マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅法 （MLPA ）は、単一の プライマー ペアのみで複数の標的を増幅できるマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応 の変法です。 [ 1 ]
歴史 多重連結依存性プローブ増幅法は、 オランダの科学者ヤン・ショウテン によって発明されました。[ 1 ] 「Nucleic Acid Research」 で初めて発表されました。[ 2 ] BRCA1 、MSH2 、MLH1 のエキソン欠失の検出がありました。現在、MLPAは数百の遺伝性疾患の検出や腫瘍プロファイリングに使用されています。
説明 デュシェンヌ型筋ジストロフィー 患者において多重連結依存性プローブ増幅法によって検出されたエクソン 欠失の例MLPAは、対象となる各標的配列ごとに特別に設計されたプローブペアを使用して、DNAサンプル中の特定の配列の存在を定量化します。このプロセスは複数のステップから構成されています。[ 3 ]
サンプルDNAは変性され 、一本鎖のサンプルDNAとなる。 プローブのペアがサンプルDNAにハイブリダイズさ れ、各プローブペアは特定のDNA配列の存在を検出するように設計されている。 ハイブリダイズしたDNAにリガーゼを 作用させることで、互いに隣接してハイブリダイズしたプローブペアを結合させ、PCRによって増幅可能な一本鎖DNAを合成する。PCRは 、蛍光標識されたPCRプライマーを用いて、正常に連結されたすべてのプローブペアを増幅する。PCR産物は、通常、（キャピラリー）電気泳動 によって定量される。 各プローブペアは、標的DNA の隣接部位を認識する配列、PCRプライミング部位、およびオプションでMLPAアッセイ内の他のプローブペアと比較してPCR産物に固有の長さを与える「スタッファー」を含む2つのオリゴヌクレオチドから構成されます。各プローブペアは固有の長さを持つ必要があり、その結果生じる増幅産物を定量中に一意に識別できるようにすることで、 マルチプレックスPCR の解像度制限を回避します。プローブ増幅に使用されるフォワードプライマーは蛍光 標識されているため、各増幅産物はキャピラリーシーケンサーで検出可能な蛍光ピークを生成します。特定のサンプルで得られたピークパターンをさまざまな参照サンプルで得られたピークパターンと比較することで、各増幅産物の相対量を決定できます。この比率は、サンプルDNA中に標的配列が存在する割合の尺度となります。
DGGE（変性勾配ゲル電気泳動 ）、DHPLC（変性高速液体クロマトグラフィー ）、SSCA（一本鎖コンフォメーション解析）など、さまざまな手法は、SNPや小さな挿入・欠失を効果的に検出します。しかし、MLPAは、遺伝性非ポリポーシス大腸がん（HNPCC ） 、乳がん、卵巣がんなどのがんの頻繁な原因となるゲノム欠失や挿入（1つ以上のエクソン全体）を検出するための、正確かつ時間効率の良い数少ない手法の1つです。MLPAは、遺伝子内のすべてのエクソンの相対コピー数を高感度で同時に、かつ容易に決定することができます。
相対倍数性 MLPAの重要な用途の一つは、相対的な倍数性 を決定することです。例えば、ヒト細胞の21番染色体 の様々な領域を標的とするプローブを設計することができます。プローブのシグナル強度は、染色体が2コピーあることが分かっている参照DNAサンプルから得られたシグナル強度と比較されます。検査サンプルに余分なコピーが存在する場合、シグナル強度は参照サンプルのそれぞれのプローブの強度の1.5倍になると予想されます。コピーが1つしかない場合は、その比率は0.5になると予想されます。サンプルにコピーが2つある場合は、相対的なプローブ強度は等しくなると予想されます。
投与量比分析 用量比分析は、MLPA データの解釈によく用いられる方法です。[ 4 ]
バリエーション
MS-MLPA メチル化特異的MLPA（MS-MLPA）は、標準的なMLPAとメチル化感受性制限酵素消化を組み合わせたもので、同じアッセイで標的コピー数とCpGメチル化を評価できます。[ 16 ] [ 7 ]
iMLPA MLPAとiMLPAの違い Giner-Delgado、Carlaらは、MLPAとiPCRを組み合わせた変異法について報告した。彼らはこの新しい方法をiMLPA [ 15 ]
まず、目的領域の両側を切断する制限酵素を用いたDNA処理が必要である。 消化によって得られた断片は再環状化され、連結される。 プローブの設計は非常に似ています。各プローブは少なくとも2つの部分から構成されます。1つはターゲット配列で 、これは目的領域に相補的な配列を含む領域であり、正しいハイブリダイゼーションが起こるようにします。もう1つはプライマー配列 で、これは設計が変化する配列であり、プライマーの設計とそれに続く断片増幅を可能にします。さらに、プローブの一方の部分には、通常、ターゲット配列とプライマー配列の間にスタッファーが 含まれています。異なるスタッファーを使用することで、同じプライマー配列でも異なるターゲット配列を持つプローブを識別できます。これは、1回の反応で複数の異なる断片を増幅する上で重要です。
次のステップは、通常のMLPAプロトコルに従って続行します。[ 1 ]
参考文献 1 2 3 Schouten JP、McElgunn CJ、Waaijer R、Zwijnenburg D、Diepvens F、Pals G (2002)。「 多重連結依存性プローブ増幅法による40種類の 核酸配列の相対定量」。Nucleic Acids Res。30 ( 12): 57e – 57。doi : 10.1093/nar/ gnf056。PMC 117299。PMID 12060695 。 ↑ Schouten JP、McElgunn CJ、Waaijer R、Zwijnenburg D、Diepvens F、Pals G (2002-06-15)。 「多重連結依存性プローブ増幅 法 による40種類 の 核酸配列の相対定量」 。Nucleic Acids Research。30 ( 12 ): e57。doi : 10.1093 /nar/ gnf056。ISSN 0305-1048。PMC 117299。PMID 12060695 。 ↑ 「多重連結依存性プローブ増幅法（MLPA）」 。 Bitesize Bio 。2018年12月27日。 2021年6月7日 取得 。 ↑ Yau SC、Bobrow M、Mathew CG、Abbs SJ (1996)。 「蛍光線量分析によるデュシェンヌ型/ベッカー型筋ジストロフィーの欠失および重複保因者の正確な診断」 。J . Med. Genet . 33 (7): 550– 558. doi : 10.1136/jmg.33.7.550 . PMC 1050661 . PMID 8818939 . ↑ MLPA関連の記事一覧（2007年2月20日時点の Wayback Machine アーカイブ） ↑ Volikos E, Robinson J, Aittomaki K, Mecklin JP, Jarvinen H, Westerman AM, de Rooji FW, Vogel T, Moeslein G, Launonen V, Tomlinson IP, Silver AR, Aaltonen LA (2006). "LKB1エクソンおよび全遺伝子欠失はPeutz-Jeghers症候群の一般的な原因である" . J. Med. Genet . 43 (5): e18. doi : 10.1136/jmg.2005.039875 . PMC 2564523 . PMID 16648371 . 1 2 Procter M、Chou LS、Tang W、Jama M、Mao R (2006)。 「メチル化特異的融解分析およびメチル化特異的多重連結依存性プローブ増幅によるプラダー・ウィリー症候群およびアンジェルマン症候群の分子診断」 (PDF) . Clin. Chem . 52 (7): 1276– 1283. doi : 10.1373/clinchem.2006.067603 . PMID 16690734 . ↑ Wehner M、Mangold E、Sengteller M、Friedrichs N、Aretz S、Friedl W、Propping P、Pagenstecher C (2005)。 「遺伝性非ポリポーシス大腸癌：MSH2およびMLH1遺伝子の欠失スクリーニングにおける落とし穴」 。Eur . J. Hum. Genet . 13 (8): 983–986 . doi : 10.1038/sj.ejhg.5201421 . PMID 15870828 。 ↑ ウィルティング SM、スナイデルス PJ、マイヤー GA、イルストラ B、ヴァン デン アイセル PR、スナイデルス AM、アルバートソン DG、コファ J、スハウテン JP、ファン デ ヴィール MA、マイヤー CJ、スティーンバーゲン RD (2006)。 「染色体 20q での遺伝子コピー数の増加は、子宮頸部の扁平上皮癌と腺癌の両方で頻繁に見られます。」 J.パソール 。 209 (2): 220–230 . doi : 10.1002/path.1966 。 PMID 16538612 。 S2CID 25427077 。 ↑ MLPA入門 ↑ Bunyan DJ、Eccles DM、Sillibourne J、Wilkins E、Thomas NS、Shea-Simonds J、Duncan PJ、Curtis CE、Robinson DO、Harvey JF、Cross NC (2004)。 「多重連結依存性プローブ 増幅 法 による癌素因遺伝子の用量分析」 。Br . J. Cancer。91 ( 6 ) : 1155–1159。doi : 10.1038/ sj.bjc.6602121。PMC 2747696。PMID 15475941 。 ↑ Gerdes T、Kirchhoff M、Lind AM、Larsen GV、Schwartz M、Lundsteen C (2005)。 「多重連結依存性プローブ増幅法（MLPA）に基づく、13番、18番、21番、X、Y染色体のコンピューター支援による出生前異数性スクリーニング」。Eur . J. Hum. Genet . 13 (2): 171– 175. doi : 10.1038/sj.ejhg.5201307 . PMID 15483643 。 ↑ ホックステンバッハ R、マイヤー J、ファン デ ブルッグ J、フォスベルト ホフ I、ヤンセン R、ファン デル ルイット RB、シンケ RJ、ペイジ クリスティアン GC、プロス ファン アムステル JK、デ ペーター JM (2005)。 「マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅 (MLPA) による未培養羊膜細胞の染色体異数性の迅速検出」。 プレナト。診断します 。 25 (11): 1032–1039. doi : 10.1002/pd.1247 . PMID 16231311 . S2CID 23214645 . ↑ Illanes S、Avent N、Soothill PW (2005)。 「母体血漿中の無細胞胎児DNA：胎児遺伝学と産科超音波を結びつける重要な進歩」 。Ultrasound Obstet. Gynecol . 25 (4): 317– 322. doi : 10.1002/uog.1881 . PMID 15789415 。 1 2 ジネル・デルガド、C.、ヴィラトロ、S.、レルガ・ジャソ、J.、ゲイ・ビダル、M.、オリバ、M.、カステラーノ、D.、... & オラルデ、I. (2019)。ヒトゲノムにおける一般的な多型逆位の進化的および機能的影響。ネイチャーコミュニケーションズ 、 10 (1)、1-14。 https://doi.org/10.1038/s41467-019-12173-x ↑ Nygren AO、Ameziane N、Duarte HM、Vijzelaar RN、Waisfisz Q、Hess CJ、Schouten JP、Errami A (2005)。 「 メチル化特異的MLPA（MS-MLPA）：最大40配列のCpGメチル化とコピー数変化の同時検出」 。Nucleic Acids Res。33 （ 14 ） ： e128。doi ： 10.1093/nar / gni127。PMC 1185609。PMID 16093568 。 
