タッチダウンポリメラーゼ連鎖反応

タッチダウンポリメラーゼ連鎖反応またはタッチダウンスタイルのポリメラーゼ連鎖反応は、プライマーが非特異的な配列を増幅しないようにするポリメラーゼ連鎖反応の方法です。 ^[1]ポリメラーゼ連鎖反応中のアニーリング温度によって、プライマーのアニーリングの特異性が決まります。プライマーの融点によって、アニーリング温度の上限が決まります。この点より少し高い温度では、プライマーとテンプレートの間で非常に特異的な塩基対合のみが発生します。温度が低いと、プライマーの結合はそれほど特異的ではありません。非特異的なプライマー結合は、ポリメラーゼ連鎖反応の結果を不明瞭にします。これは、増幅の初期段階でプライマーがアニーリングする非特異的な配列が、ポリメラーゼ増幅の指数関数的な性質のために、特定の配列を「圧倒」してしまうためです。^[2]

方法

タッチダウンポリメラーゼ連鎖反応サイクルの最初のステップでは、アニーリング温度が高くなります。アニーリング温度は、その後のサイクルごとに段階的に低下します。プライマーは、非特異的結合を許容できる最高温度でアニーリングします。したがって、増幅される最初の配列は、プライマーの特異性が最大となる領域間の配列です。これが目的の配列である可能性が最も高くなります。これらの断片は、その後の低温でのラウンドでさらに増幅され、プライマーが低温で結合する可能性のある非特異的配列に打ち勝ちます。プライマーが最初に（高温フェーズで）目的の配列に結合すると、その後のポリメラーゼ連鎖反応ラウンドを生成物に対して実行して、それらの断片をさらに増幅することができます。タッチダウンは、高温での反応の特異性を高め、アニーリング温度を下げることで、終わりに向かって効率を高めます。^[3]

数学的な観点から見ると、より低い温度でのアニーリングの生成物は、サイクルの最初のアニーリングとサイクルの2 番目のアニーリングで不利になります。 $2^{ij}$ $i$ $j$ $i,j\in \mathbb {N} ,i\geq j$

参考文献

^ Don R、Cox P、Wainwright B、Baker K、Mattick J (1991)。「遺伝子増幅中の誤ったプライミングを回避するための「タッチダウン」PCR」。Nucleic Acids Res . 19 (14): 4008. doi :10.1093/nar/19.14.4008. PMC 328507 . PMID 1861999。
^ Hecker K、Roux K (1996)。「アニーリング温度 の高低により、タッチダウンPCRとステップダウンPCRの特異性と収量の両方が増加する」。BioTechniques。20 ( 3 ) : 478–85。doi : 10.2144/ 19962003478。PMID 8679209 。
^ Roux K (1994). 「タッチダウンPCRにおける不一致プライマーテンプレートペアの使用」BioTechniques . 16 (5): 812–4. PMID 8068332.

[1] Don R、Cox P、Wainwright B、Baker K、Mattick J (1991)。「遺伝子増幅中の誤ったプライミングを回避するための「タッチダウン」PCR」。Nucleic Acids Res . 19 (14): 4008. doi :10.1093/nar/19.14.4008. PMC 328507 . PMID 1861999。

[2] ^ Hecker K、Roux K (1996)。「アニーリング温度 の高低により、タッチダウンPCRとステップダウンPCRの特異性と収量の両方が増加する」。BioTechniques。20 ( 3 ) : 478–85。doi : 10.2144/ 19962003478。PMID 8679209 。

[3] Roux K (1994). 「タッチダウンPCRにおける不一致プライマーテンプレートペアの使用」BioTechniques . 16 (5): 812–4. PMID 8068332.