DNAシーケンシング

分子生物学では、ゲノムとそのゲノムがコードするタンパク質を研究するために、シーケンシングが用いられる。シーケンシングによって得られた情報により、研究者は遺伝子や非コードDNA（調節配列を含む）の変化、疾患や表現型との関連性、そして潜在的な薬剤標的を特定することができる。

DNAは世代から世代へと伝達される情報量の多い高分子であるため、DNAシーケンスは進化生物学において、異なる生物がどのように関連し、どのように進化してきたかを研究するために使用されています。2021年2月、科学者たちは、100万年以上前の動物の遺骸（この場合はマンモス）からDNAを初めてシーケンスしたと報告しました。これは現在までにシーケンスされた最古のDNAです。^{[ 9 ] [ 10 ]}

メタゲノミクスの分野では、水、下水、土壌、空気から濾過された破片、または生物の綿棒サンプル中に存在する生物を特定します。特定の環境にどのような生物が存在するかを知ることは、生態学、疫学、微生物学、その他の分野の研究にとって非常に重要です。例えば、シーケンス解析によって、研究者はマイクロバイオームにどのような種類の微生物が存在するかを特定することができます。

ほとんどのウイルスは光学顕微鏡では小さすぎて見えないため、ウイルスの同定と研究にはシーケンス解析がウイルス学の主要なツールの 1 つとなっています。^{[ 11 ]}ウイルスのゲノムは DNA または RNA に基づいています。RNA ウイルスは臨床サンプル中で分解が速いため、ゲノムシーケンス解析にはより時間的制約があります。^{[ 12 ]}従来のサンガーシーケンス法と次世代シーケンス法は、基礎研究や臨床研究におけるウイルスのシーケンス解析、新興ウイルス感染症の診断、ウイルス病原体の分子疫学、薬剤耐性試験などに使用されています。GenBankには 230 万を超える固有のウイルス配列があります。^{[ 11 ]} 2019 年に、NGS はウイルスゲノムを生成する最も一般的なアプローチとして従来のサンガーシーケンス法を上回りました。^{[ 11 ]}

1997年の鳥インフルエンザの流行時には、ウイルス配列解析により、インフルエンザの亜型がウズラと家禽の間での遺伝子再集合によって発生したことが判明した。これにより、香港では生きたウズラと家禽を市場で一緒に販売することを禁止する法律が制定された。ウイルス配列解析は、分子時計技術を用いてウイルスの流行がいつ始まったかを推定するためにも使用できる。^{[ 12 ]}

医療技術者は、遺伝性疾患のリスクがあるかどうかを判断するために、患者から遺伝子（理論的には全ゲノム）の配列を決定することがあります。これは遺伝子検査の一種ですが、すべての遺伝子検査が全ゲノムDNA配列決定を伴うわけではありません。^{[ 13 ]}

2013年現在、DNAシーケンスは希少疾患の診断と治療にますます使用されるようになっている。希少遺伝性疾患の原因となる遺伝子がますます多く特定されるにつれて、患者に対する分子診断がより主流になりつつある。DNAシーケンスにより、臨床医は遺伝性疾患を特定し、疾患管理を改善し、生殖カウンセリングを提供し、より効果的な治療法を提供することができる。^{[ 14 ]}遺伝子シーケンスパネルは、疑われる疾患の複数の潜在的な遺伝的原因を特定するために使用される。^{[ 15 ]}

また、DNAシーケンスは特定の細菌を特定し、より正確な抗生物質治療を可能にすることで、細菌集団における抗菌薬耐性の発生リスクを低減するのに役立つ可能性がある。 ^{[ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]}

DNA シーケンスは、法医学的識別^{[ 22 ]}および親子鑑定のためのDNA プロファイリング法と併用されることがあります。DNA 検査は、過去 数十年で飛躍的に進化し、最終的には DNA プリントを調査対象に結び付けることができるようになりました。指紋、唾液、毛包などの DNA パターンは、それぞれの生物を他の生物と区別する固有のものです。DNA 検査は、DNA 鎖内の特定のゲノムを検出して、固有のパターンを生成する技術です。

