入門ウォーキング

プライマーウォーキングは、既知の最も近いマーカー（既知の遺伝子など）から遺伝子（疾患遺伝子など）をクローン化するために使用される技術です。そのため、植物、菌類、および哺乳類のクローン化と配列決定に、わずかな変更を加えて使用されています。この技術は「指向性配列決定」とも呼ばれ、一連のサンガー配列決定反応を使用して、参照配列に基づいて既知のプラスミドまたはPCR産物の参照配列を確認するか（配列確認サービス）、重複するセクションを配列決定するプライマーを設計して完全なプラスミドまたはPCR産物の未知の配列を発見します（配列発見サービス）。^[1]

プライマーウォーキングは1.3～7.0 kbの範囲までのDNA配列を決定する方法であるのに対し、染色体ウォーキングは既知の遺伝子配列のクローンを作成するために使用されます。^[2] 長すぎる断片は、連鎖終結法を使用して1回のシーケンス読み取りでシーケンスすることはできません。この方法は、長いシーケンスをいくつかの連続した短いシーケンスに分割することによって機能します。対象のDNAは、プラスミドインサート、PCR産物、またはゲノムのシーケンス時のギャップを表すフラグメントです。「プライマーウォーキング」という用語は、ゲノムのシーケンスを主な目的とする場合に使用されます。代わりに「染色体ウォーキング」という用語は、シーケンスが既知であるが遺伝子のクローンが存在しない場合に使用されます。たとえば、疾患の遺伝子は、シーケンス上のRFLPなどの特定のマーカーの近くにある可能性があります。 ^[3]染色体ウォーキングは、既知の最も近いマーカー（既知の遺伝子など）から遺伝子（疾患遺伝子など）をクローン化するために使用される技術であり、植物、真菌、動物のクローニングおよびシーケンシングプロジェクトで中程度の変更に使用されます。言い換えれば、マッピングする遺伝子の近くにある特定の配列を見つけ、分離し、クローン化するために利用されます。大きな断片のライブラリ（主に細菌の人工染色体ライブラリ）は、主にゲノムプロジェクトで使用されます。目的のコロニーを識別し、特定のクローンを選択するために、ライブラリは最初に目的のプローブでスクリーニングされます。スクリーニング後、クローンはプローブとオーバーラップされ、オーバーラップする断片がマッピングされます。これらの断片は、他のクローンを識別するための新しいプローブ（クローンの3'または5'末端から取得された短いDNA断片）として使用されます。ライブラリは約96個のクローンで構成され、各クローンには異なるインサートが含まれています。プローブ1は、λ1とλ2をオーバーラップするため識別します。 λ2クローンから得られたプローブ2はλ3の識別に使用され、以下同様に続きます。クローンの方向はクローンの制限マッピングによって決定されます。このようにして、遺伝子の近くにある新しい染色体領域を識別することができます。染色体ウォーキングは時間がかかるため、遺伝子の識別には染色体ランディングが最適な方法です。この方法では、変異遺伝子座にしっかりと関連するマーカーの発見が必要です。^[4]

断片は、まず短い断片であるかのように配列決定されます。配列決定は、ユニバーサルプライマーまたは特別に設計されたプライマーを使用して、両端から実行されます。これにより、最初の約1000塩基が特定されます。関心領域を完全に配列決定するには、連続した配列情報を取得するための新しいプライマー（既知の配列の最後の20塩基に相補的）の設計と合成が必要です。^[5]

プライマーウォーキングは、プライマーがDNAの既知の領域から設計され、特定の方向に配列を誘導するため、指向性配列決定の一例です。指向性配列決定とは対照的に、DNAのショットガン配列決定はより迅速な配列決定戦略です。^[6]

ゲノム配列決定の「昔」からある技術があります。配列決定の基本的な方法は、サンガー連鎖終結法で、読み取り長さは 100 から 1000 塩基対 (使用する機器によって異なります) です。つまり、長い DNA 分子を分解し、クローン化してから配列決定する必要があります。2 つの方法があります。^[7]

1 つ目は染色体ウォーキング (またはプライマーウォーキング) と呼ばれ、最初の部分の配列決定から始まります。次に、最初の配列の終わりに相補的なプライマーを使用して、配列の次の (連続した) 部分を配列決定します。この手法では、多くの組み立て作業は必要ありませんが、プライマーが大量に必要になり、比較的時間がかかります。^[8]

この問題を克服するために、ショットガン シーケンシング法が開発されました。この方法では、DNA を異なる断片に分割し (すべて同じ場所で分割されるわけではありません)、クローニングして、クローニングに使用したベクターに固有のプライマーでシーケンシングします。これにより重複する配列が生成されますが、これをコンピューターで 1 つの配列に組み立てる必要があります。この方法では、シーケンシングの並列化が可能になり (同時に多数のシーケンシング反応を準備して実行できます)、プロセスが大幅に高速化されるとともに、配列固有のプライマーも不要になります。課題は、重複が明確ではないため、配列を順序どおりに整理することです。この問題を解決するために、最初のドラフトを作成し、次にプライマー ウォーキングなどの他の手法を使用して重要な領域を再シーケンシングします。^[9]

全体的なプロセスは次のようになります。配列する DNA の先頭に一致するプライマーを使用して、プライマーから始めて、未知の配列に隣接する短い DNA 鎖を合成します ( PCRを参照)。新しい短い DNA 鎖は、連鎖終結法を使用して配列決定されます。配列決定された鎖の末端は、長い DNA 配列の次の部分のプライマーとして使用されます。これが「ウォーキング」という用語の由来です。

この方法は染色体全体の配列を決定するために使用できる（したがって「染色体ウォーキング」）。^{[10]プライマーウォーキングは、特別に選択されたプライマーの代わりにランダムなプライマーを使用する}ショットガンシーケンシングの開発の基礎でもあった。

• 染色体ジャンピング
• 染色体の着陸
• ショットガン シーケンシング– 連続したサブストランドではなくランダムなサブストランドを使用する代替方法。