オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応

オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（またはOE-PCR ）はPCRの変種です。オーバーラップ伸長によるスプライシング/オーバーハング伸長（SOE）PCRとも呼ばれます。複数の小さな二本鎖DNA断片をより大きなDNA配列に組み立てるために使用されます。OE -PCRは、配列の特定のポイントに変異を挿入したり、小さなDNA断片からカスタムDNA配列をより大きなポリヌクレオチドに組み立てたりするために広く使用されています。^[1]

ほとんどの PCR 反応と同様に、1 つの配列につき 2 つのプライマー (各末端に 1 つずつ) が使用されます。2 つの DNA 分子を接合するには、結合する末端に特別なプライマーを使用します。各分子について、結合する末端のプライマーは、もう一方の分子の末端と相補的な 5' オーバーハングを持つように構築されます。複製が発生すると、アニーリングに続いて、DNA は、結合する分子と相補的な新しい配列によって延長されます。両方の DNA 分子がこのように延長されると、それらを混合し、遠端のプライマーのみを使用して PCR を実行します。導入された重複する相補的な配列がプライマーとして機能し、2 つの配列が融合されます。この方法は、制限部位を必要としない点で他の遺伝子接合技術よりも優れています。

より高い収量を得るために、非対称 PCR の場合と同様に、一部のプライマーは過剰に使用されます。

DNA 配列に変異を挿入するには、特定のプライマーを設計します。プライマーには、単一の置換が含まれる場合もあれば、5' 末端に新しい配列が含まれる場合もあります。削除が必要な場合は、削除の 5' 側の配列が追加されます。これは、プライマーがテンプレート DNA に十分にアニールできるように、プライマーの 3' 末端がテンプレート鎖と相補性を持つ必要があるためです。

プライマーがテンプレートにアニーリングした後、DNA 複製はテンプレートの末端まで進みます。二重鎖は変性し、2 番目のプライマーは最初のプライマーの配列を含む新しく形成された DNA 鎖にアニーリングします。複製が進み、変異を含む必要な配列の鎖が生成されます。

二重鎖は再び変性し、最初のプライマーは最新の DNA 鎖に結合できるようになります。複製反応は継続して、完全に二量体化したDNA 断片を生成します。さらに PCR サイクルを実行して DNA を増幅し、サンプルをアガロース ゲル電気泳動で分離し、電気溶出させて収集します。

長さが約 110 ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドを効率的に生成することは非常に難しいため、110 nt プライマーで可能な範囲を超えてシーケンスに変異を挿入するには、オーバーラップ エクステンション PCR を使用する必要があります。OE-PCR では、上記の手法を使用して、変更するシーケンスを使用して、反対側の端に変異がある 2 つの変更された鎖を作成します。混合および変性後、鎖をアニールして、図に詳細が示されている 3 つの異なる組み合わせを生成します。5' 末端にオーバーラップのない二重鎖のみが、DNA ポリメラーゼによる 3' から 5' 方向の伸長を可能にします。

OE-PCR 反応の延長後、PCR ミックスまたは適切なサイズの溶出断片は、最初の変異誘発 PCR 反応で使用された最も外側のプライマーを使用して、通常の PCR にかけられます。

さらに、OE-PCRと非対称PCRを組み合わせることで、部位特異的変異誘発の効率を向上させることができる可能性がある。^[2]

オーバーラップ伸長PCRは、変異の導入以外にも、どの位置でも不要なヌクレオチドを導入することなく複雑なDNA配列を組み立てるために広く使用されています。これは、OE-PCRが補完的なオーバーハングを利用して、カスタムDNA断片を希望の順序で傷のないスプライシングを導くため可能です。これがOE-PCRや、ギブソンアセンブリなどの他の長鎖相同性に基づくクローニング方法の主な利点であり、従来の制限酵素消化やライゲーションクローニング方法の限界を克服しています。 ^[3]

OE-PCR によるカスタム DNA 配列の組み立ては、3 つの主なステップで構成されます。まず、異なるテンプレートから PCR によって個々の DNA 配列が増幅され、必要な相補オーバーハングが両側に配置されます。次に、以前に得られた PCR 産物がオーバーラップ拡張 PCR 反応に組み合わされ、相補オーバーハングがペアで結合してポリメラーゼが DNA 鎖を拡張できるようになります。最後に、外部オーバーハングをターゲットとする外部プライマーが使用され、最終的な PCR 反応で目的の DNA 産物が増幅されます。

OE-PCR ベースの DNA アセンブリの全体的な成功は、いくつかの要因に依存しますが、最も重要なのは、アセンブリする DNA 配列の固有の特徴、重複するオーバーハングの配列と長さ、最終増幅用の外側のプライマーの設計、および PCR 反応の条件です。通常、2 ～ 6 個のフラグメントを 1 回の OE-PCR 反応に同時に組み込むことができます。^[4]フラグメント間の適切な相互作用を確保するには、オーバーハングの長さは少なくとも 40 ヌクレオチドである必要があります。最終増幅プライマーは、PCR の一般的なガイドラインに従って設計されるのが一般的ですが、標準の PCR 反応よりも 2 ～ 5 倍低い濃度で使用されます。これにより、望ましくない増幅が削減されることが示されています。^{[5]さらに、}プルーフリーディングDNA ポリメラーゼ の使用が強く推奨されます。