DNA複製

細胞が分裂するためには、まずDNAを複製する必要があります。^{[ 27 ]} DNA複製は全か無かのプロセスです。複製が始まると、完了するまで続きます。複製が完了すると、同じ細胞周期では再び起こりません。これは、複製前複合体の開始の分裂によって可能になります。

後期分裂期および初期G1 期において、開始タンパク質の大きな複合体が、DNA の特定の箇所（「複製起点」として知られる）で複製前複合体に組み立てられる。^{[ 11 ] [ 10 ]}大腸菌では、主要な開始タンパク質はDna Aであり、酵母では、これは複製起点認識複合体である。^{[ 28 ]} 開始タンパク質が使用する配列は、「AT リッチ」（アデニンとチミン塩基に富む）である傾向がある。これは、AT 塩基対が (CG 対で形成される 3 個ではなく) 2 つの水素結合を持ち、鎖分離が容易であるためである。^{[ 29 ]} 真核生物では、複製起点認識複合体 (ORC) が開始タンパク質の複製前複合体への組み立てを触媒する。さらに、最近の報告では、出芽酵母の ORC が細胞周期依存的に二量体化してライセンスを制御することが示唆されている。^{[ 30 ] [ 31 ]}今度は、ORC 二量体化のプロセスは、生体内で細胞周期依存的な Noc3p 二量体化サイクルによって媒介され、この Noc3p の役割は、リボソーム生合成におけるその役割とは分離可能である。必須の Noc3p 二量体化サイクルは、複製ライセンスにおける ORC 二重六量体形成を媒介し、Noc3p は細胞周期全体を通してクロマチンに継続的に結合している。^{[ 32 ]}その後、 Cdc6とCdt1 は、複製起点に結合した複製起点認識複合体と結合し、Mcm 複合体をDNA にロードするために必要なより大きな複合体を形成する。真核生物では、Mcm 複合体は、複製フォークと複製起点で DNA らせんを分割するヘリカーゼである。Mcm 複合体は、G1 期後期にリクルートされ、ORC-Cdc6-Cdt1 複合体によって ATP 依存的なタンパク質リモデリングを介して DNA にロードされる。 MCM複合体が複製起点DNAにロードされることで、複製前複合体の形成が完了したことを示す。^{[ 33 ]}

G1期後期に環境条件が適切であれば、G1およびG1/Sサイクリン-Cdk複合体が活性化され、DNA合成機構の構成要素をコードする遺伝子の発現が促進される。G1/S-Cdkの活性化は、S-Cdk複合体の発現と活性化も促進し、種や細胞の種類によっては複製起点の活性化に役割を果たす可能性がある。これらのCdkの制御は、細胞の種類や発生段階によって異なる。この制御は出芽酵母で最もよく理解されており、SサイクリンClb5とClb6が主にDNA複製に関与している。^{[ 34 ]} Clb5,6-Cdk1複合体は複製起点の活性化を直接引き起こすため、S期を通して各起点を直接活性化するために必要である。^{[ 33 ]}

同様に、Cdc7もS期を通じて複製起点活性化に必要である。Cdc7は細胞周期全体を通して活性ではなく、DNA複製の時期尚早な開始を避けるためにその活性化は厳密にタイミングが調整されている。G1期後期には、Cdc7活性は調節サブユニットDBF4との結合の結果として急激に上昇する。DBF4はCdc7に直接結合し、そのタンパク質キナーゼ活性を促進する。Cdc7は複製起点活性の律速調節因子であることがわかっている。G1/S-Cdkおよび/またはS-CdkとCdc7が協調して複製起点を直接活性化し、DNA合成の開始につながる。^{[ 33 ]}

S期初期には、S-CdkとCdc7の活性化により、複製開始点に形成される巨大なタンパク質複合体である前開始複合体が組み立てられる。前開始複合体の形成により、複製開始点複合体からCdc6とCdt1が排除され、前複製複合体が不活性化され、解体される。前開始複合体が複製開始点にロードされると、Mcmヘリカーゼが活性化され、DNA二重らせんの巻き戻しが起こる。前開始複合体はまた、α-プライマーゼや他のDNAポリメラーゼをDNAにロードする。^{[ 33 ]}

α-プライマーゼが最初のプライマーを合成した後、プライマー-テンプレート接合部がクランプローダーと相互作用し、スライディングクランプをDNAにロードしてDNA合成を開始する。プレ開始複合体の構成要素は、複製フォークが起点から移動する際に、複製フォークに結合したままとなる。^{[ 33 ]}

