亜硫酸水素塩シーケンシング

亜硫酸水素塩^[1] シーケンシング（亜硫酸水素塩シーケンシングとも呼ばれる）は、通常のシーケンシングの前にDNAを亜硫酸水素塩処理してメチル化のパターンを決定する手法である。DNAメチル化は最初に発見されたエピジェネティックなマークであり、現在でも最も研究されている。動物では主に、ジヌクレオチドCpGのシトシン残基の炭素5位にメチル基が付加され、転写活性の抑制に関与している。

DNA を亜硫酸水素塩で処理すると、シトシン残基がウラシルに変換されますが、5-メチルシトシン残基は影響を受けません。そのため、亜硫酸水素塩で処理された DNA はメチル化されたシトシンのみを保持します。このように、亜硫酸水素塩処理は、個々のシトシン残基のメチル化状態に依存するDNA 配列の特定の変化を導入し、DNA セグメントのメチル化状態に関する一塩基分解能の情報をもたらします。この情報を取得するために、変更された配列に対してさまざまな分析を行うことができます。したがって、この分析の目的は、亜硫酸水素塩変換によって生じる一塩基多型(シトシンとチミジン) を区別することに簡略化されます (図 1)。

亜硫酸水素塩シーケンシングでは、亜硫酸水素塩処理したゲノム DNA に通常のシーケンシング方法を適用して、CpG ジヌクレオチドのメチル化状態を判断します。特定の遺伝子座またはゲノム全体のレベルでメチル化を調べるために、他の非シーケンシング戦略も使用されます。すべての戦略は、亜硫酸水素塩によって誘導される非メチル化シトシンのウラシルへの変換が完了していることを前提としており、これがその後のすべての技術の基礎となります。理想的には、使用される方法は各アレルのメチル化状態を個別に判断します。亜硫酸水素塩シーケンシングの代替方法には、複合亜硫酸水素塩制限分析とメチル化 DNA 免疫沈降(MeDIP) があります。

亜硫酸水素塩処理したDNAを分析する方法論は継続的に開発されており、急速に進化するこれらの方法論をまとめたレビュー記事が数多く執筆されている。^{[2] [3] [4] [5]}

一般的に、この方法論は、メチル化特異的PCR（MSP）に基づく戦略（図4）と、非メチル化特異的条件下で実行されるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する戦略（図3）に分けられます。マイクロアレイベースの方法でも、非メチル化特異的条件に基づくPCRが使用されます。

最初に報告された亜硫酸水素塩処理したDNAを用いたメチル化分析法では、PCRと標準的なジデオキシヌクレオチドDNAシーケンシングを利用して、亜硫酸水素塩変換に耐性のあるヌクレオチドを直接決定しました。^[6] プライマーは、鎖特異的かつ亜硫酸水素塩特異的（すなわち、亜硫酸水素塩処理していないDNAと相補的でない非CpGシトシンを含むプライマー）となるように設計され、目的のメチル化部位を挟みます（ただし、メチル化部位は含みません）。したがって、メチル化特異的PCRとは対照的に、メチル化配列と非メチル化配列の両方を増幅します。非メチル化シトシンのすべての部位は、センス鎖の増幅配列ではチミンとして、増幅されたアンチセンス鎖ではアデニンとして表示されます。PCRプライマーにハイスループットシーケンシングアダプターを組み込むことで、PCR産物を大規模並列シーケンシングで配列決定できます。あるいは、手間はかかりますが、PCR 産物をクローン化して配列決定することもできます。ネストされた PCR法を使用して、配列決定用に産物を強化することができます。

亜硫酸水素塩処理したDNAを使用したその後のすべてのDNAメチル化解析技術は、Frommerらによるこの報告に基づいています（図2）。^[6]他のほとんどの手法は真のシーケンシングベースの技術ではありませんが、「亜硫酸水素塩シーケンシング」という用語は、亜硫酸水素塩変換DNAメチル化解析技術全般を説明するためによく使用されます。

