ループ媒介等温増幅

ループ介在等温増幅（LAMP ）は、診断目的および特定の疾患を検出するための低コストの代替手段としてのDNA増幅のためのシングルチューブ技術^{[2]です。 [3]} LAMPは等温核酸増幅技術です。反応が一連の交互温度ステップまたはサイクルで実行されるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術とは対照的に、等温増幅は一定温度で実行され、サーマルサイクラーを必要としません。LAMPは、1998年に東京の栄研化学株式会社によって発明されました。 ^[1] 逆転写ループ介在等温増幅（RT-LAMP）は、LAMPと逆転写ステップを組み合わせてRNAの検出を可能にします。

LAMP 法では、2 セットまたは 3 セットのプライマーと、複製活性に加えて高い鎖置換活性を持つBst Klenow フラグメントなどのポリメラーゼを使用して、ターゲット シーケンスを 60～65 °C (140～149 °F)の一定温度で増幅します。通常、4 つの異なるプライマーを使用してターゲット遺伝子の 6 つの異なる領域を増幅し、特異性を高めます。追加の「ループ プライマー」ペアを使用すると、反応をさらに加速できます。^{[4] LAMP で生成される DNA の量は、} PCRベースの増幅よりもかなり多くなります。^{[1]プライマー設計は、PrimerExplorer、MorphoCatcher、 [5]}、NEB LAMP Primer Design Toolなどのいくつかのプログラムを使用して実行できます。保存的および種特異的なヌクレオチド多型のスクリーニングでは、ほとんどの診断アプリケーションにおいて、PrimerExplorer と MorphoCatcher の組み合わせが非常に有用です。これは、プライマーの 3' 末端に種特異的なヌクレオチドを局在化して、反応の特異性を高めることができるためです。

増幅産物は、増幅の副産物として溶液中に沈殿するピロリン酸マグネシウムによる濁度を測定する測光法によって検出することができる。 ^{[7]これにより、肉眼で簡単に視覚化できるほか、少量の場合は簡単な測光検出法で検出できる。反応は、濁度を測定するか[8]}、SYTO 9などの挿入色素を使用して蛍光を測定することでリアルタイムで追跡することができる。^[9]

SYBRグリーンなどの染料は、高価な装置を必要とせずに肉眼で確認できる色の変化を作り出したり、機器によってより正確に測定できる反応を生じさせたりするために使用できます。染料分子はDNAに挿入または直接標識し、最初に存在するコピーの数と相関させることができます。したがって、LAMP法は定量的でもあります。LAMP法によるDNA増幅のチューブ内検出は、マンガンを負荷したカルセインを使用することで可能であり、これはin vitro DNA合成中にピロリン酸によるマンガンとの錯形成時に蛍光を発し始めます。^[10] LAMP増幅産物を肉眼で視覚的に検出する別の方法は、相補的な金ナノ粒子結合（AuNP）一本鎖DNA（ssDNA）とハイブリダイズする能力に基づいており、これにより、塩によって引き起こされる金粒子の凝集中に通常起こる赤から紫がかった青への色の変化を防ぐことができます。そのため、AuNPによるアンプリコン検出と組み合わせたLAMP法は、アッセイ時間の短縮、ハイブリダイゼーションによるアンプリコンの確認、よりシンプルな装置の使用（サーモサイクラー、電気泳動装置、UVトランスイルミネーターが不要）の点で他の方法よりも利点があります。^{[11] [12]}

フェノールレッドなどのpH依存性色素指示薬は、DNA増幅時に反応のpH値が下がると、ピンクから黄色への色の変化を引き起こします。^[13]色の変化が顕著なため、これはRT-LAMPアッセイで最も一般的に使用される読み取り方法です。^[13]しかし、pH変化依存性の読み取りには弱緩衝反応溶液が必要であり、pHが変化する粗サンプル入力を使用する場合に大きな課題があります。^{[13] 2番目の比色アッセイでは、}ヒドロキシナフトールブルー（HNB）などの金属イオン指示薬を使用します。これは、DNA増幅時にMg-ピロリン酸沈殿物を形成する遊離Mg ²⁺イオンの滴下で紫から青に色が変わります。^[13]

