インシリコPCR

インシリコPCR ^{[1]は、与えられた}プライマー（プローブ）のセットを使用して、配列決定されたゲノムまたはトランスクリプトームからDNA配列を増幅し、理論的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の結果を計算するために使用される計算ツールを指します。^{[2] [3] [4] [5]}

これらのツールは、標的 DNA またはcDNA配列のプライマー設計を最適化するために使用されます。プライマー最適化には、効率と選択性の 2 つの目標があります。効率では、GC 含有量、結合効率、相補性、二次構造、アニーリング、融点 (Tm)などの要素が考慮されます。プライマー選択性では、プライマーペアが目的のターゲット以外のランダムなサイトに偶然結合したり、プライマーペアが遺伝子ファミリーの保存領域に結合したりしないことが求められます。選択性が低いと、プライマーセットは目的のターゲット以外に複数の産物を増幅します。^[6]

適切な短いプライマーペアまたは長いプライマーペアの設計は、PCR産物予測の目的の1つにすぎません。in silico PCRツールによって提供されるその他の情報には、プライマーの位置、方向、各アンプリコンの長さの決定、電気泳動移動度のシミュレーション、オープンリーディングフレームの識別、および他のWebリソースへのリンクが含まれます。^{[7] [8] [9]}

機能セット、使いやすさ、効率、コストのバランスが異なるソフトウェアパッケージが多数あります。^{[10] [11] [12] [13] [14]} Primer-BLASTは広く使用されており、国立生物工学情報センター（NCBI）のWebサイトから無料でアクセスできます。 一方、商用アプリケーションであるFastPCR ^[10]では、単一のプライマーまたはマルチプレックスターゲット配列用に設計されたプライマーセットを同時にテストできます。 高速でギャップのないアライメントを実行して、プライマーとターゲット配列の相補性をテストします。 標準PCRまたはインバースPCRを使用する線形テンプレートと環状テンプレート、およびマルチプレックスPCRの可能性のあるPCR産物を見つけることができます。 Dicey ^[15]は、 FASTAファイルで提供されるプライマーセットからin-silico PCR産物を出力する無料のソフトウェアです。 ゲノムのFMインデックスを使用することで高速で、プライマーの融解温度、プライマーとゲノム上のヒット位置間の許容編集距離を考慮できます。 VPCR ^[3]は、マルチプレックスPCRの動的シミュレーションを実行し、1つの反応で複数のアンプリコン間の定量的な競合効果を推定することができます。UCSCゲノムブラウザはisPCRを提供しており、100以上の配列決定されたゲノムのPCR産物を表示するためのグラフィックとテキストファイル出力を提供します。

プライマーは多くの予測される配列に結合する可能性があるが、プライマーの 3' 末端にミスマッチがないか、またはミスマッチが少ない（位置とヌクレオチドに応じて 1 または 2）配列のみがポリメラーゼ伸長に使用できる。プライマーの 3' 末端の最後の 10～12 塩基は、ポリメラーゼ伸長の開始とテンプレート結合部位でのプライマーの一般的な安定性に敏感である。プライマーの 3' 末端のこれらの最後の 10 塩基の単一のミスマッチの影響は、その位置と局所構造に依存し、プライマーの結合、選択性、および PCR 効率を低下させる。^{[7] [9]}

• PCR、qPCR、in silico PCR、オリゴヌクレオチド用のウェブツール
• 分子生物学実験のin silicoシミュレーション