ピロシークエンシングは、メチル化特異的PCRを使用せずに亜硫酸水素塩処理したDNAを分析するためにも使用されています。^{[7] [8]} 対象領域のPCR増幅後、ピロシークエンシングを使用して、その領域内の特定のCpGサイトの亜硫酸水素塩変換配列を決定します。個々のサイトのCとTの比率は、配列拡張中に取り込まれたCとTの量に基づいて定量的に決定できます。この方法の主な制限は、テクノロジーのコストです。ただし、ピロシークエンシングは、ハイスループットスクリーニング方法への拡張を容易にします。

ウォンらによって説明されたこの技術の変種では、一塩基多型を配列プライマーの配列に組み込んだ対立遺伝子特異的プライマーを使用し、これにより母系対立遺伝子と父系対立遺伝子を個別に分析することが可能になる。^{[9]この技術は}ゲノムインプリンティング解析に特に有用である。

この方法は、一塩基多型（SNP）解析用に開発された一本鎖高次構造多型解析（SSCA）法に基づいています。 ^[10] SSCAは、非変性電気泳動における異なる移動に基づいて、サイズは同じだが配列が異なる一本鎖DNA断片を区別します。MS-SSCAでは、これを利用して、対象のCpG部位を含む亜硫酸水素塩処理されPCR増幅された領域を区別します。SSCAは、1つのヌクレオチドの違いしかない場合は感度が不足しますが、亜硫酸水素塩処理により、ほとんどの対象領域でCからTへの変換が頻繁に行われ、結果として得られる感度は100%に近づきます。MS-SSCAは、バンド強度の比に基づいてDNAメチル化の程度の半定量分析も提供します。ただし、この方法は、個々のメチル化部位ではなく、対象領域内のすべてのCpG部位全体を評価するために設計されています。

亜硫酸水素塩処理したDNAを変換していないDNAから区別するさらなる方法は、高解像度融解分析（HRM）を使用することです。これは、もともとSNPを区別するために設計された定量PCRベースの技術です。 ^[11] PCRアンプリコンは、温度上昇と融解中の挿入蛍光色素の遊離によって直接分析されます。アンプリコンのCからTの含有量で表されるメチル化の程度は、融解の速さとその結果としての色素の遊離を決定します。この方法は、単一チューブアッセイで直接定量化できますが、特定のCpGサイトではなく、増幅領域全体のメチル化を評価します。

MS-SnuPEは、もともと一塩基多型の解析のために設計されたプライマー伸長法を採用しています。^[12] DNAを亜硫酸水素塩で変換し、亜硫酸水素塩に特異的なプライマーを目的のCpGの直前の塩基対までの配列にアニールします。プライマーは、DNAポリメラーゼ終結ジデオキシヌクレオチドを使用してC（またはT）に1塩基対伸長し、CとTの比を定量的に決定します。

このC:T比を決定するには、いくつかの方法を使用できます。当初、MS-SnuPEは、プライマー伸長のレポーターとして放射性ddNTPに依存していました。蛍光ベースの方法やパイロシークエンシングも使用できます。^[13]ただし、2つの多型プライマー伸長産物を区別するためのマトリックス支援レーザー脱離イオン化/飛行時間（MALDI-TOF）質量分析は、本質的には、 SNPジェノタイピング用に設計されたGOODアッセイに基づいて使用できます。イオンペア逆相高速液体クロマトグラフィー（IP-RP- HPLC）もプライマー伸長産物を区別するために使用されています。^[14]

