Taqポリメラーゼ

DNAポリメラーゼI、耐熱性
Taq polAの大きな（クレノウ）断片。polAと痕跡ドメインを含む。
識別子
生物	テルムス・アクアティクス
シンボル	ポラ
ユニプロット	P19821
検索する 構造 スイスモデル ドメイン インタープロ

Taqポリメラーゼ は、1976年にChienらによって最初に単離された好熱性真正細菌微生物Thermus aquaticusにちなんで命名された耐熱性DNAポリメラーゼである。^{[1]その名前は}TaqまたはTaq pol と略されることが多い。これは、 DNAの短いセグメントの量を大幅に増幅する方法であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で頻繁に使用される。

T. aquaticusは温泉や熱水噴出孔に生息する細菌で、TaqポリメラーゼはPCR中に必要とされるタンパク質変性条件（高温）に耐えられる酵素 として同定されました^{[1] 。 [2]}そのため、 PCRで元々使用されていた大腸菌由来のDNAポリメラーゼに取って代わりました。 ^[3]

Taq の最適活性温度は75～80 °C で、半減期は 92.5 °C で 2 時間以上、95 °C で 40 分、97.5 °C で 9 分であり、72 °C では 10 秒未満で1000塩基対の DNA 鎖を複製できます。 ^[4] 75～80 °C では、Taq は酵素分子あたり毎秒約 150ヌクレオチドの最適重合速度に達し、最適温度範囲から外れると酵素の伸長速度が抑制されます。単一のTaq は、70 °C で毎秒約 60 ヌクレオチド、55 °C で毎秒 24 ヌクレオチド、37 °C で毎秒 1.5 ヌクレオチド、22 °C で毎秒 0.25 ヌクレオチドを合成します。 90 °C を超える温度では、Taq はほとんどまたはまったく活性を示さないが、酵素自体は変性せず、そのまま残る。^{[5]反応容器内の特定の}イオン の存在も、酵素の特定の活性に影響を与える。少量の塩化カリウム( KCl ) とマグネシウムイオン (Mg ²⁺ )はTaqの酵素活性を促進する。Taqポリメラーゼは 50 mM KCl で最大限に活性化されるが、最適な Mg ^2+濃度はヌクレオシド三リン酸(dNTP)の濃度によって決まる。高濃度の KCl と Mg ^{2+ は}Taqの活性を阻害する。 ^[6]一般的な金属イオンキレート剤EDTA は、これらの金属イオンが存在しない場合にTaqに直接結合する。 ^[7]

Taqの欠点の1つは、 3'から5' エキソヌクレアーゼの 校正活性が欠如していることである^[4]。その結果、複製の忠実度が比較的低くなる。当初、そのエラー率は9,000ヌクレオチドあたり約1と測定された。^{[8]校正活性を有する}Pfu DNAポリメラーゼなどのいくつかの耐熱性DNAポリメラーゼは、他の好熱性細菌や古細菌から単離されており、高忠実度増幅のためにTaqの代わりに（またはTaqと組み合わせて）使用されている。^[9]忠実度はTaq間で大きく異なる可能性があり、これは下流のシーケンシングアプリケーションに大きな影響を与える。^[10]

Taq は、3' 末端にA (アデニン) オーバーハングを持つ DNA 産物を生成します。これはTA クローニングに有用です。TA クローニングでは、T (チミン) 3' オーバーハングを持つクローニングベクター(プラスミドなど)が使用され、PCR 産物の A オーバーハングと補完し、 PCR 産物をプラスミドベクターに連結することができます。

1980年代初頭、カリ・ムリスはシータス社で合成DNAのバイオテクノロジーへの応用に取り組んでいた。彼はDNAオリゴヌクレオチドを標的DNA鎖に結合するためのプローブとして使用することや、DNA配列決定やcDNA合成のためのプライマーとして使用することに精通していた。1983年に、彼は標的DNAの各鎖にハイブリダイズする2つのプライマーを使用し、反応にDNAポリメラーゼを加えることを始めた。これにより指数関数的なDNA複製が起こり、^[11]プライマー間のDNAの個別のセグメントが大幅に増幅された。^[3]

