能なプライマーを使用した特異性と一塩基多型の検出の向上」。BMC Biotechnology。11 : 80。doi : 10.1186 / 1472-6750-11-80。PMC 3224242。PMID 21831278。
^ エリン・D・ゴードン;シンプソン、ローラ J.リオス、シドニー L.リンゲル、ランド。ラホウィッツ＝スクロギンズ、マーラ E.ピーターズ、マイケル C.ヴェソロフスカ＝アンデルセン、アガタ。ゴンザレス、ジャンマリー R.マクロード、ハンナ・J.クリスチャン、ローラ S.ユアン、シャオペン。バリー、リアム。ウッドラフ、プレスコット G.アンセル、K.マーク。ノッカ、カール。セイボルト、マックス・A.フェイヒー、ジョン V. (2016 年 8 月 2 日) 「喘息におけるインターロイキン 33 の選択的スプライシングと 2 型炎症」。米国科学アカデミーの議事録。113 (31): 8765–8770。Bibcode :2016PNAS..113.8765G。doi : 10.1073/pnas.1601914113 . PMC 4978244 . PMID 27432971.
^ Boucard, Antony A.; Maxeiner, Stephan; Südhof, Thomas C. (2014年1月3日). 「ラトロフィリンはテネウリンに結合することで異好性細胞接着分子として機能する選択的スプライシングによる調節」Journal of Biological Chemistry . 289 (1): 387–402. doi : 10.1074/jbc.M113.504779 . PMC 3879561 . PMID 24273166.
^ Cahoon, A.; Nauss, John; Stanley, Conner; Qureshi, Ali (2017年2月20日). 「2種の緑藻類Chara vulgarisとChlamydomonas reinhardtiiのディープトランスクリプトームシーケンシングでは、オルガネラRNA編集の証拠は得られなかった」. Genes . 8 ( 2): 80. doi : 10.3390/genes8020080 . PMC 5333069. PMID 28230734.

[dobosy_2011-1] Dobosy JR、Rose SD、Beltz KR、Rupp SM、Powers KM、Behlke MA、Walder JA (2011 年 8 月)。「RNase H 依存 PCR (rhPCR): ブロックされた切断可能なプライマーを使用した特異性と一塩基多型の検出の向上」。BMC Biotechnology。11 : 80。doi : 10.1186 / 1472-6750-11-80。PMC 3224242。PMID 21831278。

[2] エリン・D・ゴードン;シンプソン、ローラ J.リオス、シドニー L.リンゲル、ランド。ラホウィッツ＝スクロギンズ、マーラ E.ピーターズ、マイケル C.ヴェソロフスカ＝アンデルセン、アガタ。ゴンザレス、ジャンマリー R.マクロード、ハンナ・J.クリスチャン、ローラ S.ユアン、シャオペン。バリー、リアム。ウッドラフ、プレスコット G.アンセル、K.マーク。ノッカ、カール。セイボルト、マックス・A.フェイヒー、ジョン V. (2016 年 8 月 2 日) 「喘息におけるインターロイキン 33 の選択的スプライシングと 2 型炎症」。米国科学アカデミーの議事録。113 (31): 8765–8770。Bibcode :2016PNAS..113.8765G。doi : 10.1073/pnas.1601914113 . PMC 4978244 . PMID 27432971.

[3] Boucard, Antony A.; Maxeiner, Stephan; Südhof, Thomas C. (2014年1月3日). 「ラトロフィリンはテネウリンに結合することで異好性細胞接着分子として機能する選択的スプライシングによる調節」Journal of Biological Chemistry . 289 (1): 387–402. doi : 10.1074/jbc.M113.504779 . PMC 3879561 . PMID 24273166.

[4] Cahoon, A.; Nauss, John; Stanley, Conner; Qureshi, Ali (2017年2月20日). 「2種の緑藻類Chara vulgarisとChlamydomonas reinhardtiiのディープトランスクリプトームシーケンシングでは、オルガネラRNA編集の証拠は得られなかった」. Genes . 8 ( 2): 80. doi : 10.3390/genes8020080 . PMC 5333069. PMID 28230734.