Ehrichらが最近発表した方法では、塩基特異的切断ステップを追加することで亜硫酸水素塩変換をさらに活用し、ヌクレオチドの変化から得られる情報を強化しています。^[15]最初に目的の領域をRNAに in vitro転写することにより（最初の増幅でPCRプライマーにRNAポリメラーゼプロモーター部位を追加することにより）、 RNase Aを使用してRNA転写物を塩基特異的部位で切断できます。RNase Aはシトシンおよびウラシルリボヌクレオチドで特異的にRNAを切断するため、シトシン特異的（C特異的）切断が必要な場合は切断耐性dTTPを組み込み、ウラシル特異的（U特異的）切断が必要な場合はdCTPを組み込むことで塩基特異性が達成されます。切断された断片は、 MALDI-TOFで分析できます。亜硫酸水素塩処理により、増幅された逆鎖において、CからUへの変換による切断部位の導入/除去、またはGからAへの変換による断片質量のシフトが起こります。C特異的切断は、すべてのメチル化されたCpG部位を特異的に切断します。結果として生じる断片のサイズを分析することにより、領域全体のメチル化の程度を決定するのではなく、領域内のCpG部位のDNAメチル化の特定のパターンを決定することができます。この方法は、ハイスループットスクリーニングの有効性を実証し、複数の組織内の多数のCpG部位をコスト効率よく 調べることを可能にしました。

この代替メチル化分析法も亜硫酸水素塩処理した DNA を使用するが、対象領域の配列を決定する必要がない。^{[16]代わりに、プライマー ペアは、未変換の}5-メチルシトシンのみを補完する配列を含めることで「メチル化特異的」になるように設計されるか、逆に「非メチル化特異的」になるように設計され、非メチル化シトシンから変換されたチミンを補完する。メチル化は、特定のプライマーが増幅を達成する能力によって決定される。この方法は、プライマー内の CpG ペアの数が増えるとアッセイの特異性が高まるため、メチル化密度が高い可能性のあるCpG アイランドを調べるのに特に有用である。プライマーの 3' 末端に CpG ペアを配置すると、感度も向上する。MSP を使用した最初の報告では、対立遺伝子の 0.1% のメチル化を検出するのに十分な感度が説明されている。一般に、MSP とその関連プロトコルは、特定の遺伝子座のメチル化状態を調べる場合に最も感度が高いと考えられている。

MethyLight法はMSPに基づいていますが、定量PCRを使用した定量分析を提供します。^[17] メチル化特異的プライマーが使用され、増幅領域にアニールするメチル化特異的蛍光レポータープローブも使用されます。別の方法として、関連する配列内のCpGペア間の区別が必要な場合は、プライマーまたはプローブをメチル化特異性なしで設計することができます。定量はメチル化された参照DNAを参照して行われます。このプロトコルを修正して、亜硫酸水素塩変換に成功したDNAに対するPCRの特異性を高めたConLight-MSPでは、亜硫酸水素塩変換されていないDNAに対する追加のプローブを使用して、この非特異的増幅を定量します。^[18]

MSP増幅DNAを用いたさらなる手法では、融解曲線分析（Mc-MSP）を用いて産物を分析する。^[19] この方法では、亜硫酸水素塩変換DNAをメチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーの両方で増幅し、融解曲線分析で生成された差分ピークを比較することで2つの産物の定量比を決定する。特に低レベルのメチル化を高感度に検出するために、定量PCRと融解分析の両方を使用する高解像度融解分析法が導入されている^[20]。

マイクロアレイベースの方法は、亜硫酸水素塩処理したDNAを解析してゲノム全体のメチル化解析を可能にするために利用可能な技術の論理的拡張である。^[21] オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、関心のあるCpG部位を標的とするオリゴヌクレオチド ハイブリダイゼーションプローブのペアを使用して設計される。1つは変更されていないメチル化配列に相補的であり、もう1つはCからUに変換された非メチル化配列に相補的である。プローブは亜硫酸水素塩に特異的でもあり、亜硫酸水素塩によって不完全に変換されたDNAへの結合を防ぐ。イルミナメチル化アッセイは、亜硫酸水素塩シーケンシング技術をマイクロアレイレベルで適用してゲノム全体のメチル化データを生成するそのようなアッセイの1つである。

