部位特異的変異誘発

部位特異的変異誘発は、遺伝子や遺伝子産物のDNA 配列に特定の意図的な変異を加えるために使用される分子生物学の方法である。部位特異的変異誘発またはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発とも呼ばれ、 DNA、RNA、タンパク質分子の構造と生物学的活性の調査、およびタンパク質工学に使用されます。

部位特異的変異誘発は、DNA配列に変異を導入してDNAライブラリーを作成するための最も重要な実験技術の1つです。部位特異的変異誘発を実現する方法は数多くありますが、オリゴヌクレオチド合成のコストが低下するにつれて、人工遺伝子合成が部位特異的変異誘発の代替として時々使用されるようになりました。2013年以降、原核生物のウイルス防御システムに基づくCRISPR / Cas9技術の開発により、ゲノムの編集も可能になり、変異誘発は比較的簡単に生体内で実行できるようになりました。 ^[1]

放射線や化学変異原を用いた初期の突然変異誘発の試みは非部位特異的であり、ランダムな突然変異を生成した。^[2] その後、ヌクレオチドや他の化学物質の類似体が局所的な点突然変異を生成するために使用され、^[3]このような化学物質の例には、アミノプリン、 ^[4] ニトロソグアニジン、^[5]および亜硫酸水素塩がある。^{[6]部位特異的突然変異誘発は、1974年に}チャールズ・ワイスマン の研究室で、GCからATへの転移を誘発するヌクレオチド類似体N ^{4 -ヒドロキシシチジンを使用して達成された。 [7] [8]}しかし、これらの突然変異誘発法は、達成できる突然変異の種類によって制限されており、後の部位特異的突然変異誘発法ほど特異的ではない。

1971年、クライド・ハッチソンとマーシャル・エジェルは、ファージϕX174の小さな断片と制限酵素で変異体を作り出すことが可能であることを示しました。^{[9] [10]}ハッチソンはその後、1978年に共同研究者のマイケル・スミスとともに、 DNAポリメラーゼによるプライマー伸長法でオリゴヌクレオチドを使用することで、部位特異的変異誘発に対するより柔軟なアプローチを生み出しました。 ^[11] このプロセスの開発における貢献により、マイケル・スミスは後に、ポリメラーゼ連鎖反応を発明したキャリー・B・マリスとともに、1993年10月にノーベル化学賞を受賞しました。

基本的な手順では、短い DNA プライマーの合成が必要です。この合成プライマーには目的の変異が含まれており、変異部位の周囲のテンプレート DNA と相補的であるため、目的の遺伝子の DNA とハイブリダイズできます。変異は、1 塩基の変化 (点変異)、複数塩基の変化、欠失、または挿入です。次に、一本鎖プライマーはDNA ポリメラーゼを使用して延長され、遺伝子の残りの部分がコピーされます。このようにコピーされた遺伝子には変異部位が含まれており、次にベクターで宿主細胞に導入され、クローン化されます。最後に、 DNA シーケンシングによって変異体が選択され、目的の変異が含まれているかどうかが確認されます。

単一プライマー伸長法を使用した元の方法は、変異体の収量が少ないため非効率的でした。この結果生じた混合物には、元の変異していないテンプレートと変異体鎖の両方が含まれており、変異体と非変異体の混合集団が生成されます。さらに、使用したテンプレートはメチル化されていますが、変異体鎖はメチル化されていません。また、メチル化されたテンプレート DNA を優先するミスマッチ修復システムの存在により、変異体が逆選択され、変異体の数が少なくなる場合があります。それ以来、変異誘発の効率を向上させるために多くのアプローチが開発されてきました。

部位特異的変異誘発を行うための方法は多数存在するが^[12]、新しい技術により遺伝子に部位特異的変異をより簡単に導入できるようになったため、2000年代初頭以降、それらのほとんどは研究室ではほとんど使用されていない。

