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核酸検査（NAT ）は、特定の核酸配列を直接検出するために使用される技術であり 、通常は血液、組織、尿などで病原体として作用するウイルスや細菌などの特定の生物種または亜種を検出および識別するために使用されます。NATは、抗原や抗体ではなく遺伝物質（RNAまたはDNA ）を検出するという点で他の検査とは異なります。遺伝物質の検出により、抗原や抗体の検出には血流中に出現し始めるまでに時間がかかるため、疾患の早期診断が可能になります。[ 1 ]特定の遺伝物質の量は通常非常に少ないため、多くのNATには遺伝物質を増幅するステップ、つまり、それを多数コピーするステップが含まれています。このようなNATは核酸増幅検査（NAAT）と呼ばれます。増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換アッセイ（SDA）、転写媒介アッセイ（TMA）[ 2 ]、ループ媒介等温増幅（LAMP）[ 3 ]など、いくつかの方法があります。
ほぼすべての核酸増幅法および検出技術は、ワトソン・クリック塩基対合の特異性を利用しています。一本鎖プローブまたはプライマー分子が、相補鎖のDNAまたはRNA標的分子を捕捉します。したがって、プローブ鎖の設計は、検出の感度と特異性を高める上で非常に重要です。しかし、様々なヒト疾患の遺伝的基盤を形成する変異体は、通常、正常な核酸とはわずかに異なります。多くの場合、挿入、欠失、一塩基多型（SNP）など、単一の塩基のみが異なるだけです。この場合、プローブと標的の結合が不完全になりやすく、共生菌株を病原菌株と誤認するなど、偽陽性の結果が生じる可能性があります。単一塩基特異性を実現するために、多くの研究が行われてきました。
核酸（DNAとRNA）の鎖は、対応する配列を持ち、ペアで鎖状に結合しています。しかし、鎖の各ノードはそれほど強く結合していないため、周囲の振動（熱雑音またはブラウン運動と呼ばれる）の影響で、二本鎖は絶えず部分的にほどけては再び結合を繰り返します。ペアリングが長いほど安定性が高まります。核酸検査では、「プローブ」と呼ばれる、短い鎖が結合した長い鎖を使用します。長いプライマー鎖は、検出対象の病原体の「ターゲット」鎖に対応する（相補的な）配列を持っています。病原体の鎖は、長いプライマー鎖の露出部分（「トウホールド」と呼ばれる）にしっかりと結合し、その後、プローブから短い「プロテクター」鎖を少しずつ押し出します。最終的に、短いプロテクター鎖は何も結合しておらず、結合していない短いプライマーが検出可能になります。このセクションの残りの部分では、このプロセスを実用的なテストへと微調整するために必要な研究の歴史について述べる。
2012年、Yinの研究グループは核酸ハイブリダイゼーションの特異性を最適化することに関する論文を発表した。[ 4 ]彼らは、あらかじめハイブリダイズした相補鎖Cと保護鎖Pからなる「トーホールド交換プローブ（PC）」を導入した。相補鎖は保護鎖よりも長く、末端に未結合の尾部、すなわちトーホールドを持つ。相補鎖は標的配列と完全に相補的である。正しい標的（X）がトーホールド交換プローブ（PC）と反応すると、Pが放出され、ハイブリダイズ生成物XCが形成される。反応の標準自由エネルギー（Δ）はゼロに近い。一方、トーホールド交換プローブ（PC）が偽の標的（S）と反応すると、反応は進行するが、標準自由エネルギーが増加して熱力学的に不利になる。標準自由エネルギーの差（ΔΔ）は収率に明らかな識別をもたらすほど大きい。識別係数 Q は、正しいターゲットのハイブリダイゼーション収率を、誤ったターゲットのハイブリダイゼーション収率で割った値として計算されます。Yin らのグループは、5 つの正しいターゲットと、エネルギー的に代表的な単一塩基変化 (置換、欠失、挿入) を持つ 55 の誤ったターゲットを用いたさまざまなトウホールド交換プローブの実験を通して、これらのプローブの識別係数は 3 ～ 100 + の範囲で、中央値は 26 であると結論付けました。プローブは 10 °C ～ 37 °C、1 mM ～ 47 mM、核酸濃度 1 nM ～ 5 M の範囲で安定して機能します。また、トウホールド交換プローブは RNA 検出でも安定して機能することも判明しました。
その後、さらなる研究が行われた。2013年、Seeligらのグループは、トーホールド交換反応を利用した蛍光分子プローブに関する論文を発表した。[ 5 ] これにより、正しいターゲットとSNPターゲットの光学的検出が可能になった。彼らはまた、大腸菌由来のサンプル中のSNPの検出にも成功した。
2015年、Davidらのグループは、「競合的構成」と呼ばれるシステムを導入することで、一塩基多型（SNV）の極めて高い選択性（1,000以上）を達成した。[ 6 ] このシステムでは、SNVと野生型（WT）の配列、プローブとシンクの設計構造、試薬濃度、アッセイ条件に基づいて変化する最適なパラメータ値を予測するために、基礎となるハイブリダイゼーションプロセスの速度論的反応モデルを構築した。彼らのモデルは、44個の癌関連DNA SNVに対して、中央値で890倍、最小値で200倍の選択性を達成し、これは従来のハイブリダイゼーションベースのアッセイよりも少なくとも30倍の改善を示している。さらに、彼らはこの技術をPCR後のヒトゲノムDNAからの低VAF配列のアッセイ、および合成RNA配列への直接適用した。
専門知識に基づいて、彼らはブロッカー置換増幅法（BDA）と呼ばれる新しいPCR法を開発しました。[ 7 ]これは温度に強いPCR法で、約20 ntのウィンドウ内のすべての配列変異を野生型配列の1000倍に選択的に増幅し、もともと対立遺伝子頻度が0.1%以下の数百の潜在的な変異を容易に検出および定量化できます。BDAは、56 ℃から64 ℃までのアニーリング温度で同様の濃縮性能を達成します。この温度に対する堅牢性により、ゲノム全体にわたる多くの異なる変異の多重濃縮が容易になり、さらに、希少なDNA変異の検出に安価で持ち運び可能なサーマルサイクリング装置の使用が可能になります。BDAは、肺がん患者の血漿から採取された臨床細胞フリーDNAサンプルを含むサンプルタイプでも検証されています。