亜硫酸水素塩シーケンシングは哺乳類ゲノム全体で広く使用されていますが、新しい哺乳類DNA修飾5-ヒドロキシメチルシトシンの発見により複雑な問題が発生しています。^{[22] [23]} 5-ヒドロキシメチルシトシンは亜硫酸水素塩処理によりシトシン-5-メチルスルホン酸に変換され、シーケンシング時にCとして読み取られます。^[24]そのため、亜硫酸水素塩シーケンシングでは5-メチルシトシンと5-ヒドロキシメチルシトシンを区別できません。これは、亜硫酸水素塩シーケンシングの出力が5-メチルシトシンと5-ヒドロキシメチルシトシンの複合体であるため、もはやDNAメチル化のみとして定義できないことを意味します。

亜硫酸水素塩シーケンシングは、すべての非メチル化シトシン残基をウラシルに変換することに依存しています。変換が不完全な場合、その後の分析では、変換されていない非メチル化シトシンがメチル化シトシンとして誤って解釈され、メチル化の偽陽性結果になります。一本鎖DNAのシトシンのみが亜硫酸水素塩の攻撃を受けやすいため、分析中のDNAの変性が重要です。 ^[2]温度や塩濃度などの反応パラメータが、DNAを一本鎖構造に維持し、完全な変換を可能にするのに適切であることを確認することが重要です。DNAをアガロースゲルに埋め込むと、DNA鎖が物理的に分離されるため、変換率が向上することが報告されています。^[25]不完全な変換率は、シーケンシングライブラリに内部コントロール（例えば、メチル化されていないことが知られているラムダファージDNA）を含めるか、亜硫酸水素塩シーケンシングリードを生物の既知のメチル化されていない領域（例えば、葉緑体ゲノム）にアラインメントさせることによって、シーケンシング後に推定および調整することができます。^[26]

亜硫酸水素塩シーケンシングにおける大きな課題は、変換と同時に起こる DNA の分解である。完全な変換に必要な条件、例えば長いインキュベーション時間、高温、高濃度の亜硫酸水素塩などにより、インキュベートされた DNA の約 90% が分解される可能性がある。^[27] 開始時の DNA 量は限られていることが多いため、このような広範囲の分解は問題となる可能性がある。分解は脱プリン化として起こり、ランダムな鎖切断を引き起こす。^{[28]したがって、目的の}PCR アンプリコンが長いほど、無傷のテンプレート分子の数は限られる可能性が高い。これは PCR 増幅の失敗、またはテンプレート分子のサンプリングが限られることによるメチル化レベルに関する定量的に正確な情報の喪失につながる可能性がある。したがって、採用した反応条件に起因する DNA 分解の量を評価し、これが目的のアンプリコンにどのような影響を与えるかを検討することが重要です。また、インキュベーション温度を循環させるなどの技術を使用して、DNA 分解を最小限に抑えることもできます。^[28]

2020年、ニューイングランドバイオラボは、 DNA損傷を最小限に抑えるための代替酵素アプローチであるNEBNext Enzymatic Methyl-seqを開発した。亜硫酸水素塩の代わりに、APOBECを使用してCをUに変換する。C、5mC、および5hmCの区別は、APOBECから修飾塩基を「保護」するさらなる修飾によって可能になる。^{[29] [30]}

亜硫酸水素塩処理後の潜在的に重大な問題は、溶液のアルカリ化が不十分なためにピリミジン残基の脱スルホン化が不完全になることです。これにより一部のDNAポリメラーゼが阻害され、その後のPCRが困難になる可能性があります。ただし、溶液のpHを監視して脱スルホン化が完全であることを確認することで、この状況を回避することができます。^[2]

最後の懸念は、亜硫酸水素塩処理によってサンプルの複雑さのレベルが大幅に低下し、複数のPCR反応を実行する場合に問題が発生する可能性があることです（2006）。^[5] プライマーの設計がより困難になり、不適切なクロスハイブリダイゼーションがより頻繁に発生します。

亜硫酸水素塩シーケンシングの進歩により、これまではDNAメチル化の全体的測定は制限ランドマークゲノムスキャンなどの他の技術でしか実現できなかったが、ゲノム規模で適用できるようになった。ヒトエピゲノムのマッピングは、多くの科学者からヒトゲノムプロジェクトの完了に対する論理的なフォローアップと見なされている。^{[31] [32]このエピゲノム情報は、遺伝子配列の機能がどのように実装され、制御されているかを理解するのに重要になる。エピゲノムはゲノムよりも安定性が低いため、}遺伝子と環境の相互作用において重要であると考えられている。^[33]

