DNAフットプリント

DNA フットプリント法は、 DNA結合タンパク質の配列特異性を in vitro で調査する方法です。この技術は、細胞内外の タンパク質と DNA の相互作用を研究するために使用できます。

転写の調節は広範囲に研究されてきましたが、まだ不明な点が多くあります。プロモーター、エンハンサー、サイレンサーに結合して転写を促進または抑制する転写因子と関連タンパク質は、ゲノム内の個々の遺伝子の独自の調節を理解する上で不可欠です。DNA フットプリント法などの技術は、どのタンパク質が DNA のこれらの関連領域に結合するかを明らかにし、転写制御の複雑さを解明するのに役立ちます。

1978年、デイビッド・J・ガラスとアルバート・シュミッツは、lacリプレッサータンパク質の結合特異性を研究するためにDNAフットプリント法を開発しました。これはもともとマクサム・ギルバート化学配列決定法を改良したものです。^[1]

この技術の最も単純な応用は、特定のタンパク質がDNA分子内の目的の領域に結合するかどうかを評価することです。^[2] ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、潜在的なタンパク質結合部位を含む目的の領域を増幅してラベル付けします。理想的には、アンプリコンの長さは50〜200塩基対です。ラベル付けされたテンプレートDNAの一部に目的のタンパク質を追加します。一部は後で比較できるように、タンパク質なしで別々に残しておきます。DNAテンプレートの両方の部分に切断剤を追加します。切断剤は、配列に依存しない方法でランダムな位置を切断する化学物質または酵素です。反応は、各DNA分子を1か所のみで切断するのに十分な長さで発生する必要があります。DNAテンプレート内の領域に特異的に結合するタンパク質は、結合しているDNAを切断剤から保護します。両方のサンプルをポリアクリルアミド ゲル電気泳動で並べて泳動します。タンパク質のないDNAテンプレートの部分はランダムな位置で切断されるため、ゲルで泳動するとラダー状の分布が生成されます。タンパク質を含む DNA テンプレートは、ラダー分布を形成し、その途中に「フットプリント」と呼ばれる切断部分があり、DNA は切断剤から保護されています。注: Maxam-Gilbert 化学DNA 配列決定法をポリアクリルアミド ゲル上のサンプルと並行して実行することで、リガンド結合部位の正確な位置を予測できます。

DNAテンプレートは、結合部位の位置に応じて、3' 末端または5' 末端で標識されます。使用できる標識は、放射能と蛍光です。放射能は、もともとマクサム・ギルバート化学配列決定法から開発された方法であるため、フットプリント分析用のDNA断片の標識に伝統的に使用されてきました。放射性標識は非常に感度が高く、少量のDNAを視覚化するのに最適です。蛍光は、放射性化学物質の使用に伴う危険性を考えると望ましい進歩です。ただし、DNAフットプリント実験で使用される標的DNA鎖の低濃度を検出するのに十分な感度が常にあるとは限らないため、最適化がより困難になっています。電気泳動配列決定ゲルまたはキャピラリー電気泳動は、蛍光タグ付き断片のフットプリントの分析に成功しています。^[2]

さまざまな切断剤を選択できます。望ましい切断剤は、配列に中立で、使いやすく、制御しやすいものです。残念ながら、これらの基準をすべて満たす切断剤は存在しないため、DNA 配列と対象のリガンドに応じて適切な切断剤を選択できます。次の切断剤について詳しく説明します。DNase I は、二本鎖エンドヌクレアーゼとして機能する大きなタンパク質です。DNA の副溝に結合し、ホスホジエステル骨格を切断します。サイズが小さいため物理的に妨げられやすいため、フットプリンティングに適した切断剤です。そのため、DNA 配列に結合したタンパク質によってその作用がブロックされる可能性が高くなります。さらに、DNase I 酵素は、EDTA を加えて反応を停止することで簡単に制御できます。ただし、DNase I の使用にはいくつかの制限があります。酵素は DNA をランダムに切断しません。酵素の活性は局所的な DNA 構造と配列の影響を受けるため、不均一なラダーになります。これにより、DNA 分子上のタンパク質結合部位の予測精度が制限される可能性があります。^{[2] [3]} ヒドロキシルラジカルはフェントン反応から生成され、Fe ^{2+ を}H ₂ O ₂で還元して遊離ヒドロキシル分子を形成します。これらのヒドロキシル分子は DNA バックボーンと反応し、切断を引き起こします。サイズが小さいため、結果として得られる DNA フットプリントは高解像度です。DNase I とは異なり、配列依存性がなく、より均一に分散したラダーになります。ヒドロキシルラジカルを使用することのマイナス面は、反応と消化時間が遅いため、使用に時間がかかることです。^[4] 紫外線照射を使用して核酸を励起し、光反応を作成すると、DNA 鎖の塩基が損傷します。^[5] 光反応には、一本鎖切断、DNA 鎖間または DNA 鎖内の相互作用、溶媒との反応、またはタンパク質との架橋が含まれます。この方法のワークフローには追加のステップがあり、保護された DNA と保護されていない DNA の両方が処理されると、切断された生成物のプライマー伸長が続きます。^{[6] [7]} 伸長は損傷した塩基に到達すると終了するため、PCR産物をゲル上で並べて流すと、保護されたサンプルにはDNAが結合したタンパク質と架橋した追加のバンドが表示されます。UVを使用する利点は、非常に迅速に反応するため、瞬間的な相互作用を捉えることができることです。さらに、生体内に適用することもできます。紫外線は細胞膜を透過するため、実験ではゲルが役に立たない。欠点は、ゲルに結合したタンパク質がDNAを保護せず、周囲の光反応を変化させるだけなので、ゲルの解釈が難しいことである。^[8]

