トランスクリプトーム

トランスクリプトームは、個々の細胞または細胞集団における、コーディングと非コーディングを含むすべてのRNA転写産物のセットです。この用語は、特定の実験に応じて、すべての RNAを指す場合もあれば、単にmRNA を指す場合もあります。トランスクリプトームという用語は、トランスクリプトとゲノムを組み合わせた造語であり、転写という生物学的プロセス中の転写産物生成プロセスに関連しています。

トランスクリプトームアノテーションの初期段階は、1980年代に公開されたcDNAライブラリーから始まりました。その後、ハイスループット技術の出現により、トランスクリプトームに関するデータをより迅速かつ効率的に取得できるようになりました。トランスクリプトームの研究には、ハイブリダイゼーションベースの技術であるDNAマイクロアレイと、シーケンスベースのアプローチであるRNA-seqという2つの生物学的技術が使用されています。 ^[1] RNA-seqは推奨される方法であり、 2010年代以降は主要なトランスクリプトミクス技術となっています。単一細胞トランスクリプトミクスでは、個々の細胞内での転写産物の変化を経時的に追跡できます。

トランスクリプトームから得られたデータは、細胞分化、発癌、転写調節、バイオマーカー発見などのプロセスへの洞察を得るための研究に使用されています。トランスクリプトームから得られたデータは、進化の過程での系統関係の確立や体外受精にも応用されています。トランスクリプトームは、他の-omeベースの生物学研究分野と密接に関連しています。プロテオームやメタボロームを補完し、特定の種類の RNA 転写物を研究する ome フィールドとして見ることができるトランスラトーム、エクソーム、メイオーム、タナトトランスクリプトームを包含しています。トランスクリプトームと他の -ome の間には定量化可能で保存された関係があり、トランスクリプトミクスデータは代謝物などの他の分子種を予測するために効果的に使用できます。^[2]公開されているトランスクリプトームデータベースは数多くあります。

トランスクリプトームという言葉は、トランスクリプトとゲノムを組み合わせた造語です。これは、接尾辞-omeと-omicsを使用して形成された他の新語とともに、生命科学と技術分野でゲノム全体の規模で実施されるすべての研究を表すために登場しました。そのため、トランスクリプトームとトランスクリプトミクスは、ゲノムとプロテオームとともに最初に登場した単語の1つでした。^[3]カイコのmRNAのcDNAライブラリのコレクションの事例を提示した最初の研究は、 1979年に発表されました。^[4]生物のトランスクリプトームに言及し調査した最初の独創的な研究は、1997年に発表され、遺伝子発現の連続分析(SAGE)を使用してS. cerevisiae^{で発現した60,633の転写産物について説明しました。 [5]ハイスループット技術と}バイオインフォマティクスの台頭と、それに続く計算能力の向上により、膨大な量のデータの特徴付けと分析がますます効率的かつ容易になりました。^[3] 1980年代に自動化されたDNAシーケンシングが登場したことで、トランスクリプトームの特徴を明らかにする試みがより顕著になりました。^[6] 1990年代には、発現配列タグシーケンシングが遺伝子とその断片の同定に使用されました。^{[7]その後、遺伝子発現の連続解析（SAGE）、}遺伝子発現のキャップ解析（CAGE）、超並列シグネチャシーケンシング（MPSS）などの技術が続きました。

トランスクリプトームは、特定の生物または実験サンプル中に存在するすべてのリボ核酸(RNA) 転写産物を包含する。 ^{[8] RNA は、} DNA を生物の表現型に変換するプロセスを担う遺伝情報の主なキャリアである。遺伝子は、転写と呼ばれる分子プロセスを通じて一本鎖のメッセンジャー RNA (mRNA) を生成することができる。この mRNA は、その起源である DNA 鎖と相補的である。^[6] RNA ポリメラーゼ II酵素は、テンプレート DNA 鎖に結合し、 mRNA 転写産物の伸長配列の 3' 末端へのリボヌクレオチドの付加を触媒する。^[9]

RNAポリメラーゼIIは、その機能を開始するために、遺伝子の上流（5'）にあるプロモーター配列を認識する必要がある。真核生物では、このプロセスは転写因子によって媒介され、最も顕著なのは転写因子II D（TFIID）で、TATAボックスを認識し、RNAポリメラーゼを適切な開始部位に配置するのに役立つ。RNA転写産物の生成を完了するために、通常は終結配列から数百ヌクレオチド離れたところで終結が起こり、切断が起こる。 ^[9]このプロセスは、mRNA分子がキャップされ、スプライシングされ、ポリアデニル化されて安定性が増してから細胞質に運ばれるRNAプロセシングとともに細胞核で起こる。mRNAは、リボソームで行われる翻訳プロセスを通じてタンパク質を生成する。

