核酸の熱力学

ハイブリダイゼーションとは、 2本以上の相補的な核酸鎖が非共有結合的に配列特異的な相互作用を起こして単一の複合体を形成するプロセスであり、2本の鎖の場合は二重鎖と呼ばれる。オリゴヌクレオチド、DNA、またはRNAは通常の条件下で相補鎖と結合するため、完全に相補的な2本の鎖は容易に互いに結合する。多様性を減らし、最もエネルギー的に好ましい複合体を得るために、実験室ではアニーリングと呼ばれる技術が用いられる。しかし、ヌクレオチドの分子構造が異なるため、2本の鎖に1つでも不一致があると、それらの結合はエネルギー的に不利になる。2本の鎖がアニーリングする温度を定量化することで塩基不適合性の影響を測定すると、アニーリングされる2本の鎖の塩基配列の類似性に関する情報が得られる。複合体は、熱変性（融解とも呼ばれる）によって解離する。外部からの負の要因がない場合、ハイブリダイゼーションと融解のプロセスは無限に繰り返される可能性があり、これがポリメラーゼ連鎖反応の基礎となる。最も一般的には、核酸塩基のペアであるA=TとG≡Cが形成されるが、後者の方がより安定である。

DNA変性（ DNA融解とも呼ばれる）は、二本鎖デオキシリボ核酸がほどけて一本鎖に分離する過程であり、塩基間の疎水性スタッキング引力が破壊されることで起こる。疎水性効果を参照。どちらの用語も、混合物を加熱したときに起こる過程を指すのに使われるが、「変性」はホルムアミドや尿素などの化学物質によって誘発されるDNA鎖の分離を指す場合もある。^{[ 1 ]}

DNA変性のプロセスは、DNAのいくつかの側面を分析するために使用できます。シトシン/グアニンの塩基対形成は一般的にアデニン/チミンの塩基対形成よりも強いため、ゲノム中のシトシンとグアニンの量はGC含有量と呼ばれ、ゲノムDNAが融解する温度を測定することによって推定できます。^{[ 2 ]}温度が高いほどGC含有量が高くなります。

DNA変性は、2つの異なるDNA配列間の配列の違いを検出するためにも使用できます。DNAを加熱して一本鎖状態に変性させ、混合物を冷却して鎖が再ハイブリダイズできるようにします。類似した配列間でハイブリッド分子が形成され、これらの配列間の違いは塩基対の破壊につながります。ゲノム規模では、この方法は、 2つの種間の遺伝的距離を推定するために研究者によって使用されており、 DNA-DNAハイブリダイゼーションとして知られるプロセスです。^{[ 3 ]}単一の単離されたDNA領域のコンテキストでは、変性勾配ゲルと温度勾配ゲルを使用して、2つの配列間の小さなミスマッチの存在を検出できます。このプロセスは、温度勾配ゲル電気泳動として知られています。^{[ 4 ] [ 5 ]}

融解温度に基づくDNA解析法は、根本的な配列を調べるための代用手段に過ぎないという欠点がある。一般的に、 DNAシーケンシングの方がより正確な方法と考えられている。

DNA融解のプロセスは、分子生物学的手法、特にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にも利用されています。DNA融解温度は、この手法において診断的な要素ではありませんが、Tmを推定する方法は、プロトコル_で使用する適切な温度を決定する上で重要です。DNA融解温度は、 DNAマイクロアレイのオリゴヌクレオチドプローブなど、一連の分子のハイブリダイゼーション強度を均一化するための指標としても使用できます。

遺伝学におけるアニーリングとは、一本鎖DNAまたはRNAの相補的な配列が水素結合によって対合し、二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを意味します。アニーリングが起こる前に、適切な水素結合が起こるように、一方の鎖がキナーゼなどの酵素によってリン酸化される必要がある場合があります。アニーリングという用語は、 DNAプローブの結合、またはポリメラーゼ連鎖反応中のプライマーのDNA鎖への結合を説明するためによく使用されます。この用語は、熱によって分離された（熱変性した）逆相補鎖の再形成（再自然化）を説明するためにもよく使用されます。RAD52などのタンパク質は、 DNAアニーリングを助けることができます。DNA鎖アニーリングは、相同組換えの経路における重要なステップです。特に、減数分裂中、合成依存性鎖アニーリングは相同組換えの主要な経路です。