デオキシリボ核酸（DNA ）は1869年にフリードリヒ・ミーシャーによって初めて発見・単離されましたが、 DNAではなくタンパク質が生命の遺伝的設計図を保持していると考えられていたため、その後数十年間、研究は十分に行われませんでした。この状況は1944年以降、オズワルド・エイブリー、コリン・マクラウド、マクリン・マッカーティらの実験によって、精製されたDNAが細菌の株を別の株に変えることができることが実証されたことで一変しました。これは、DNAが細胞の性質を変化させる能力を持つことが初めて示された事例でした。

1953年、ジェームズ・ワトソンとフランシス・クリックは、ロザリンド・フランクリンが研究していた結晶化されたX線構造に基づいて、DNAの二重らせんモデルを提唱した。このモデルによれば、DNAは互いに巻き付いた2本のヌクレオチド鎖から構成され、水素結合によって互いに連結され、逆方向に走っている。各鎖は4つの相補的なヌクレオチド（アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、チミン（T））から構成され、一方の鎖のAは常に他方の鎖のTと対になり、Cは常にGと対になる。彼らは、このような構造によって各鎖が他方の鎖を再構築するために使用できると提唱し、これは世代間で遺伝情報が伝達される上で中心的な考え方であるとした。^{[ 29 ]}

タンパク質の配列決定の基礎は、フレデリック・サンガーの研究によって最初に築かれました。彼は1955年までに、膵臓から分泌される小さなタンパク質であるインスリンのすべてのアミノ酸配列を完成させました。これは、タンパク質が液体中に懸濁した物質のランダムな混合物ではなく、特定の分子パターンを持つ化学物質であるという最初の決定的な証拠を提供しました。サンガーのインスリン配列決定の成功は、ワトソンやクリックを含むX線結晶学者を刺激し、彼らは当時、DNAが細胞内でタンパク質の形成をどのように指示するのかを理解しようとしていました。1954年10月にフレデリック・サンガーが行った一連の講義に出席した後、クリックは、DNAのヌクレオチドの配置がタンパク質のアミノ酸配列を決定し、それがタンパク質の機能を決定するのに役立つという理論を開発し始めました。彼は1958年にこの理論を発表しました。^{[ 30 ]}

RNAシーケンスは、ヌクレオチドシーケンスの最も初期の形態の1つです。RNAシーケンスの主要なランドマークは、1972年^{[ 31 ]}と1976年^{[ 32} ]にゲント大学（ベルギー、ゲント）のウォルター・フィアーズとその同僚によって同定され発表された、バクテリオファージMS2の最初の完全な遺伝子と完全なゲノムの配列です。従来のRNAシーケンス法では^、配列決定する必要のあるcDNA分子の作成が必要です。^{[ 33 ]}

DNA配列を決定する最初の方法は、1970年にコーネル大学で中国生まれのアメリカ人遺伝学者レイ・ウーによって確立された位置特異的プライマー伸長戦略でした。^{[ 34 ]}現在のシーケンススキームで重要な役割を果たすDNAポリメラーゼ触媒作用と特異的ヌクレオチド標識の両方を使用して、ラムダファージDNAの粘着末端をシーケンスしました。^{[ 35 ] [ 36 ] [ 37 ]} 1970年から1973年の間に、ウー、科学者ラダ・パドマナバン、および同僚は、この方法が合成位置特異的プライマーを使用して任意のDNA配列を決定するために使用できることを実証しました。^{[ 38 ] [ 39 ] [ 8 ]}

ハーバード大学の生化学者ウォルター・ギルバートと分子遺伝学者アラン・マクサムも、「化学分解によるDNA配列決定」を含む配列決定法を開発した。^{[ 40 ] [ 41 ]} 1973年、ギルバートとマクサムは、ワンダリングスポット解析として知られる方法を用いて24塩基対の配列を報告した。^{[ 42 ]}配列決定の進歩は、ウイルス以外の供給源からDNAサンプルを分離できるようになった組換えDNA技術の同時開発によって促進された。^{[ 43 ]}

2年後の1975年、生化学者のフレデリック・サンガーとゲノム科学者のアラン・コールソンは、DNAの配列を決定する方法を開発した。 ^{[ 44 ]} 「プラス・アンド・マイナス法」として知られるこの技術は、DNAのすべての構成要素を供給するが、DNAを完成させるために必要な4つの塩基のうちの1つの反応を除外するというものである。^{[ 45 ]}