ほぼすべての機能的転写産物は既知の遺伝子に由来します。唯一の例外は、既知の遺伝子のプロモーター付近で遺伝子発現を制御する上で直接的な役割を果たす可能性がある少数の転写産物です。(エンハンサー RNAを参照)

遺伝子は原核生物ゲノムの大部分を占めるため、そのゲノムのほとんどは転写されます。多くの真核生物ゲノムは非常に大きく、既知の遺伝子はゲノムのほんの一部しか占めない場合があります。たとえば、哺乳類では、既知の遺伝子はゲノムの40〜50％を占めるだけです。^[10]それにもかかわらず、特定された転写産物はゲノムのはるかに大きな部分にマッピングされることが多く、これはトランスクリプトームに遺伝子に由来しない偽の転写産物が含まれていることを示唆しています。これらの転写産物の一部は、転写された疑似遺伝子または変性トランスポゾンやウイルスにマッピングされるため、非機能的であることが知られています。その他は、ジャンクDNAである可能性のあるゲノムの未確認領域にマッピングされます。

偽の転写は真核生物、特にジャンクDNAを多く含む可能性のある大きなゲノムを持つ生物では非常に一般的です。^{[11] [12] [13] [14]}一部の科学者は、転写産物が既知の遺伝子に割り当てられていない場合、それが機能することが示されるまで、デフォルトでジャンクRNAであると想定する必要があると主張しています。^{[11] [15]これは、大きなゲノムを持つ種のトランスクリプトームの多くはおそらくジャンクRNAであることを意味します。（}非コードRNAを参照）

トランスクリプトームには、タンパク質コード遺伝子の転写産物 (mRNA とイントロン) と非コード遺伝子の転写産物 (機能的 RNA とイントロン) が含まれます。

• リボソーム RNA /rRNA: 通常、トランスクリプトーム内で最も豊富な RNA。
• 長い非コード RNA /lncRNA: 200 ヌクレオチドを超える長さの非コード RNA 転写物。このグループのメンバーは、イントロン以外の非コード トランスクリプトームの最大部分を構成します。これらの転写物のうち、どれだけが機能的で、どれだけがジャンク RNA であるかは不明です。
• 転移RNA /tRNA
• マイクロRNA / miRNA：長さ19～24ヌクレオチド（nt）。マイクロRNAは、転写後レベルでのRNA干渉のプロセスによってmRNAの発現レベルをアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションします。 ^[3]
• 低分子干渉RNA /siRNA: 20-24 nt
• 小さな核小体RNA /snoRNA
• Piwi相互作用RNA /piRNA：24-31 nt。アルゴノートファミリーのPiwiタンパク質と相互作用し、トランスポゾンを標的にして切断する機能を持つ。^[16]
• エンハンサーRNA /eRNA: ^[3]

ヒトゲノムでは、すべての遺伝子が RNA に転写されます。これは、分子遺伝子がこのように定義されるためです。(遺伝子を参照してください。) トランスクリプトームは、mRNA のコーディング領域と、非コーディング UTR、イントロン、非コーディング RNA、および偽の非機能的トランスクリプトで構成されます。

トランスクリプトームの内容を確立することは、いくつかの要因によって困難です。これには、選択的スプライシング、RNA編集、選択的転写などが含まれます。^[17]さらに、トランスクリプトーム技術は、特定の時点でサンプル内で発生する転写を捕捉することができますが、トランスクリプトームの内容は分化中に変化する可能性があります。^[6]トランスクリプトミクスの主な目的は次のとおりです。「mRNA、非コードRNA、小型RNAを含むすべての種類の転写物をカタログ化し、開始部位、5'末端と3'末端、スプライシングパターン、その他の転写後修飾の観点から遺伝子の転写構造を決定し、発達中およびさまざまな条件下での各転写物の発現レベルの変化を定量化します。」^[1]