スタッキングとは、隣接するベースの平面間の安定化相互作用のことである。スタッキングは、ベースのどの面でも起こり得る。つまり、5'-5'、3'-3'、またはその逆である。^{[ 7 ]}

「自由」核酸分子におけるスタッキングは主に分子間力、特に芳香環間の静電引力によってもたらされ、このプロセスはπスタッキングとしても知られています。溶媒として水を使用する生物系では、疎水性効果が寄与し、らせん構造の形成を助けます。^{[ 8 ]}スタッキングはDNA二重らせんにおける主要な安定化因子です。^{[ 9 ]}

分子の自由エネルギーに対するスタッキングの寄与は、ニックの入ったDNAの曲がったスタッキング平衡を観察することで実験的に推定できる。このような安定化は配列に依存する。^{[ 6 ]}安定化の程度は塩濃度と温度によって変化する。^{[ 9 ]}

DNA ヘリックスを塩基対間の相互作用の列として扱うことは、塩基スタッキングによる大きな寄与のため不十分であることがわかっています。スタッキング相互作用は主に隣接する塩基に影響を与えるため、核酸の二次構造 (ヘリックスなど) を「隣接する」塩基対間の相互作用の列として扱う「最近接」モデルを使用できます。^{[ 13 ]} 2 塩基の最近接モデルは、DNA ヘリックスに対してかなりうまく機能します。たとえば、下に示す DNA には、矢印で示される最近接相互作用があります。

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5' C-G-T-T-G-A 3'

3' G-C-A-A-C-T 5'

個々の鎖からこのDNAを形成する自由エネルギーΔG ° は、（37 ℃で）次のように表される。

Δ G ° ₃₇ (予測) = Δ G ° ₃₇ (C/G 開始) + Δ G ° ₃₇ (CG/GC) + Δ G ° ₃₇ (GT/CA) + : Δ G ° ₃₇ (TT/AA) + Δ G ° ₃₇ (TG/AC) + Δ G ° ₃₇ (GA/CT) + Δ G ° ₃₇ (A/T)開始)

C/G開始項を除いて、第1項は、最近接塩基対がない場合の最初の塩基対CGの自由エネルギーを表します。第2項には、2番目の塩基対GCの形成自由エネルギーと、この塩基対と前の塩基対との間のスタッキング相互作用の両方が含まれます。残りの項も同様に定義されます。一般に、核酸二重らせんの形成自由エネルギーは次のようになります。

$${\displaystyle \Delta G_{37}^{\circ }(\mathrm {total} )=\Delta G_{37}^{\circ }(\mathrm {initiations} )+\sum _{i=1}^{10}n_{i}\Delta G_{37}^{\circ }(i),}$$

どこ$\displaystyle \Delta G_{37}^{\circ }(i)$これは、10個の可能な最近傍ヌクレオチド対のうちの1つに関連する自由エネルギーを表し、${\displaystyle n_{i}}$これは、シーケンス内でのその要素の出現回数を表します。

各 Δ G ° 項にはエンタルピー Δ H ° とエントロピー Δ S ° のパラメータがあるため、自由エネルギーの変化は次のように表されます。

$${\displaystyle \Delta G^{\circ }(\mathrm {total} )=\Delta H_{\mathrm {total} }^{\circ }-T\Delta S_{\mathrm {total} }^{\circ }.}$$

10通りの相互作用の組み合わせについて、 ΔH °とΔS °の値が決定されました。これらの値は、37℃で計算されたΔG°の値とともに表1に示されています。これらの値を用いて、上記のDNA二重_らせんのΔG37  °の値は-22.4 kJ/molと計算されます。実験値は-21.8 kJ/molです。