しかし、各複製ラウンドの後に、新しく形成された DNA を変性させ、鎖を分離して次の増幅ラウンドのテンプレートとして機能させるために、混合物を 90 °C 以上に加熱する必要があります。この加熱ステップでは、 Taqポリメラーゼが発見される前に使用されていた DNA ポリメラーゼ、クレノウフラグメント(大腸菌由来) も不活性化されます。Taqポリメラーゼは、変性させることなく DNA 鎖を分離するために必要な 95 °C の温度に耐えることができるため、この用途に適しています。

耐熱性Taqを使用すると、PCRを高温（約60℃以上）で実行できるため、プライマーの特異性が高まり、プライマーダイマーなどの非特異的産物の生成が減少します。また、耐熱性ポリメラーゼを使用すると、サーモサイクリングの各ラウンドで新しい酵素を追加する必要がなくなります。比較的単純な機械の1つの密閉チューブを使用して、プロセス全体を実行できます。このように、Taqポリメラーゼの使用は、PCRをDNA分析に関するさまざまな分子生物学の問題に適用できるようにした重要なアイデアでした。 ^[2]

ホフマン・ラ・ロシュは最終的に、PCR とTaq の 特許をCetus から 3 億 3000 万ドルで買収し、そこから最大 20 億ドルのロイヤリティを受け取った可能性がある。^[12] 1989 年、サイエンス誌はTaqポリメラーゼを最初の「今年の分子」に選んだ。1993 年、カリ・ムリスはノーベル化学賞を受賞したが、これはバイオテクノロジー企業で行われた研究に対して授与された唯一の賞である。1990 年代初頭までに、 Taqポリメラーゼを使用した PCR 技術は、基礎分子生物学研究、臨床検査、法医学など、多くの分野で使用されていた。また、エイズにおけるHIVの直接検出にも緊急の用途が見つかり始めた。^[13]

1999年12月、米国地方裁判所のヴォーン・ウォーカー判事は、 Taqポリメラーゼに関する1990年の特許は、一部、シータス社の科学者による誤解を招く情報と虚偽の主張に基づいて発行されたとの判決を下した。この判決は、1991年にTaq特許を購入したホフマン・ラ・ロシュ社に対するプロメガ社の異議申し立てを支持するものだった。ウォーカー判事は、判決の根拠として、シンシナティ大学生物科学部のジョン・トレラ教授の研究室を含む他の研究室による以前の発見を挙げた。^[14]

Taqポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ
DNAオクタマーに結合した完全なTaq DNAポリメラーゼ
識別子
シンボル	Taq-エキソヌク
パム	PF09281
インタープロ	著作権
SCOP2	1qtm / スコープ / SUPFAM
利用可能なタンパク質構造: パム   構造 / ECOD   ＰＤＢ RCSB PDB; PDBe; PDBj PDBサム 構造の概要

Taq Pol Aは大腸菌PolAと全体的な構造が似ています。校正を担う中央の3'-5'エキソヌクレアーゼドメインは劇的に変化しており、機能していません。^[15]アミノ末端には、以下に説明するように、機能的な5'-3'エキソヌクレアーゼドメインがあります。残りの2つのドメインは、結合したドメイン運動を介して協調して機能します。^[16]

Taqポリメラーゼエキソヌクレアーゼは、 Taq DNAポリメラーゼI（耐熱性）のアミノ末端に見られるドメインである。これはリボヌクレアーゼH様モチーフを担う。このドメインはポリメラーゼに5'- 3' エキソヌクレアーゼ活性を付与する。 ^[17]