この用語は、特定の生物における転写産物の全セット、または特定の細胞型に存在する転写産物の特定のサブセットに適用できます。 特定の細胞株に対しておおよそ固定されている (突然変異を除く)ゲノムとは異なり、トランスクリプトームは外部の環境条件によって変化する可能性があります。 トランスクリプトームには細胞内のすべての mRNA 転写産物が含まれるため、転写減衰などの mRNA 分解現象を除いて、トランスクリプトームは任意の時点で活発に発現されている遺伝子を反映します。トランスクリプトミクスの研究(発現プロファイリング、スプライスバリアント解析などを含む) では、特定の細胞集団における RNA の発現レベルを調べます。多くの場合、mRNA に焦点を当てますが、tRNA や sRNA などの他の要素も含めることがあります。

トランスクリプトミクスは、文字列のリスト（「リード」）をオブジェクト（ゲノム内の「トランスクリプト」）に割り当てる定量科学です。発現強度を計算するには、各オブジェクトに対応するリードの密度をカウントします。^{[18]当初、トランスクリプトームは、}発現配列タグライブラリと遺伝子発現のシリアルおよびキャップ分析（SAGE）を使用して分析および研究されました。

現在、2つの主要なトランスクリプトミクス技術には、 DNAマイクロアレイとRNA-Seqがあります。どちらの技術も、RNA抽出技術によるRNAの単離、その後の他の細胞成分からの分離、mRNAの濃縮が必要です。^{[19] [20]}

トランスクリプトーム配列を推測する方法は一般的に2つあります。1つは、配列リードを参照ゲノム（トランスクリプトームを研究している生物自体または近縁種のゲノム）にマッピングする方法です。もう1つの方法であるde novoトランスクリプトームアセンブリは、ソフトウェアを使用して短い配列リードから直接トランスクリプトを推測するもので、配列が決定されていないゲノムを持つ生物に使用されます。^[21]

最初のトランスクリプトーム研究はマイクロアレイ技術（DNAチップとも呼ばれる）に基づいていた。マイクロアレイは「プローブ」と呼ばれるオリゴヌクレオチドが配列されたスポットを持つ薄いガラス層で構成されており、各スポットには既知のDNA配列が含まれている。^[22]

マイクロアレイ分析を行う際、mRNA はコントロールと実験サンプルから収集されます。後者は通常、疾患の代表です。目的の RNA は安定性を高めるために cDNA に変換され、 2 つのグループに対して通常は緑と赤の 2 色の蛍光体でマークされます。cDNA はマイクロアレイの表面に広げられ、チップ上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、レーザーを使用してスキャンされます。マイクロアレイの各スポットの蛍光強度は遺伝子発現のレベルに対応しており、選択された蛍光体の色に基づいて、どのサンプルが目的の mRNA のレベルが高いかを判断できます。^[7]

1 つのマイクロアレイには通常、既知の遺伝子すべてを表すのに十分なオリゴヌクレオチドが含まれていますが、マイクロアレイを使用して取得されたデータでは、未知の遺伝子に関する情報は提供されません。2010 年代には、マイクロアレイは DNA 配列に基づく次世代技術にほぼ完全に置き換えられました。

RNAシーケンシングは次世代シーケンシング技術であり、少量のRNAのみを必要とし、ゲノムに関する事前の知識は必要ありません。^[3] RNA転写物の定性的分析と定量的分析の両方が可能で、前者は新しい転写物の発見を可能にし、後者はサンプル内の転写物の相対的な量を測定することができます。^[16]

あらゆる生物学的サンプルのトランスクリプトームを配列決定する3つの主なステップは、RNAの精製、RNAまたはcDNAライブラリの合成、およびライブラリの配列決定である。^[16] RNAの精製プロセスは、短いRNAと長いRNAで異なる。^[16]このステップの後には通常、DNAやサンプル処理に関連する技術的汚染物質などの汚染物質を回避する目的でRNA品質の評価が続く。RNAの品質は、260 nmの吸光度ピークを持つUV分光法を使用して測定される。^[23] RNAの完全性は、RNA完全性番号（RIN）スコアで報告される28S RNAと18S RNAの比率と強度を比較して定量的に分析することもできる。 ^[23] mRNAが対象種であり、その総含有量のわずか3％を占めるため、RNAサンプルはrRNAとtRNA、および組織特異的RNA転写産物を除去するように処理する必要がある。^[23]

短いcDNA断片を生成することを目的としたライブラリー調製のステップは、50～300塩基対の長さの転写産物へのRNA断片化から始まります。断片化は、酵素的（RNAエンドヌクレアーゼ）、化学的（トリスマグネシウム塩緩衝液、化学的加水分解）、または機械的（超音波処理、噴霧化）のいずれかです。^[24] 逆転写はRNAテンプレートをcDNAに変換するために使用され、オリゴDT、ランダムプライマーの使用、または特殊なアダプターオリゴの連結を含む3つのプライミング方法を使用してこれを達成できます。