1976年、ギルバートとマクサムはハーバード大学在学中に、マクサム・ギルバート法として知られるDNAの迅速な配列決定法を発明した。^{[ 46 ]}

1977年、サンガーは英国ケンブリッジのMRCセンターで、より迅速なDNAシーケンス法を開発するためにプライマー伸長戦略を採用した。この技術は彼の「プラスとマイナス」戦略に似ていたが、 in vitro DNA複製中にDNAポリメラーゼによる鎖終結ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）の選択的取り込みに基づいていた。^{[ 47 ] [ 48 ] [ 49 ]}サンガーはこの方法を同年発表した。^{[ 50 ]}

ギルバートがDNA配列決定に興味を持ったきっかけは、遺伝子制御、特にラクトースオペロンの研究だった。この方法は、迅速なDNA配列決定のための最初の実用的な技術の一つであり、ギルバートとフレデリック・サンガーは、核酸配列決定へのそれぞれの独立した貢献により、1980年のノーベル化学賞を受賞した。

最初に配列決定された完全なDNAゲノムは、1977年のバクテリオファージφX174のものでした。 ^{[ 51 ]}医学研究評議会の科学者は1984年にエプスタイン・バーウイルスの完全なDNA配列を解読し、それが172,282ヌクレオチドから構成されていることを発見しました。この配列の完成は、ウイルスの遺伝子プロファイルに関する事前の知識なしに達成されたため、DNAシーケンスにおける重要な転換点となりました。^{[ 52 ] [ 8 ]}

1980年代初頭、ハーバート・ポールとその同僚らは、電気泳動中にシーケンス反応混合物のDNA分子を固定化マトリックスに転写するための非放射性方法を開発した。 ^{[ 53 ] [ 54 ]}続いて、EUゲノムシーケンスプログラムの枠組みで集中的に使用されたGATCバイオテックによるDNAシーケンサー「Direct-Blotting-Electrophoresis-System GATC 1500」が商品化され、酵母Saccharomyces cerevisiae染色体IIの完全なDNA配列が解読された。^{[ 55 ]}カリフォルニア工科大学のリロイ・E・フッドの研究室は、1986年に最初の半自動DNAシーケンシングマシンを発表した。^{[ 56 ]}これに続いて、1987年にアプライドバイオシステムズが最初の全自動シーケンシングマシンであるABI 370を発売し、デュポンのGenesis 2000 ^{[ 57 ]}は、1つのレーンで4つのジデオキシヌクレオチドすべてを識別できる新しい蛍光標識技術を使用した。1990年までに、米国国立衛生研究所（NIH）は、マイコプラズマ・カプリコラム、大腸菌、線虫、サッカロミセス・セレビシエの大規模なシーケンシング試験を塩基あたり0.75米ドルの費用で開始した。一方、クレイグ・ベンターの研究室では、ヒトゲノムのコード領域を捉える試みとして、発現配列タグと呼ばれるヒトcDNA配列のシーケンス解析が始まった。^{[ 58 ]} 1995年、ベンター、ハミルトン・スミス、およびゲノム研究所（TIGR）の同僚らは、自由生活生物である細菌インフルエンザ菌の最初の完全なゲノムを発表した。この環状染色体は1,830,137塩基からなり、サイエンス誌に掲載された^{[ 59 ]}ことで、全ゲノムショットガンシーケンス解析の最初の発表例となり、初期のマッピング作業の必要性がなくなった。

2003年までに、ヒトゲノムプロジェクトのショットガンシーケンス法を用いてヒトゲノムのドラフト配列が作成され、その精度は92%でした。^{[ 60 ] [ 61 ] [ 62 ]} 2022年には、科学者たちはヒトゲノムの最後の8%の配列決定に成功しました。完全に配列決定された標準参照遺伝子はGRCh38.p14と呼ばれ、31億塩基対を含んでいます。^{[ 62 ] [ 63 ]}

1990年代半ばから後半にかけて、いくつかの新しいDNAシーケンス法が開発され、2000年までに市販のDNAシーケンサーに実装されました。これらはまとめて「次世代」または「第2世代」シーケンス（NGS）法と呼ばれ、サンガーシーケンスなどの以前の方法と区別されています。第1世代のシーケンスとは対照的に、NGS技術は一般的に拡張性が高く、ゲノム全体を一度にシーケンスできるのが特徴です。通常、これはゲノムを小さな断片に分割し、断片をランダムにサンプリングして、以下に説明するようなさまざまな技術のいずれかを使用してシーケンスすることで実現されます。複数の断片が自動化されたプロセスで一度にシーケンスされるため（「超並列」シーケンスと呼ばれる）、ゲノム全体をシーケンスすることが可能です。

