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TaqManプローブは、定量PCRの特異性を高めるために設計された加水分解 プローブです。この方法は、1991年にCetus Corporationの研究者Kary Mullisによって初めて報告され、 [1]その後、この技術はHoffmann-La Rocheによって診断アッセイ用に、Applied Biosystems（現在はThermo Fisher Scientificの一部門）によって研究用途向けに開発されました。
TaqManプローブの原理は、Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を利用して、相補的な標的配列へのハイブリダイゼーション中に二重標識プローブを切断し、蛍光体ベースの検出を行う。[2]他の定量PCR法 と同様に、得られた蛍光信号により、PCRの指数関数的段階での産物の蓄積を定量的に測定できるが、TaqManプローブは検出の特異性を大幅に高める。TaqManプローブは、そのメカニズムがパックマンの原理に基づいていることから、ビデオゲームのパックマン（Taqポリメラーゼ+パックマン=TaqMan）にちなんで名付けられた。[3]
原理
TaqManプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの5'末端に共有結合した蛍光体と、3'末端の消光剤で構成されています。[4]数種類の蛍光体（例： 6-カルボキシフルオレセイン、略称：FAM、またはテトラクロロフルオレセイン、略称：TET）と消光剤（例：テトラメチルローダミン、略称：TAMRA）が利用可能です。[5]消光剤分子は、サイクラーの光源によって励起されたときに、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を介して蛍光体から放出された蛍光を消光します。 [6]蛍光体と消光剤が近接している限り、消光によって蛍光シグナルが阻害されます。
TaqMan プローブは、特定のプライマー セットによって増幅された DNA 領域内でアニールするように設計されています。(図とは異なり、プローブは一本鎖 DNA に結合します。) TaqMan プローブは、ターゲット シーケンスへの結合親和性を高めるために、マイナー グルーブ バインダー (MGB) 部分、ジヒドロシクロピロロインドール トリペプチド (DPI 3 ) に結合できます。MGB 結合プローブは、ファンデルワールス力の安定化が増すため、融点 (T m ) が高くなります。Taq ポリメラーゼがプライマーを伸長し、新生鎖 (一本鎖テンプレートから) を合成すると、Taq ポリメラーゼの 5' から 3' へのエキソヌクレアーゼ活性によって、テンプレートにアニールしたプローブが分解されます。プローブが分解すると、プローブから蛍光体が放出され、消光剤との近接性が失われるため、消光効果が軽減され、蛍光体が蛍光を発するようになります。したがって、定量PCRサーマルサイクラーで検出される蛍光は、放出された蛍光体とPCR中に存在するDNAテンプレートの量に正比例します。
アプリケーション
TaqMan プローブベースのアッセイは、研究室や医療研究室での定量的 PCRに広く使用されています。
参照
注釈と参考文献
- ^ Holland, PM; Abramson, RD; Watson, R.; Gelfand, DH (1991). 「Thermus aquaticus DNAポリメラーゼの5'----3'エキソヌクレアーゼ活性を利用した特異的ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出」。米国 科学アカデミー紀要。88 (16): 7276– 7280。Bibcode : 1991PNAS ...88.7276H。doi : 10.1073 / pnas.88.16.7276。PMC 52277。PMID 1871133。
- ^ TaqMan 遺伝子発現 - NCBI プロジェクト
- ^ リアルタイム TaqMan PCR と獣医学への応用 - PacMan から TaqMan へ - コンピュータ ゲームの再考 2009-05-05 にWayback Machineでアーカイブ
- ^ TaqMan プローブ: 概要、機能、アプリケーション
- ^ Kutyavin IV、Afonina IA、Mills A、Gorn VV、Lukhtanov EA、Belousov ES、Singer MJ、Walburger DK、Lokhov SG、Gall AA、Dempcy R、Reed MW、Meyer RB、Hedgpeth J (2000)。「3′-マイナー溝バインダー-DNAプローブはPCR伸長温度での配列特異性を高める」。Nucleic Acids Res . 28 (2): 655– 661. doi :10.1093/nar/28.2.655. PMC 102528 . PMID 10606668。
- ^ Bustin SA (2000年10月). 「リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを用いたmRNAの絶対定量」J. Mol. Endocrinol . 25 (2): 169– 93. doi : 10.1677/jme.0.0250169 . PMID 11013345.
- ^ AlleleID - 細菌同定のためのアッセイ設計
外部リンク
1. TaqMan RT-PCR リソース - プライマー データベース、ソフトウェア、プロトコル。Wayback Machine
に 2010-11-25 にアーカイブされました
。2. Beacon Designer - SYBR Green プライマー、TaqMan プローブ、分子ビーコンなどのリアルタイム PCR プライマーとプローブを設計するためのソフトウェア。