1985年、トーマス・クンケルは突然変異体を選択する必要性を減らす技術を導入した。^[13]突然変異させるDNA断片をM13mp18/19などのファージミドに挿入し、 dUTPase（dut）とウラシルデグリコシダーゼ（udg ）の2つの酵素を欠損した大腸菌株に形質転換する。両酵素は、dCTPからdUTPへの自発的な脱アミノ化によって細菌染色体を突然変異から保護するDNA修復経路の一部である。dUTPase欠損はdUTPの分解を防ぎ、細胞内のdUTPレベルを高くする。ウラシルデグリコシダーゼ欠損は、新しく合成されたDNAからウラシルを除去できないようにする。二重変異体E. coli がファージ DNA を複製すると、酵素機構が dTTP の代わりに dUTP を誤って取り込み、一部のウラシルを含む一本鎖 DNA (ssUDNA) が生成されます。ssUDNA は、培地に放出されたバクテリオファージから抽出され、変異誘発のテンプレートとして使用されます。目的の変異を含むオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長に使用されます。形成されるヘテロ二本鎖 DNA は、dUTP を含む 1 つの親の非変異鎖と dTTP を含む変異鎖で構成されます。次に、DNA は、野生型のdutおよびudg遺伝子を持つE. coli株に変換されます。ここで、ウラシルを含む親 DNA 鎖は分解されるため、結果として得られる DNA のほぼすべてが変異鎖で構成されます。

他の方法とは異なり、カセット突然変異誘発では、DNAポリメラーゼを使用したプライマー伸長は必要ありません。この方法では、DNAの断片が合成され、その後プラスミドに挿入されます。^[14]この方法では、プラスミド内の部位での制限酵素による切断と、続いてプラスミドへの目的遺伝子の突然変異を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドの連結が行われます。通常、プラスミドとオリゴヌクレオチドを切断する制限酵素は同じであるため、プラスミドと挿入物の粘着末端が互いに連結されます。この方法では、ほぼ100%の効率で突然変異体を生成できますが、突然変異させる部位の両側に適切な制限部位があるかどうかによって制限されます。

カセット突然変異誘発における制限部位の制限は、オリゴヌクレオチド「プライマー」を用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用することで克服でき、2 つの都合のよい制限部位をカバーするより大きな断片を生成できます。PCR の指数関数的増幅により、ゲル電気泳動によって元の変異していないプラスミドから分離できるほど十分な量の目的の変異を含む断片が生成され、その後、標準的な組み換え分子生物学技術を使用して元のコンテキストに挿入できます。同じ技術には多くのバリエーションがあります。最も簡単な方法は、断片の一方の端に変異部位を配置し、断片の生成に使用される 2 つのオリゴヌクレオチドの 1 つに変異が含まれるようにします。これには PCR のステップが 1 つ含まれますが、非常に長いプライマーを使用しない限り、変異部位の近くに適切な制限部位が必要になるという固有の問題が依然として残ります。そのため、他のバリエーションでは、3つまたは4つのオリゴヌクレオチドを使用します。そのうちの2つは、2つの便利な制限部位をカバーする非変異原性オリゴヌクレオチドであり、消化されてプラスミドに連結できるフラグメントを生成しますが、変異原性オリゴヌクレオチドは、便利な制限部位から遠く離れたフラグメント内の位置に相補的である可能性があります。これらの方法では、連結される最終フラグメントに目的の変異を含めることができるように、複数のPCRステップが必要です。目的の変異と関連する制限部位を持つフラグメントを生成するための設計プロセスは面倒な場合があります。SDM-Assist ^[15]などのソフトウェアツールを使用すると、プロセスが簡素化されます。

プラスミド操作については、他の部位特異的変異誘発技術は、効率は高いが比較的単純で使いやすく、キットとして市販されている技術に大きく取って代わられてきた。これらの技術の一例は「クイックチェンジ」法である^[16]。この方法では、一対の相補的変異誘発プライマーを使用して、Pfuポリメラーゼなどの高忠実度の非鎖置換DNAポリメラーゼを使用した熱サイクル反応でプラスミド全体を増幅する。この反応により、切れ目のある環状DNAが生成される。テンプレートDNAは、メチル化DNAに特異的なDpn Iなどの制限酵素による酵素消化によって除去する必要がある。ほとんどの大腸菌株から生成されるDNAはすべてメチル化されるため、大腸菌で生合成されるテンプレートプラスミドは消化されるが、試験管内で生成されるためメチル化されていない変異プラスミドは消化されないままとなる。これらの二本鎖プラスミド変異誘発法では、熱サイクル反応が使用される場合があるものの、元のプロトコルに記載されているように、2 つのプライマーが変異誘発部位の周囲の同じ領域に対称的に結合するように設計されている場合、DNA は指数関数的に増幅されないことに注意してください。 この場合、増幅は線形であり、連鎖反応がないため、手順を PCR として説明することは正確ではありません。 ただし、プライマーがオフセット方式で結合するように設計されている場合、つまり変異誘発部位が両方のプライマーの 5' 末端に近くなる場合、プライマーの 3' 領域も増幅産物に結合することができ、指数関数的な産物形成が観察されます。 「Quikchange」という名前は、Stratagene (現在はAgilent Technologies)の、部位特異的変異誘発キットの登録商標「QuikChange mutagenesis」に由来しています。 この方法は、Stratagene で働く科学者によって開発されました。^[16]