しかし、エピゲノムはゲノムよりもはるかに可変性が高いため、エピゲノムマッピングはゲノム配列決定よりも本質的に複雑です。人のエピゲノムは年齢とともに変化し、組織間で異なり、環境要因によって変化し、病気では異常を示します。しかし、さまざまな年齢、組織の種類、および病気の状態を表すこのような豊富なエピゲノムマッピングは、エピジェネティックマークの正常な機能だけでなく、老化や病気につながるメカニズムに関する貴重な情報をもたらします。

エピゲノムマッピングの直接的な利点には、クローン技術の進歩が期待される。正常な生存能力と寿命を持つクローン動物の生産に失敗する原因は、エピジェネティックマークの不適切なパターンにあると考えられている。また、異常なメチル化パターンは多くの癌でよく特徴付けられている。全体的な低メチル化はゲノム安定性の低下をもたらし、腫瘍抑制遺伝子 プロモーターの局所的な高メチル化は、その機能喪失の原因となることが多い。メチル化の特定のパターンは、特定の癌の種類を示し、予後価値があり、最適な治療方針を導くのに役立つ可能性がある。^[32]

大規模なエピゲノムマッピングの取り組みは世界中で進行中であり、ヒトエピゲノムプロジェクト^[33]の下で組織されています。これは多層戦略に基づいており、限られた数の参照エピゲノムの高解像度のメチル化プロファイルを取得するために亜硫酸水素塩シーケンシングが使用され、より広範なサンプルに対してはそれほど徹底的ではない分析が行われます。このアプローチは、高解像度のゲノム全体のマッピングが依然としてコストのかかる作業であるため、与えられた量のリソースから得られる洞察を最大化することを目的としています。

遺伝子セット解析（例えばDAVIDやGoSeqのようなツールを使用）は、ハイスループットメチル化データ（ゲノムワイド亜硫酸水素塩シーケンシングなど）に適用すると、大きな偏りが生じることが示されています。これは、サンプルラベルの順列を使用するか、各遺伝子を標的とするCpGプローブ/CpGサイトの数の差を制御する統計モデルを使用することで修正できることが示唆されています。^[34]

5-メチルシトシンと5-ヒドロキシメチルシトシンは、どちらも亜硫酸水素塩シーケンシングではCとして読み取られます。^[24]酸化亜硫酸水素塩シーケンシング（oxBS）では、Tetを使用して5-ヒドロキシメチルシトシンを5-ホルミルシトシンに変換し、その後亜硫酸水素塩処理中にウラシルに変換します。^[35]その後Cとして読み取られる唯一の塩基は5-メチルシトシンであり、DNAサンプルの実際のメチル化状態のマップを提供します。5-ヒドロキシメチルシトシンのレベルは、亜硫酸水素塩シーケンシングと酸化亜硫酸水素塩シーケンシングの差を測定することによっても定量化できます。

シカゴ大学のチュアン・ヘによる別の方法、Tet 補助酸化的亜硫酸水素塩シーケンシング (TAB-Seq) では、塩基の変換方法が異なります。5hmC は C として読み取られますが、5mC と C は両方とも T として読み取られます。これを実現するために、5hmC 塩基は最初に β-グルコシル-5-ヒドロキシメチルシトシン (5gmC) に変換することで「保護」されます。Tet 酵素が導入され、すべての 5mC が 5caC に変換されます。次に亜硫酸水素塩が C と 5caC の両方をウラシルに変換します。PCR 増幅では 5gmC が C のように読み取られます。^[36]

• 低表現バイサルファイトシーケンシング

• 亜硫酸水素塩変換プロトコル
• ヒトエピゲノムプロジェクト (HEP) - データ - サンガー研究所
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