生体内フットプリント法は、特定の時点で細胞内で起こっているタンパク質-DNA相互作用を分析するために使用される技術です。^{[9] [10]} 細胞膜が透過処理されている場合、DNase Iを切断剤として使用できます。しかし、最も一般的に使用される切断剤はUV照射です。これは、細胞の状態を乱すことなく細胞膜を透過し、細胞の変化に敏感な相互作用を捕捉できるためです。DNAがUVによって切断または損傷されると、細胞を溶解してDNAを精製し、関心領域の分析を行うことができます。ライゲーション介在PCRは、生体内フットプリント法の代替法です。ゲノムDNAに切断剤を使用して一本鎖切断を起こし、DNAを単離したら、切断点にリンカーを追加します。関心領域はリンカーと遺伝子特異的プライマーの間で増幅され、ポリアクリルアミドゲルで実行すると、タンパク質が結合した場所にフットプリントが残ります。^[11] 生体内フットプリント法と免疫沈降法を組み合わせることで、ゲノム全体の多くの場所でタンパク質の特異性を評価することができます。目的のタンパク質に結合したDNAをそのタンパク質に対する抗体で免疫沈降させ、DNAフットプリント法を使用して特定の領域の結合を評価することができます。^[12]

DNAフットプリント技術は、タンパク質のDNA領域への結合強度を評価するために改良することができます。フットプリント実験にさまざまな濃度のタンパク質を使用すると、濃度が増加するにつれてフットプリントの外観が観察され、タンパク質の結合親和性を推定することができます。^[2]

フットプリント法を最新の検出方法に適応させるため、標識された DNA 断片はポリアクリルアミドゲルで泳動されるのではなく、キャピラリー電気泳動装置で検出されます。分析対象の DNA 断片がポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって生成された場合、プライマーにカルボキシフルオレセイン (FAM) などの蛍光分子を結合させるのは簡単です。この方法では、DNaseI 消化によって生成された断片に FAM が含まれ、キャピラリー電気泳動装置で検出できます。通常、カルボキシテトラメチルローダミン (ROX) で標識されたサイズ標準も、分析対象の断片の混合物に追加されます。この方法で、転写因子の結合部位が適切に特定されています。^[13]

次世代シーケンシングにより、ゲノムワイドなアプローチでDNAフットプリントを特定することが可能になりました。DNase -Seq ^[14]やFAIRE-Seq ^[15]などのオープンクロマチンアッセイは、多くの細胞タイプに対して堅牢な制御ランドスケープを提供することが証明されています。^[16]ただし、これらのアッセイでは、ゲノムワイドなDNAフットプリントを提供するために、下流のバイオインフォマティクス分析が必要です。提案されている計算ツールは、セグメンテーションベースとサイトセントリックアプローチの2つのクラスに分類できます。

セグメンテーションベースの方法は、隠れマルコフモデルまたはスライディングウィンドウ法の応用に基づいており、ゲノムをオープン/クローズドクロマチン領域に分割します。このような方法の例には、HINT、^[17]、ボイル法^[18]、Neph法^[19]などがあります。一方、サイトセントリック法は、モチーフ予測結合部位、つまりDNA-タンパク質配列情報（位置重み行列などの構造にエンコードされている）を使用して予測された調節領域の周囲のオープンクロマチンプロファイルに基づいてフットプリントを見つけます。これらの方法の例には、CENTIPEDE ^[20]やCuellar-Partida法^{[21]などがあります。}

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