DNAポリメラーゼは5′–3′活性を持つ。既知のすべてのDNA複製システムは、合成を開始する前に3′末端に遊離ヒドロキシル基を必要とする（注：DNAテンプレートは3′から5′の方向に読み取られるが、新しい鎖は5′から3′の方向に合成される。これはしばしば混同される）。DNA合成には4つの異なるメカニズムが認識されている。

1. すべての細胞性生命体、および多くのDNAウイルス、ファージ、プラスミドは、プライマーゼを使用して、遊離の3'OH基を持つ短いRNAプライマーを合成し、その後、DNAポリメラーゼによって伸長される。
2. レトロエレメント（レトロウイルスを含む）は、逆転写酵素による伸長に利用される遊離の3'OH基を提供することでDNA複製をプライミングするトランスファーRNAを利用する。
3. アデノウイルスやφ29ファミリーのバクテリオファージでは、3'OH基はゲノムに付着したタンパク質（末端タンパク質）のアミノ酸の側鎖によって提供され、そこにDNAポリメラーゼによってヌクレオチドが付加されて新しい鎖が形成される。
4. 一本鎖DNAウイルス（サーコウイルス、ジェミニウイルス、パルボウイルスなどを含むグループ）や、ローリングサークル複製（RCR）機構を利用する多くのファージやプラスミドでは、RCRエンドヌクレアーゼがゲノム鎖（一本鎖ウイルス）またはDNA鎖（プラスミド）のいずれかにニック（切断）を作成します。ニックが入った鎖の5'末端はヌクレアーゼ上のチロシン残基に転移され、遊離した3'OH基がDNAポリメラーゼによって新しい鎖の合成に利用されます。

細胞生物は、これらの経路のうち最初の経路を利用しており、これが最もよく知られています。このメカニズムでは、2本の鎖が分離されると、プライマーゼが鋳型鎖にRNAプライマーを付加します。リーディング鎖には1つのRNAプライマーが、ラギング鎖には複数のRNAプライマーが付加されます。リーディング鎖は、高いプロセス性を持つDNAポリメラーゼによってプライマーから連続的に伸長されますが、ラギング鎖は各プライマーから不連続的に伸長され、岡崎フラグメントが形成されます。RNaseがプライマーRNAフラグメントを除去し、複製ポリメラーゼとは異なる、プロセス性の低いDNAポリメラーゼがギャップを埋めるために入ります。これが完了すると、リーディング鎖には1つのニック、ラギング鎖には複数のニックが見られます。リガーゼがこれらのニックを埋めることで、新たに複製されたDNA分子が完成します。

このプロセスで使用されるプライマーゼは、細菌と古細菌/真核生物の間で大きく異なります。細菌は、TOPRIM フォールドタイプの触媒ドメインを含むDnaGタンパク質スーパーファミリーに属するプライマーゼを使用します。 ^{[ 35 ]} TOPRIM フォールドは、ロスマン型トポロジーの 4 つの保存されたストランドを持つ α/β コアを含みます。この構造は、トポイソメラーゼIa、トポイソメラーゼ II、OLD ファミリーヌクレアーゼ、および RecR タンパク質に関連する DNA 修復タンパク質の触媒ドメインにも見られます。

一方、古細菌や真核生物が使用するプライマーゼは、RNA認識モチーフ（RRM）の高度に派生したバージョンを含んでいます。このプライマーゼは、DNA複製と修復に関与する多くのウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、環状ヌクレオチド生成シクラーゼ、およびA/B/YファミリーのDNAポリメラーゼと構造的に類似しています。真核生物の複製では、プライマーゼはPol αと複合体を形成します。^{[ 36 ]}

DNA複製プロセスでは、複数のDNAポリメラーゼがそれぞれ異なる役割を担っています。大腸菌では、DNAポリメラーゼIIIがDNA複製を主に担うポリメラーゼ酵素です。DNAポリメラーゼIIIは複製フォークで複製複合体を形成し、複製サイクル全体を通して非常に高いプロセス性を示し、その複合体はそのまま維持されます。一方、DNAポリメラーゼIはRNAプライマーをDNAに置き換える役割を担う酵素です。DNAポリメラーゼIはポリメラーゼ活性に加えて5'から3'方向へのエキソヌクレアーゼ活性を持ち、そのエキソヌクレアーゼ活性を利用して、後方のDNA鎖を伸長しながら前方のRNAプライマーを分解します。このプロセスはニックトランスレーションと呼ばれます。DNAポリメラーゼIは、DNA複製における主な機能が少数の非常に長い領域ではなく多数の短いDNA領域を作成することであるため、DNAポリメラーゼIIIよりもプロセス性がはるかに低いのです。