NGS技術は、研究者が健康に関する知見を探したり、人類学者が人類の起源を調査したり、「個別化医療」運動を促進したりする上で、非常に大きな力を与えてきました。しかし、同時に、エラーが発生する余地も大きくなっています。NGSデータの計算解析を実行するためのソフトウェアツールは多数あり、多くの場合、CSI NGS Portalなどのオンラインプラットフォームにまとめられており、それぞれ独自のアルゴリズムを備えています。1つのソフトウェアパッケージ内のパラメータでさえ、解析結果を変える可能性があります。さらに、DNAシーケンスによって生成される大量のデータにより、配列解析のための新しい方法とプログラムの開発も必要となっています。これらの課題に対処するために、NGS分野の標準を開発する取り組みがいくつか試みられてきましたが、そのほとんどは個々の研究室から生まれた小規模な取り組みでした。ごく最近では、FDAの資金提供を受けた大規模で組織的な取り組みが、BioCompute標準として結実しました。^{[ 65 ]}

1990年10月26日、ロジャー・ツィエン、ペピ・ロス、マーガレット・ファーンストック、アラン・J・ジョンストンは、DNAアレイ（ブロットおよび単一DNA分子）上の除去可能な3'ブロッカーを用いた段階的（「塩基ごと」）シーケンス法を記載した特許を出願した。^{[ 66 ]} 1996年、ストックホルム王立工科大学のポール・ニュレンと彼の学生モスタファ・ロナギは、パイロシークエンシング法を発表した。^{[ 67 ]}

1997年4月1日、パスカル・メイヤーとローラン・ファリネリは、DNAコロニーシーケンスに関する特許を出願した。^{[ 68 ]}この特許に記載されているDNAサンプル調製法とランダム表面ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アレイ法は、ロジャー・ツィエンらの「塩基ごとの」シーケンス法と組み合わされ、現在イルミナのHi-Seqゲノムシーケンサーに実装されている。

1998年、ワシントン大学のフィル・グリーンとブレント・ユーイングは、シーケンサーデータ解析のためのphred品質スコアを発表しました^{[ 69 ]。}これは広く採用された画期的な解析手法であり、現在でもシーケンシングプラットフォームの精度を評価するための最も一般的な指標となっています^{[ 70 ] 。}

Lynx Therapeuticsは2000年に大規模並列シグネチャーシーケンス（MPSS）を発表し、販売した。この方法は、並列化されたアダプター/ライゲーションを介したビーズベースのシーケンス技術を取り入れたもので、市販された最初の「次世代」シーケンス法として機能したが、独立した研究所にDNAシーケンサーは販売されなかった。^{[ 71 ]}

アラン・マクサムとウォルター・ギルバートは1977年に、DNAの化学修飾とそれに続く特定の塩基での切断に基づくDNAシーケンス法を発表した。^{[ 40 ]}化学シーケンス法としても知られるこの方法は、精製された二本鎖DNAサンプルをクローニングせずに使用することを可能にした。この方法は放射性標識を使用し、技術的に複雑であったため、サンガー法の改良が行われた後に広く使用されることはなかった。

Maxam-Gilbert法による配列決定では、DNAの5'末端の一方に放射性標識を施し、配列決定するDNA断片を精製する必要があります。次に、化学処理によって、4つの反応（G、A+G、C、C+T）それぞれにおいて、4つのヌクレオチド塩基のうち1つまたは2つのごく一部に切断が生じます。修飾化学物質の濃度は、DNA分子1つあたり平均1つの修飾が導入されるように制御されます。こうして、放射性標識された末端から各分子の最初の「切断」部位まで、一連の標識断片が生成されます。4つの反応で得られた断片は、サイズ分離のために変性アクリルアミドゲル中で並べて電気泳動されます。断片を可視化するために、ゲルをX線フィルムに露光してオートラジオグラフィーを行い、放射性標識されたDNA断片に対応する一連の暗いバンドが得られ、そこから配列を推測することができます。^{[ 40 ]}