転写は、単一細胞トランスクリプトミクスによって個々の細胞レベルで研究することもできます。単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）は、細菌を含む単一細胞のトランスクリプトームの分析を可能にする最近開発された技術です。^[25]単一細胞トランスクリプトミクスでは、対象組織を構成する細胞タイプのサブポピュレーションも考慮されます。^[26]このアプローチにより、実験サンプルの変化が増殖によるものではなく、表現型の細胞変化によるものかどうかを特定できます。増殖の場合は、サンプル内で特定の細胞タイプが過剰発現する可能性があります。^{[27]さらに、}分化による細胞の進行を評価する場合、平均発現プロファイルでは、細胞を発達段階ではなく時間で順序付けることしかできず、その結果、特定の段階に固有の遺伝子発現レベルの傾向を示すことができません。^[28]単一細胞トランスクリプトーム技術は、循環腫瘍細胞、固形腫瘍中の癌幹細胞、哺乳類の胚盤胞中の胚性幹細胞（ESC）などの希少細胞集団の特徴を明らかにするために使用されてきた。^[29]

単一細胞トランスクリプトミクスには標準化された技術はないが、いくつかのステップを踏む必要がある。最初のステップは細胞分離で、これは低スループットおよび高スループット技術を使用して実行できる。その後、qPCR ステップ、そして単一細胞 RNAseq が続き、ここで目的の RNA が cDNA に変換される。単一細胞トランスクリプトミクスの最近の開発により、組織の薄いスライスを凍結切片化し、各スライスのトランスクリプトームを配列決定することで、組織および細胞内の局在を保存できるようになった。別の技術では、単一転写産物を顕微鏡下で視覚化しながら、それらが発現する個々の細胞の空間情報を保存することが可能である。^[29]

異なる細胞集団で異なって発現する遺伝子の識別を支援するために、多数の生物固有のトランスクリプトーム データベースが構築され、注釈が付けられています。

RNA-seqは生物のトランスクリプトームを測定するための最適な方法として浮上しつつあります（2013年）が、古い技術であるDNAマイクロアレイもまだ使用されています。^{[1] RNA-seqは、長いRNAを}cDNA断片のライブラリに変換することで、特定の遺伝子の転写を測定します。次に、cDNA断片はハイスループットシーケンシング技術を使用して配列決定され、参照ゲノムまたはトランスクリプトームにアラインメントされ、遺伝子の発現プロファイルを作成するために使用されます。^[1]

幹細胞と癌細胞のトランスクリプトームは、細胞分化と発癌のプロセスを理解しようとする研究者にとって特に興味深いものです。RNA-seqまたは遺伝子アレイデータを使用したパイプラインは、幹細胞と前駆細胞で発生する遺伝子変化を追跡するために使用でき、前駆細胞型と成熟細胞からの少なくとも3つの独立した遺伝子発現データが必要です。^[30]

ヒトの卵母細胞と胚のトランスクリプトームの解析は、初期胚発生を制御する分子メカニズムとシグナル伝達経路を理解するために使用されており、理論的には体外受精で適切な胚選択を行うための強力なツールとなる可能性がある。^[要出典]体外受精および胚移植（IVT-ET）における妊娠第1期の胎盤のトランスクリプトーム内容の解析により、周産期の有害転帰の頻度が高いことに関連する遺伝子発現の差異が明らかになった。このような洞察は、診療を最適化するために使用できる。^[31]トランスクリプトーム解析は、プロセスに関連する損傷を軽減することで、卵母細胞の凍結保存を最適化するためにも使用できる。^[32]

トランスクリプトミクスは、薬物の安全性評価や化学物質のリスク評価に使用されるバイオマーカーの発見における新興かつ継続的な成長分野です。^[33]

トランスクリプトームは個体間の系統関係を推測したり、トランスクリプトームの保存の進化パターンを検出したりするためにも使用されることがある。 ^[34]

トランスクリプトーム解析は、アンチセンス転写の発生頻度、周囲の遺伝子との相互作用による遺伝子発現における役割、および異なる染色体におけるその存在量を発見するために使用されました。^[35] RNA-seqはまた、同じ遺伝子に由来するが異なる構造を持つ転写産物であるRNAアイソフォームが、限られたゲノムから複雑な表現型を生み出す方法を示すために使用されました。^[21]