真核生物では、低プロセス性酵素であるPol αがプライマーゼと複合体を形成するため、複製開始に役立ちます。^{[ 37 ]} 真核生物では、リーディング鎖合成はPol εによって行われると考えられていますが、この見解は最近異議を唱えられ、Pol δの役割が示唆されています。^{[ 38 ]} プライマー除去はPol δによって完了し^{[ 39 ]}、複製中のDNA修復はPol εによって完了します。

DNA合成が続くと、元のDNA鎖はバブルの両側でほどけ続け、2本の突起を持つ複製フォークを形成します。環状染色体上に単一の複製起点を持つ細菌では、このプロセスによって「シータ構造」（ギリシャ文字のシータ：θに似ている）が形成されます。対照的に、真核生物はより長い線状染色体を持ち、その内部の複数の複製起点で複製を開始します。^{[ 40 ]}

複製フォークは、DNA複製中に長いらせん状DNA内に形成される構造です。これは、DNA鎖をらせん状に結合させている水素結合を切断するヘリカーゼと呼ばれる酵素によって生成されます。結果として生じる構造には、それぞれ1本のDNA鎖からなる2つの分岐した「突起」があります。これらの2本の鎖は、DNAポリメラーゼが相補的なヌクレオチドを鋳型に合わせることで作られるリーディング鎖とラギング鎖の鋳型として機能します。これらの鋳型は、リーディング鎖鋳型とラギング鎖鋳型と適切に呼ばれます。^{[ 41 ]}

DNAはDNAポリメラーゼによって3'から5'の方向に読み取られるため、新しい鎖は5'から3'の方向に合成されます。複製フォークではリーディング鎖とラギング鎖の鋳型が反対方向に配置されているため、大きな課題は、成長中の複製フォークの方向とは逆方向に合成される新しいラギング鎖DNAをどのように合成するかということです。

複製フォークにおけるダイナミクス

いずれの場合も、ヘリカーゼは複製されるDNAの一方の鎖のみに巻き付く6つのポリペプチドから構成されています。2つのポリメラーゼはヘリカーゼ六量体に結合しています。真核生物ではヘリカーゼはリーディング鎖に巻き付き、原核生物ではラギング鎖に巻き付きます。^{[ 44 ]}

ヘリカーゼが複製フォークでDNAをほどくと、前方のDNAが回転を強いられます。このプロセスにより、前方のDNAにねじれが蓄積されます。^{[ 45 ]}この蓄積により、最終的に複製フォークを停止させるねじれ荷重が発生します。トポイソメラーゼは、DNAの2本の鎖をほどくことによって生じる張力を緩和するために、DNAの鎖を一時的に切断する酵素です。トポイソメラーゼ（DNAジャイレースを含む）は、DNAのらせんに負の超らせんを追加することによってこれを実現します。^{[ 46 ]}

裸の一本鎖DNAは、二次構造を形成するために折り畳まれる傾向があり、これらの構造はDNAポリメラーゼの移動を妨げる可能性があります。これを防ぐために、一本鎖結合タンパク質は、 2本目の鎖が合成されるまでDNAに結合し、二次構造の形成を防ぎます。^{[ 47 ]}

二本鎖DNAは遺伝子発現の調節に重要な役割を果たすヒストンに巻き付いているため、複製されたDNAは元のDNAと同じ場所でヒストンに巻き付いていなければなりません。 ^{[ 48 ]}これを確実にするために、ヒストンシャペロンは複製前にクロマチンを分解し、ヒストンを正しい場所に置き換えます。この再構築のいくつかのステップは、やや推測の域を出ません。^{[ 49 ]}

クランプタンパク質はDNA上でスライド式クランプとして機能し、DNAポリメラーゼが鋳型に結合してプロセス性を促進する。クランプの内側面はDNAが通過できるようになっている。ポリメラーゼが鋳型の末端に到達するか、二本鎖DNAを検出すると、スライド式クランプは構造変化を起こしてDNAポリメラーゼを放出する。クランプローディングタンパク質は、鋳型とRNAプライマーの接合部を認識して、クランプに最初にタンパク質をロードするために使用される。^{[ 9 ] :274-5}

複製フォークでは、多くの複製酵素がDNA上に集合して、レプリソームと呼ばれる複雑な分子機械を形成します。以下は、レプリソームに関与する主要なDNA複製酵素のリストです。^{[ 50 ]}

試験管内単一分子実験（光ピンセットおよび磁気ピンセットを使用）により、レプリソーム酵素（ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、および一本鎖DNA結合タンパク質）とDNA複製フォークとの間の相乗的相互作用が、 DNAの巻き戻しとDNA複製を促進することが明らかになった。 ^{[ 13 ]}これらの結果から、相乗的相互作用とその安定性を説明する速度論モデルが開発された。 ^{[ 13 ]}