表1に示す10個の隣接グループに関連するパラメータは、短いオリゴヌクレオチド二重鎖の融解点から決定されます。その結果、10個のグループのうち独立しているのは8個だけであることがわかりました。

最近傍モデルは、ワトソン・クリック塩基対を超えて、ミスマッチと隣接する塩基対間の相互作用のパラメータを含めるように拡張できます。^{[ 14 ]}これにより、例えば（矢印はミスマッチを示しています）のような孤立したミスマッチを含む配列の熱力学的パラメータを推定できます。

      ↓↓↓

5' G-G-A-C-T-G-A-C-G 3'

3' C-C-T-G-G-C-T-G-C 5'

これらのパラメータは融解実験から得られたものであり、不一致を含む表1の拡張版は文献で確認できる。

一般的に、最近傍法による予測は実験結果とかなりよく一致しているが、さらなる考察を必要とする予期せぬ外れ値配列もいくつか存在する。^{[ 15 ]}最後に、DNAハイブリダイゼーションの熱力学と最近傍モデルの妥当性に関する豊富な新しい洞察を提供する単一分子解離アッセイによって提供される精度の向上についても言及しておくべきである。^{[ 16 ]}

核酸の挙動をより現実的にモデル化する方法としては、ヌクレオチドの両側の隣接グループに依存するパラメーターを設定し、「TCG/AGC」のようなエントリを持つ表を作成することが考えられます。しかし、これにはワトソン・クリック塩基対形成の場合約32グループ、ミスマッチを含む配列の場合はさらに多くのグループが必要となり、これほど多くのグループについて信頼できるデータを得るために必要なDNA融解実験の数は不便なほど多くなります。しかし、核酸の熱力学的パラメーターにアクセスする他の手段も存在します。マイクロアレイ技術では、数万の配列のハイブリダイゼーションを並行してモニタリングできます。このデータは、分子吸着理論と組み合わせることで、1回の実験で多くの熱力学的パラメーターを決定し^{[ 17 ]}、最近接モデルを超えることができます^{[ 15 ] 。}

拡張モデルは、RNA二次構造予測において非常に一般的に使用されています。この分野では、「最近傍」モデルは、2塩基だけでなく、複数の塩基からなる文字列を含むことができます。以前のバージョンと同様に、自由エネルギーは37  ℃で提供され、他の温度での自由エネルギーを計算するためにエンタルピー値が提供される場合があります。これらのモデルには、次のようなフラグメントの熱力学的パラメータを含めることができます。

• らせん領域は、一般的に2塩基のスケールで、例えばAU:UA（5'-3':3'-5'表記は以前と同様）のように表されます。
• GUペアは、ヘリックス領域と同様にスコアリングされますが、GGUC:CUGGのように、より長い断片が使用される場合があります。
• スタッキングエネルギーに寄与する可能性のある、ぶら下がった（一本鎖）末端。一般的には2つの断片として記述される。
• 末端ミスマッチとは、らせん構造がミックスマッチで終わる状態を指します。例：CA:GA。
• ヘアピン、バルジ、内部ループ、マルチブランチ、外部ループなど、長さ、末端のミスマッチの性質（ヘアピンのみ）、ループの基本構成（これもスタッキングによる）など、すべてがその安定性に影響を与える可能性があります。
• 同軸積層は厳密には三次構造の範疇に含まれるが、二次構造予測ツールはこれらの特徴を認識し、それに応じてスコアを算出することができる。

ViennaRNAソフトウェアには、標準塩基モデルの上に「パッチ」として使用される以下の塩基の調整データも含まれています: 7DA、hU、I、m ⁵ C、m ⁶ A、m ¹ Ψ、Ψ、および9H-プリン（ネブラリン）。^{[ 26 ]}パッチングシステムの説明はVarenykら（2023）で入手可能です。^{[ 27 ]}