コスミッド

コスミドは、ラムダファージのcos配列を含むハイブリッドプラスミドの一種です。^{[ 1 ]}遺伝子工学ではクローニングベクターとしてよく使用され、ゲノムライブラリーの構築に利用できます。コスミドは1978年にコリンズとホーンによって初めて記述されました。^{[ 2 ]}コスミドは、通常のバクテリオファージのパッケージングサイズに基づいて、 37～52 kb （通常は45 kb）のDNAを含むことができます。適切な複製起点（ori）があれば、プラスミドとして複製できます。例えば、哺乳類細胞ではSV40 ori、二本鎖DNA複製ではColE1 ori、原核生物では一本鎖DNA複製ではf1 oriなどです。また、抗生物質耐性などの選択遺伝子が含まれていることが多く、形質転換された細胞は抗生物質を含む培地にプレーティングすることで識別できます。コスミドを取り込まなかった細胞は増殖できません。^{[ 3 ]}

プラスミドとは異なり、これらは試験管内でファージキャプシドにパッケージ化することもできます。このステップでは、ラムダファージをベクターとしてクローニングする際にも使用されるcosサイトとしても知られる粘着末端が必要ですが、 cos配列を除いて、ラムダ遺伝子のほぼすべてが削除されています。キャプシド内のハイブリッドコスミドDNAは、形質導入によって細菌細胞に導入できます。試験管内でのパッケージングにはcosサイト間に少なくとも38kbのDNAが必要であるため、挿入DNAのないベクターはパッケージ化されません（新規挿入DNAに多くの直接反復または回文（逆反復）DNAが含まれている場合、プラスミドの不安定性が増加します。この不安定性は、DNA組換えに影響を与える特定の変異を持つ宿主細菌を使用することで大部分が打ち消すことができます（注：逆反復の欠如は、上記の最初のHohn & Collinsの出版物で指摘されています。また、^{[ 4 ]}も参照してください）。

Cos配列は約200塩基対の長さで、パッケージングに不可欠です。cos配列にはcosN部位があり、そこでターミナーゼによって各鎖のDNAが12 bp間隔で切断されます。これにより、環状コスミドが12 bpの2つの「粘着末端」または「粘着末端」を持つ線状化されます。（DNAはファージヘッドに収まるように線状でなければなりません。）cosB部位は、ターミナーゼが切断して鎖を分離している間、ターミナーゼを保持します。次のコスミドのcosQ部位（ローリングサークル複製ではしばしば線状の連結体が生じるため）は、前のコスミドがパッケージングされた後、細胞内DNaseによる分解を防ぐためにターミナーゼによって保持されます。

コスミドは主に細菌のoriV、抗生物質選択マーカー、クローニングサイトを持つプラスミドですが、バクテリオファージラムダ由来のcosサイトを1つ、最近では2つ持っています。実験の目的に応じて、宿主範囲の広いコスミド、シャトルコスミド、または「哺乳類」コスミド（SV40 oriVと哺乳類選択マーカーに連結）が利用可能です。コスミドのロード容量はベクター自体のサイズによって異なりますが、通常は40～45 kb程度です。クローニング手順では、2つのベクターアームを生成し、それを外来DNAに結合します。野生型コスミドDNAに対する選択は、サイズ排除によって簡単に行われます。そのため、コスミドは常にコロニーを形成し、プラークは形成しません。また、クローン密度ははるかに低く、連結したDNA 1 μgあたり約10 ⁵～10 ⁶ CFUです。

組換えラムダまたはコスミドライブラリーの構築後、全DNAは、in vitroパッケージングと呼ばれる技術によって適切な大腸菌宿主に導入されます。必要なパッケージング抽出物は、大腸菌cI857溶原菌（それぞれred-gam-SamおよびDam（ヘッドアセンブリ）とEam（テールアセンブリ））から得られます。これらの抽出物は、 in vitroで組換え分子を認識してパッケージングし、成熟ファージ粒子（ラムダベースのベクター）またはファージシェルに含まれる組換えプラスミド（コスミド）を生成します。これらの違いは、ラムダ置換ベクターに有利な感染頻度の違いに反映されます。これは、ロード容量がわずかに低いことを補います。ファージライブラリーは、コスミドライブラリーよりも容易に保存およびスクリーニングできます。

標的DNA：クローン化されるゲノムDNAは、適切なサイズの制限酵素断片に切断する必要があります。これは通常、部分的な制限酵素処理の後、サイズ分画または脱リン酸化（仔牛腸由来ホスファターゼを使用）を行うことで、染色体の混同、すなわち物理的に連結されていない断片の連結を回避します。

一般的に使用されるベクトルには「SuperCos 1」などがあります。