レプリソーム、すなわちDNA複製システムは、 DNA複製に関与する因子から構成され、鋳型となる一本鎖DNAと結合する。レプリソームには、DNAポリメラーゼ、DNAヘリカーゼ、DNAクランプ、DNAトポイソメラーゼ、および複製タンパク質（例えば、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB））が含まれる。DNA複製中、これらの構成要素は協調して活動する。ほとんどの細菌では、DNA複製に関与するすべての因子が、DNA複製中の複製フォークに局在する。真核細胞および一部の細菌細胞では、レプリソームは形成されない。

1980年、ブルース・アルバートは、DNA合成のリーディング鎖とラギング鎖の協調を視覚化するために、DNA複製の「トロンボーンモデル」を提唱した。^{[ 52 ]}このモデルでは、複製機構はクラスター化しており、リーディング鎖の合成が流れ、ラギング鎖はトロンボーンのスライドのように出入りする。ピーター・マイスターらは、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きDNAポリメラーゼαをモニタリングすることで、出芽酵母の複製部位を直接観察した。彼らは、複製起点から対称的に離れたタグ付き遺伝子座のペアのDNA複製を検出し、ペア間の距離が時間とともに著しく減少することを発見した。^{[ 53 ]}この発見は、DNA複製のメカニズムが、複製起点に搭載されたレプリソームのクラスターが両方向に進行するトロンボーンモデルと一致することを示唆している。マイスターの発見は、トロンボーンモデルの最初の直接的な証拠である。その後の研究により、多くの真核細胞ではDNAヘリカーゼが二量体を形成し、細菌のレプリソームはDNA合成中は核内の単一の場所に留まることが明らかになった。^{[ 54 ]}

複製工場は姉妹染色分体をほどく。このほどくは、DNA複製後に染色分体を娘細胞に分配するために不可欠である。DNA複製後の姉妹染色分体はコヒーシン環で互いに結合しているため、DNA複製中にのみほどく可能性がある。複製機構を複製工場として固定することで、DNA複製の成功率を向上させることができる。複製フォークが染色体内を自由に移動すると、核の連結が悪化し、有糸分裂分離が阻害される。^{[ 53 ] [ 55 ]}

真核生物は染色体の複数の箇所でDNA複製を開始するため、複製フォークは染色体の多くの箇所で出会い、そこで終結します。真核生物の染色体は線状であるため、DNA複製は染色体の末端まで到達できません。この問題により、DNAは複製サイクルごとに染色体の末端から失われます。 テロメアは末端付近にある反復DNA領域であり、この短縮による遺伝子の喪失を防ぐのに役立ちます。テロメアの短縮は体細胞における正常なプロセスです。これにより、娘DNA染色体のテロメアが短くなります。その結果、細胞はDNAの喪失によってそれ以上の分裂ができなくなるまで、一定回数しか分裂できません（これはヘイフリック限界として知られています）。次世代にDNAを伝える生殖細胞系列では、テロメラーゼがテロメア領域の反復配列を伸長して分解を防ぎます。テロメラーゼは体細胞で誤って活性化することがあり、がん形成につながることがあります。テロメラーゼ活性の増加は、癌の特徴の一つである。^{[ 56 ]}

終結には、DNA複製フォークの進行が停止または阻害されることが必要である。特定の遺伝子座での終結が起こる場合、それは2つの要素間の相互作用を伴う。(1) DNA中の終結部位配列、および(2) この配列に結合してDNA複製を物理的に停止させるタンパク質。様々な細菌種では、これはDNA複製終結部位結合タンパク質、またはTerタンパク質と呼ばれている。^{[ 57 ]}

細菌は環状染色体を持つため、複製は2つの複製フォークが親染色体の反対側で出会ったときに終結します。大腸菌はこのプロセスを、 Tusタンパク質が結合すると複製フォークの一方向のみが通過できるようにする終結配列を使用して制御します。その結果、複製フォークは常に染色体の終結領域内で出会うように制限されます。^{[ 58 ]}

真核生物では、DNA複製は細胞周期の枠組みの中で制御されています。細胞が成長し分裂するにつれて、細胞周期の各段階を進みます。DNA複製はS期（合成期）に行われます。真核細胞の細胞周期の進行は、細胞周期チェックポイントによって制御されます。チェックポイントの進行は、サイクリンやサイクリン依存性キナーゼなどの様々なタンパク質間の複雑な相互作用によって制御されます。^{[ 59 ]}細菌とは異なり、真核生物のDNAは核内で複製されます。^{[ 60 ]}