この方法は2023年現在ではほとんど使われなくなっている。^{[ 72 ]}

1977年にフレデリック・サンガーとその同僚によって開発された鎖終結法は、その比較的容易さと信頼性から、すぐに主流の方法となった。 ^{[ 50 ] [ 73 ]}鎖終結法は、発明当時、マクサムとギルバートの方法よりも毒性の低い化学物質と放射能の使用量が少なくて済んだ。比較的容易なため、サンガー法はすぐに自動化され、第一世代のDNAシーケンサーで使用される方法となった。

サンガーシーケンス法は、1980年代から2000年代半ばまで主流だった方法です。この期間に、蛍光標識、キャピラリー電気泳動、一般的な自動化など、この技術は大きく進歩しました。これらの発展により、シーケンス処理がはるかに効率的になり、コストが削減されました。大量生産型のサンガー法は、 2001年に最初のヒトゲノムを作成し、ゲノミクスの時代を到来させた技術です。しかし、その後の10年間で、根本的に異なるアプローチが市場に登場し、ゲノムあたりのコストは2001年の1億ドルから2011年には1万ドルにまで下がりました。^{[ 74 ]}

合成によるシーケンシャルシーケンシング（SBS）の目的は、DNAポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みを検出することによって、DNAサンプルの配列を決定することです。人工ポリメラーゼを使用してDNAの1本鎖のコピーを合成し、各ヌクレオチドの取り込みを監視します。リアルタイム合成シーケンシングの原理は1993年に初めて記述され^{[ 75 ]、}数年後に改良版が発表されました。^{[ 76 ]} SBSのすべての実施形態において、主要な部分は非常に類似しており、(1) DNAの増幅(後続のシグナルを増強するため)と、シーケンスするDNAを固体支持体に付着させる( PacBio SMRTは例外)、(2)固体支持体上に一本鎖DNAを生成する、(3)設計されたポリメラーゼを使用してヌクレオチドを組み込む、(4)ヌクレオチドの組み込みをリアルタイムで検出する、というステップが含まれる。ステップ3～4が繰り返され、ステップ4で得られたシグナルから配列が組み立てられる。このリアルタイム合成シーケンスの原理は、 454、PacBio、IonTorrent、Illumina、MGIを含むほぼすべての大規模並列シーケンス装置で使用されている。^{[ 77 ]}

ショットガンシーケンシングは、1000塩基対より長いDNA配列、染色体全体を含む配列の解析用に設計されたシーケンシング法です。この方法では、ターゲットDNAをランダムな断片に切断する必要があります。鎖終結法を使用して個々の断片をシーケンシングした後、重複する領域に基づいて配列を再構成できます。^{[ 88 ]}この方法は、ヒトゲノムプロジェクトで広く使用されました。^{[ 89 ]}

別のアプローチでは、一本鎖DNAがチャネルを通過する際の電気的トンネル電流の測定を利用します。電子構造に応じて、各塩基はトンネル電流に異なる影響を与え、^{[ 148 ]}異なる塩基を区別することができます。^{[ 149 ]}

トンネル電流の使用は、イオン電流法よりも桁違いに高速なシーケンスを実現する可能性があり、すでにいくつかのDNAオリゴマーとマイクロRNAのシーケンスが達成されている。^{[ 150 ]}

ハイブリダイゼーションによるシーケンス解析は、 DNAマイクロアレイを使用する非酵素法です。配列を決定するDNAの単一プールを蛍光標識し、既知の配列を含むアレイにハイブリダイゼーションさせます。アレイ上の特定のスポットからの強いハイブリダイゼーションシグナルによって、シーケンス解析中のDNA中のそのスポットの配列が特定されます。 ^{[ 151 ]}

このシーケンス法は、DNAプローブとも呼ばれる短い一本鎖DNA分子（オリゴヌクレオチド）のライブラリーの結合特性を利用して、標的DNA配列を再構築します。非特異的ハイブリッドは洗浄によって除去され、標的DNAが溶出されます。^{[ 152 ]}ハイブリッドは、DNA配列を再構築できるように再配置されます。このシーケンス法の利点は、均一なカバレッジで多数の標的を捕捉できることです。^{[ 153 ]}通常、多数の化学物質と開始DNAが必要です。しかし、溶液ベースのハイブリダイゼーションの出現により、必要な機器と化学物質は大幅に削減されました。^{[ 152 ]}