大腸菌の同じドメインはプライマーを分解し、PCRに使用するためには消化によって除去する必要があるが、^[9]このドメインはプライマーを分解することはないと言われている。^{[18]この活性は}TaqManプローブで使用されている。娘鎖が形成されると、テンプレートに相補的なプローブがポリメラーゼと接触し、蛍光断片に切断される。^[19]

Taqポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性部位の溝で二重鎖 DNA の平滑末端と結合します。Taq ポリメラーゼが結合した DNA と接触すると、その側鎖は DNA のプリンおよびピリミジンと水素結合を形成します。DNA に結合したTaqポリメラーゼの同じ領域は、エキソヌクレアーゼとも結合します。Taq ポリメラーゼに結合したこれらの構造は、異なる相互作用を持ちます。

部位特異的変異誘発実験により、残留3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が2倍に向上したという報告があるが、そうすることでエラー率が減少するかどうかは報告されていない。^[20]同様の考え方に従って、大腸菌、Taq、T. neapolitanaポリメラーゼIからドメインを厳選してキメラタンパク質が作られている。残留ドメインを大腸菌の機能ドメインに交換すると、校正能力はあるものの最適温度が低く、熱安定性が低いタンパク質が作成された。^[21]

5'-3' エキソヌクレアーゼドメインを持たないポリメラーゼのバージョンが作られており、その中で最もよく知られているのはKlentaqまたはStoffelフラグメントです。エキソヌクレアーゼ活性が完全に欠如しているため、これらのバリアントは、二次構造を示すプライマーや環状分子のコピーに適しています。^{[9]その他のバリエーションには、} Klentaq を高忠実度ポリメラーゼと併用すること、 T7 DNA ポリメラーゼのように基質を認識するThermosequenase、阻害剤に対する耐性が高い変異体、または悪条件にもかかわらず DNA をよりしっかりと保持するために触媒部位の周りに余分なヘリックス-ヘアピン-ヘリックスモチーフを持つ「ドメインタグ」バージョンなどがあります。^[22]

TaqポリメラーゼはPCR DNA複製に改善をもたらし、特異性を高め、非特異的産物を減らし、プロセスと装置を簡素化したため、病気の検出に役立ってきました。「感染症の診断にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用することで、難治性病原体による病気を早期に診断して適切に治療し、成長の遅い微生物の抗菌薬感受性を判定し、感染量を確認することができるようになりました。」^[23] Taqポリメラーゼの導入により、数え切れないほどの命が救われました。結核、連鎖球菌性咽頭炎、非定型肺炎、エイズ、麻疹、肝炎、潰瘍性泌尿生殖器感染症など、世界で最も深刻な病気の多くを検出する上で重要な役割を果たしてきました。 PCRは、特定のDNAサンプルのコピーを再現するために使用される方法で、患者のサンプルから標的病原体の特定のDNA配列をターゲットにし、微量の指標配列を最大数十億回コピーして増幅することで、病気の検出を可能にします。これは、特にHIVの場合、病気を検出する最も正確な方法ですが、比較的高いコスト、労力、および時間を要するため、代替の劣った検査ほど頻繁には行われていません。^[24]

PCR複製プロセスの触媒としてのTaqポリメラーゼへの依存は、2020年のCOVID-19パンデミック中に強調されました。必要な酵素の不足により、世界中の国々がウイルスの検査キットを製造する能力が低下しました。Taqポリメラーゼがなければ、病気の検出プロセスははるかに遅く、面倒です。^[25]

TaqポリメラーゼをPCRによる疾患検出に使用する利点があるにもかかわらず、この酵素には欠点がないわけではありません。レトロウイルス疾患（HIV、HTLV-1、HTLV-II）では、ゲノム中のグアニンからアデニンへの変異がよく見られます。このような変異によりPCR検査で疾患を検出できますが、Taqポリメラーゼの忠実度が比較的低いため、同じGからAへの変異が発生し、偽陽性の検査結果が出る可能性があります。^[26]

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