G1/Sチェックポイント（制限チェックポイント）は、真核細胞がDNA複製とその後の分裂のプロセスに入るかどうかを制御する。このチェックポイントを通過しない細胞はG0期にとどまり、DNAを複製しない。^{[ 61 ]}

DNAが「G1/S」テストを通過すると、細胞周期ごとに1回しか複製できなくなります。Mcm複合体が複製起点から離れると、複製前複合体は解体されます。複製前サブユニットが再活性化されるまで新しいMcm複合体を複製起点にロードできないため、1つの複製起点を同じ細胞周期で2回使用することはできません。^{[ 33 ]}

S期初期におけるS-Cdkの活性化は、個々の複製前複合体構成要素の破壊または阻害を促進し、即時の再構築を阻止する。SおよびM-Cdkは、S期が完了した後も複製前複合体の組み立てを阻害し続け、後期分裂期にすべてのCdk活性が低下するまで組み立てが再び起こらないようにする。^{[ 33 ]}

出芽酵母では、複製前複合体の構成要素の Cdk 依存性リン酸化によってアセンブリが阻害される。S 期の開始時に、Cdk1による Cdc6 のリン酸化により、Cdc6 がSCFユビキチンタンパク質リガーゼに結合し、Cdc6 のタンパク質分解が起こる。Mcm タンパク質の Cdk 依存性リン酸化は、S 期に Cdt1 とともに核外への Mcm タンパク質の輸送を促進し、単一の細胞周期中に複製起点への新しい Mcm 複合体のロードを阻止する。複製起点複合体の Cdk リン酸化は、複製前複合体のアセンブリも阻害する。これら 3 つのメカニズムのいずれかが単独で存在すれば、複製前複合体のアセンブリを阻害するのに十分である。しかし、同じ細胞で 3 つのタンパク質すべてに変異が生じると、1 つの細胞周期内に多くの複製起点で再開始が引き起こされる。^{[ 33 ] [ 62 ]}

動物細胞では、タンパク質ジェミニンは複製前複合体形成の重要な阻害因子である。ジェミニンはCdt1に結合し、複製起点認識複合体への結合を阻害する。G1期では、ジェミニンのレベルはAPCによって低く保たれ、APCはジェミニンをユビキチン化して分解の標的とする。ジェミニンが分解されると、Cdt1が放出され、複製前複合体形成において機能できるようになる。G1期の終わりにAPCが不活性化されると、ジェミニンが蓄積してCdt1に結合するようになる。^{[ 33 ]}

葉緑体ゲノムとミトコンドリアゲノムの複製は、 Dループ複製のプロセスを通じて細胞周期とは独立して起こる。^{[ 63 ]}

ほとんどの細菌は明確な細胞周期を経ず、代わりにDNAを継続的に複製します。急速な増殖中は、これにより複数の複製ラウンドが同時に発生する可能性があります。^{[ 66 ]}最もよく特徴づけられている細菌である大腸菌 では、DNA複製は、複製開始配列のヘミメチル化と隔離、アデノシン三リン酸（ATP）とアデノシン二リン酸（ADP）の比率、およびDnaAタンパク質のレベルなど、いくつかのメカニズムによって制御されています。これらすべてが、開始タンパク質の複製開始配列への結合を制御します。^{[ 67 ]}

大腸菌はGATC DNA配列をメチル化するため、DNA合成の結果、ヘミメチル化配列が生成されます。このヘミメチル化DNAは、複製開始配列に結合して隔離するタンパク質SeqAによって認識されます。さらに、複製開始に必要なDnaAは、ヘミメチル化DNAにはあまり結合しません。その結果、新たに複製された複製開始部位は、すぐに次のDNA複製ラウンドを開始することが阻止されます。^{[ 68 ]}

細胞が栄養豊富な培地にいるとATPが蓄積し、細胞が特定のサイズに達するとDNA複製が開始されます。ATPはADPと競合してDnaAに結合し、DnaA-ATP複合体が複製を開始できます。DNA複製には一定数のDnaAタンパク質も必要です。複製開始点がコピーされるたびに、DnaAの結合部位の数が倍増し、複製を再度開始するためにはより多くのDnaAの合成が必要になります。^{[ 69 ]}

大腸菌などの急速に増殖する細菌では、染色体複製は細胞分裂よりも時間がかかります。細菌は、前の複製が終了する前に新しい複製を開始することでこの問題を解決します。^{[ 70 ]}新しい複製によって、分裂した細胞の2世代後に生まれる細胞の染色体が形成されます。このメカニズムにより、重複した複製サイクルが生まれます。