ヘリカーゼ依存性増幅

ヘリカーゼ依存性増幅(HDA) は、一定温度で行われる in vitro DNA増幅 (ポリメラーゼ連鎖反応など)の方法です。

ポリメラーゼ連鎖反応は、分子生物学および生物医学研究の目的で、in vitro DNA増幅に最も広く使用されている方法です。 ^[1] このプロセスには、高温で二本鎖DNAを一本鎖に分離し（変性ステップ、通常は95～97℃で達成）、プライマーを一本鎖DNAにアニーリングし（アニーリングステップ）、一本鎖をコピーして新しい二本鎖DNAを作成する（DNAポリメラーゼを必要とする伸長ステップ）というプロセスがあり、この反応はサーマルサイクラーで行う必要があります。これらのベンチトップマシンは大きく、高価で、稼働と維持にコストがかかるため、研究室外の状況（捜査現場や患者のケアの現場で潜在的に危険な微生物を特定する場合など）でのDNA増幅の潜在的な用途が制限されます。PCRは通常、サーマルサイクリングと関連付けられますが、Mullisらによる元の特許は、PCRを熱サイクルと関連付けるものではないという結論に達しました。^[2]は、二本鎖DNAの変性手段としてヘリカーゼを使用することを明らかにし、それによって等温核酸増幅が含まれるようになりました。 生体内では、DNAはDNAポリメラーゼによってさまざまな補助タンパク質とともに複製されますが、その中にはDNA二重らせんをほどいてDNAを分離する働きをするDNAヘリカーゼも含まれます。^{[3] HDAはこの概念から開発され、}ヘリカーゼ（酵素） を使用してDNAを変性させます。

二本鎖 DNA の鎖は、まず DNA ヘリカーゼによって分離され、一本鎖 DNA (ssDNA) 結合タンパク質によってコーティングされます。第 2 段階では、2 つの配列特異的プライマーが DNA テンプレートの各境界にハイブリダイズします。次に、DNA ポリメラーゼを使用して、テンプレートにアニールされたプライマーを延長して二本鎖 DNA を生成します。次に、新しく合成された 2 つの DNA 産物が DNA ヘリカーゼの基質として使用され、次の反応ラウンドに入ります。このようにして、同時連鎖反応が発生し、選択されたターゲット配列が指数関数的に増幅されます (模式図については、Vincentら、2004 ^[4]を参照)。

HDA 技術は、その発見が発表されて以来、「クロストリディオイデスディフィシルの検出のためのシンプルで適応しやすい核酸検査」に使用されています。^[5] その他の用途には、細菌に特有の短い DNA 配列の増幅と検出による黄色ブドウ球菌の迅速な検出があります。 ^[6] HDA の利点は、サーマル サイクラーを必要としない等温で特定のターゲットの核酸増幅を迅速に行うことができることです。ただし、プライマーと場合によってはバッファーの最適化が事前に研究者によって必要になります。通常、プライマーとバッファーの最適化は PCR によってテストおよび達成されるため、実際の増幅を行うために別のシステムに余分な費用をかける必要があるという疑問が生じます。HDA はサーマル サイクラーの使用を不要にし、そのため現場で研究を行うことができるというセールス ポイントがあるにもかかわらず、潜在的に危険な微生物の検出に必要な作業の多くは、研究室や病院の実験室で行われています。現時点では、HDA では大量のサンプルからの大量診断はまだ実現できませんが、マルチウェル サンプル プレートを収容できるサーマル サイクラーで実行される PCR 反応では、最大 96 個のサンプルから目的の DNA ターゲットを増幅および検出できます。HDA の試薬の購入コストも PCR 試薬に比べて比較的高価であり、既製のキットとして提供されるため、さらに高価です。

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