Pfuポリメラーゼは、より高い伸長温度（≥70 °C）では鎖置換を起こし、実験が失敗する可能性があるので注意が必要です。そのため、伸長反応は推奨温度である68 °Cで実行する必要があります。一部のアプリケーションでは、この方法によりプライマーの複数のコピーが挿入されることが観察されています。 ^[17]この方法のバリエーションであるSPRINPは、このアーティファクトを防ぎ、さまざまな種類の部位特異的突然変異誘発に使用されています。^[17]

オリゴ標的の走査変異誘発（SMOOT）などの他の技術では、プラスミド変異誘発において変異原性オリゴヌクレオチドを半ランダムに組み合わせることができる。^[18]この技術は、単一の変異から遺伝子全体にわたる包括的なコドン変異まで、プラスミド変異誘発ライブラリを作成することができる。

• 完璧^[19]
• トランスプレースメント「ポップイン ポップアウト」
• PCRとリサイクル可能なマーカー1つによる直接的な遺伝子削除と部位特異的変異誘発
• PCRと1つのリサイクル可能なマーカーを用いた長い相同領域を使用した直接的な遺伝子削除と部位特異的変異誘発
• 合成オリゴヌクレオチドを用いた生体内部位特異的変異誘発^[20]

2013年以降、 CRISPR -Cas9技術の開発により、多種多様な生物のゲノムにさまざまな変異を効率的に導入することが可能になりました。この方法は、トランスポゾン挿入部位を必要とせず、マーカーを残さず、その効率性とシンプルさから、ゲノム編集の好ましい方法となっています。^{[21] [22]}

部位特異的突然変異誘発は、改善された特性または特別な特性（すなわち、タンパク質工学）を持つ 合理的に設計されたタンパク質を生成する可能性のある突然変異を生成するために使用されます。

調査ツール– DNA の特定の変異により、DNA 配列またはタンパク質の機能と特性を合理的なアプローチで調査できます。さらに、タンパク質の部位特異的変異誘発による単一アミノ酸の変更は、翻訳後修飾の重要性を理解するのに役立ちます。たとえば、基質タンパク質の特定のセリン (リン酸受容体) をアラニン (リン酸非受容体) に変更すると、リン酸基の付加がブロックされ、リン酸化を調査できるようになります。このアプローチは、キナーゼHIPK2によるタンパク質CBPのリン酸化を明らかにするために使用されています^[23]もう 1 つの包括的なアプローチは、特定の位置で1 つのコドンまたはコドンのセットをすべての可能なアミノ酸に置換する部位飽和変異誘発です。^[24]

商業的応用– タンパク質は、特定の用途に合わせて調整された変異体を生成するように設計される場合があります。たとえば、一般的に使用されている洗濯用洗剤にはサブチリシンが含まれている場合がありますが、その野生型には漂白剤によって酸化されるメチオニンがあり、その過程でタンパク質の活性が大幅に低下します。^[25]このメチオニンはアラニンまたは他の残基に置き換えられ、酸化に耐性を持たせることで、漂白剤の存在下でもタンパク質を活性に保つことができます。^[26]

DNAオリゴヌクレオチド合成のコストが下がるにつれて、完全な遺伝子の人工合成は遺伝子に突然変異を導入するための現実的な方法になりました。この方法は、遺伝子のコドン使用を完全に再設計して特定の生物に最適化するなど、複数の部位にわたる広範な突然変異誘発を可能にします。^[27]

• 誘導突然変異誘発
• ファイ値分析

• 部位特異的変異誘発の発明に関するノーベル賞講演
• オープンウェットウェア
• 部位特異的変異誘発をまとめた図