質量分析法は、DNA配列の決定に使用できます。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）は、DNA断片を可視化するためのゲル電気泳動の代替法として特に研究されています。この方法では、鎖終結シーケンス反応によって生成されたDNA断片は、サイズではなく質量によって比較されます。各ヌクレオチドの質量は他のヌクレオチドとは異なり、この違いは質量分析法によって検出できます。断片内の単一ヌクレオチド変異は、ゲル電気泳動のみの場合よりもMSの方が容易に検出できます。MALDI-TOF MSはRNA断片間の違いをより容易に検出できるため、研究者は、まずDNAをRNAに変換することで、MSベースの方法で間接的にDNAの配列を決定することができます。^{[ 154 ]}

MSベースの方法によって可能となるDNA断片の高解像度は、法医学の研究者にとって特に興味深い。なぜなら、彼らは個人を特定するためにヒトDNAサンプル中の単一ヌクレオチド多型を見つけたい場合があるからである。これらのサンプルは高度に分解されている可能性があるため、法医学の研究者は、安定性が高く系統研究に応用できるミトコンドリアDNAを好むことが多い。MSベースのシーケンス法は、連邦捜査局のデータベース^{[ 155 ]}のサンプルと第1次世界大戦の兵士の集団墓地で発見された骨^{[ 156 ]}からのヒトミトコンドリアDNAの配列を比較するために使用されてきた。

初期の鎖終結法とTOF MS法では、最大100塩基対のリード長が実証されました。^{[ 157 ]}研究者はこの平均リードサイズを超えることができていません。鎖終結法のみの場合と同様に、MSベースのDNAシーケンスは、大規模なde novoシーケンスプロジェクトには適さない可能性があります。それでも、2010年の研究では、短いシーケンスリードと質量分析法を使用して、病原性連鎖球菌株の単一ヌクレオチド多型を比較しました。^{[ 158 ]}

マイクロ流体サンガーシーケンスでは、DNA断片の熱サイクル増幅と電気泳動による分離全体が単一のガラスウェハ（ 直径約10cm）上で行われるため、試薬の使用量とコストが削減されます。^{[ 159 ]}研究者の中には、マイクロチップを使用することで従来のシーケンスのスループットを向上させることができると実証した人もいます。^{[ 160 ]}この技術を効果的に使用するには、さらなる研究が必要です。

この手法では、電子顕微鏡を用いてDNA分子の配列を直接可視化します。原子番号が増加した原子を含む修飾塩基を酵素的に組み込むことにより、無傷のDNA分子内のDNA塩基対を初めて同定し、合成3,272塩基対DNA分子および7,249塩基対ウイルスゲノム内の個別に標識された塩基を直接可視化および同定することが実証されています。^{[ 161 ]}

この方法は、ポリスチレンビーズに結合したRNAポリメラーゼ（RNAP）の使用に基づいています。配列決定するDNAの一端を別のビーズに結合し、両方のビーズを光トラップに配置します。転写中のRNAPの動きによりビーズが接近し、相対距離が変化するため、それを単一ヌクレオチドの解像度で記録できます。配列は、サンガー法と同様に、4種類のヌクレオチドの濃度を下げた4つの読み出しに基づいて推測されます。^{[ 162 ]}領域間で比較が行われ、既知の配列領域と未知の配列領域を比較することによって配列情報が推測されます。^{[ 162 ]}

454パイロシークエンシングとin vitroウイルスmRNAディスプレイ法を組み合わせた方法を用いて、タンパク質相互作用の全セットを解析する方法が開発された。具体的には、この方法では目的のタンパク質をそれらをコードするmRNAに共有結合させ、逆転写PCRを用いてmRNA断片を検出する。その後、mRNAを増幅して配列決定することができる。この組み合わせた方法はIVV-HiTSeqと名付けられ、無細胞条件下で実施できるが、その結果はin vivo条件を代表するものではない可能性がある。^{[ 163 ]}

シーケンサーによって生成された生のリードは、その長さのごく一部しか正確で精密ではない場合があります。リード全体を使用すると、ゲノムアセンブリ、SNPコール、遺伝子発現推定などの下流の解析でアーティファクトが発生する可能性があります。ウィンドウベースまたはランニングサムクラスのアルゴリズムに基づいて、2種類のトリミングプログラムが導入されています。^{[ 172 ]}以下は、現在利用可能なトリミングアルゴリズムの一部リストで、それぞれのアルゴリズムクラスを指定しています。