トランスクリプトーム解析は、植物種の進化と多様化の過程を研究するために使用されてきました。2014年には、 1000植物ゲノムプロジェクトが完了し、緑色植物、灰色植物、紅色植物の科に属する1,124種の植物のトランスクリプトームが配列決定されました。その後、タンパク質コード配列を比較して、植物間の系統関係を推測し、進化の過程で多様化した時期を特徴付けました。 ^{[36]トランスクリプトーム研究は、成熟した}花粉の遺伝子発現を特徴付け、定量化するために使用されてきました。細胞壁代謝と細胞骨格に関与する遺伝子が過剰発現していることがわかりました。トランスクリプトームアプローチにより、小胞子から成熟した花粉粒に至るまで、花粉のさまざまな発達段階を通じて遺伝子発現の変化を追跡することもできます。さらに、このような段階は、シロイヌナズナ、イネ、タバコなど、さまざまな植物の種間で比較できます。^[37]

他のオミクスベースの技術と同様に、トランスクリプトームの分析により、実験的に仮説を検証する際に偏りのないアプローチが可能になります。このアプローチにより、シグナル伝達経路における新しいメディエーターの発見も可能になります。^{[18]他のオミクスベースの技術と同様に、トランスクリプトームは}マルチオミクスアプローチの範囲内で分析できます。これはメタボロミクスを補完しますが、プロテオミクスとは異なり、トランスクリプトと代謝物との直接的な関連性を確立することはできません。

トランスクリプトームのサブカテゴリとして考えられる -ome フィールドがいくつかあります。エクソームは、特定の細胞集団で見つかった RNA 分子のみを含み、通常は分子のアイデンティティに加えて各 RNA 分子の量または濃度を含むという点でトランスクリプトームと異なります。さらに、トランスクリプトームは、翻訳中の RNA のセットである トランスラトームとも異なります。

機能ゲノミクスでは、減数分裂トランスクリプトーム、つまり減数分裂の過程で生成されるRNA転写産物のセットを表すために、メイオームという用語が使用されています。^[38]減数分裂は有性生殖する真核生物の重要な特徴であり、相同染色体の対合、シナプス、および組み換えが関与しています。ほとんどの生物の減数分裂は短期間で起こるため、減数分裂細胞（マイオサイト）の分離（または濃縮）が困難なため、減数分裂トランスクリプトのプロファイリングは困難です。トランスクリプトーム解析と同様に、メイオームは大規模なトランスクリプトーム技術を使用して全ゲノムレベルで研究できます。 [39]メイオームは、哺乳類および酵母システムでは十分に特徴付けられていますが、植物ではそれほど広範囲には特徴付けられていません。 [ ^{40 ]}

タナトトランスクリプトームは、死後24～48時間にわたって死体の内臓で発現し続ける、または再発現し始めるすべてのRNA転写産物から構成されます。一部の遺伝子には胎児発育後に抑制される遺伝子も含まれます。タナトトランスクリプトームがプログラム細胞死（アポトーシス）のプロセスに関連している場合、アポトーシスタナトトランスクリプトームと呼ばれることがあります。タナトトランスクリプトームの分析は法医学で使用されています。^[41]

eQTLマッピングは、DNAレベルでの遺伝子変異とRNAレベルでの遺伝子発現測定など、トランスクリプトミクスでゲノミクスを補完するために使用できます。^[42]

トランスクリプトームは、プロテオーム、つまりゲノムによって表現されるタンパク質 の全体セットのサブセットとして見ることができます。

しかし、相対的なmRNA発現レベルの分析は、mRNA発現の比較的小さな変化が細胞内に存在する対応するタンパク質の総量に大きな変化をもたらす可能性があるという事実によって複雑になる可能性がある。遺伝子セットエンリッチメント分析として知られる分析方法の1つは、異なる細胞集団でアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている個々の遺伝子ではなく、共調節された遺伝子ネットワークを特定する。^[1]

マイクロアレイ研究では細胞内の異なるmRNAの相対量を明らかにすることができますが、mRNAのレベルはそれらがコードするタンパク質の発現レベルに直接比例するわけではありません。 ^[43]特定のmRNA分子をテンプレートとして使用して合成されるタンパク質分子の数は、mRNA配列の翻訳開始特性に大きく依存します。特に、翻訳開始配列の能力は、タンパク質翻訳のためのリボソームのリクルートメントにおける重要な決定要因です。

• アンサンブル: [2]
• オミックツールズ: [3]
• トランスクリプトームブラウザ: [4]
• アレイエクスプレス: [5]