逆ポリメラーゼ連鎖反応

逆ポリメラーゼ連鎖反応(逆 PCR ) は、既知の配列が 1 つだけのDNA を増幅するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応の変種です。従来の PCR の制限の 1 つは、ターゲット DNA の両端に相補的なプライマーが必要であることですが、この方法では、プライマーを設計できる配列が 1 つしかない場合でも PCR を実行できます。

逆PCRは挿入位置の特定に特に有用である。例えば、様々なレトロウイルスやトランスポゾンはランダムにゲノムDNAに組み込まれる。^[1]それらが侵入した部位を特定するために、既知の「内部」ウイルスまたはトランスポゾン配列を使用して、隣接する「外部」ゲノムDNAの小さな部分を増幅するプライマーを設計することができる。増幅された産物はその後、配列決定され、 DNAデータベースと比較され、破壊された配列の位置を特定することができる。

逆PCR法では、一連の制限消化とライゲーションが行われ、既知の配列の単一セクションからPCR用に準備できるループ断片が生成されます。その後、他のポリメラーゼ連鎖反応プロセスと同様に、DNAは耐熱性DNAポリメラーゼによって増幅されます。

1. 既知の配列の内部セクションと未知の隣接領域を持つターゲット領域が特定される
2. ゲノム DNA は、通常、低～中頻度 (6～8 塩基) で切断される制限酵素によって、数キロベースの断片に分解されます。
3. DNA 濃度が低い場合や連結反応が速い場合には、自己連結反応が誘発され、環状 DNA 産物が生成されます。
4. PCR は通常どおり、既知の内部配列のセクションに相補的なプライマーを外側に向けて、円形テンプレートで実行されます。

最後に、配列決定された PCR 産物の配列を配列データベースと比較します。これは染色体クローリングの場合に使用されます。