LAMP法は比較的新しいDNA増幅技術であり、そのシンプルさ、堅牢性、低コストにより大きな利点をもたらす可能性があります。LAMP法は、現場や臨床現場で臨床医が簡単なスクリーニング検査として使用できる可能性があります。^[14] LAMP法は等温であるため、従来のPCRで使用される高価なサーモサイクラーが不要になり、低所得国や中所得国での感染症診断に特に有用な方法となる可能性があります。^[15] LAMP法は、フィラリア症、^[16]ジカウイルス、^[17]結核、^[18]マラリア、^{[19] [20] [21]}睡眠病、^[22] SARS-CoV-2などの感染症の検出に広く研究されています。^{[23] [24]}発展途上地域では、他の一般的な病原体についてはまだ広範囲に検証されていません。^[14]

LAMP法は、血液などの複雑なサンプルではPCRよりも阻害剤に対する感度が低い（耐性が高い）ことが観察されていますが、これはおそらく異なるDNAポリメラーゼ（ PCRのTaqポリメラーゼではなく、通常はBst（バチルス・ステアロサーモフィルス）DNAポリメラーゼ）を使用しているためです。いくつかの報告では、熱処理された血液などの最小限の処理を受けたサンプルから、または臨床サンプルマトリックスが存在する場合でも、病原体の検出に成功したと報告されています。^{[25] [ 26]} LAMP法のこの特徴は、診断検査の前に従来のDNAまたはRNA抽出を行うことが不可能な、リソースが限られている環境や現場での環境で役立つ可能性があります。

LAMP法は体液の識別にも役立っています。そのシンプルさにより、研究者は1つまたは複数のサンプルをほとんど手間をかけずに検査することができ、結果を得るのに必要な時間を短縮するのに役立っています。研究者は、金属指示薬染料やフェノールレッドなどの要素を追加することで、識別をさらに簡単にし、スマートフォンと肉眼で結果を分析できるようにしました。^{[28] [29] [30]}

LAMP は、最も確立された核酸増幅技術である PCR ほど汎用性がありません。LAMP は主に診断または検出技術として役立ちますが、PCR によって可能になるクローニングやその他の多くの分子生物学アプリケーションには役立ちません。LAMP では、ゲノムのかなり小さなセグメント内の 6 (または 8) の領域をターゲットとする 4 (または 6) のプライマーを使用し、プライマー設計には多くの制約があるため、LAMP のプライマー セットを「目視」で設計することは困難です。LAMP プライマー設計を支援するために、一般に無料のオープン ソース^[31] または市販のソフトウェア パッケージが使用されますが、プライマー設計の制約により、PCR よりもターゲット サイトを選択する自由度が低くなります。

診断用途では、適切なターゲット（例えば、非常に可変性の高いウイルスゲノム内の保存された部位、または特定の病原体株に固有のターゲット）を選択する必要性とバランスをとる必要があります。同じ種の異なる変異株をカバーするには、複数の縮重配列が必要になる場合があります。このようなプライマーのカクテルを使用すると、後期増幅で非特異的増幅が発生する可能性があります。^{[引用が必要]}

LAMP のマルチプレックス化アプローチは、PCR ほど発達していません。LAMP ではターゲットあたりのプライマーの数が多いため、マルチプレックス化されたターゲット セットでプライマー間の相互作用が発生する可能性が高くなります。LAMP の産物はターゲット領域の一連のコンカテマーであり、PCR のように単一のバンドではなく、ゲル上に特徴的な「ラダー」またはバンド パターンを生成します。これは、LAMP で単一のターゲットを検出する場合には問題になりませんが、ターゲットの ID がゲル上のバンドのサイズによって確認される「従来の」(エンドポイント) マルチプレックス PCR アプリケーションは、LAMP では実行できません。LAMP でのマルチプレックス化は、制限部位を持つターゲット領域を選択し、ゲルで実行する前に消化することで実現され、各産物がそれぞれ異なるサイズのフラグメントを生成しますが、^[32]このアプローチは、実験設計とプロトコルを複雑にします。

LAMP法では鎖置換DNAポリメラーゼを使用するため、Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性に依存するTaqManプローブなどの加水分解プローブも使用できません。蛍光消光剤に基づく代替リアルタイムマルチプレックス化アプローチが報告されています。^[33]

SYBRグリーン色素を加えると、LAMPをリアルタイムで観察することができます。しかし、後期増幅では、プライマーダイマー増幅が偽陽性シグナルに寄与する可能性があります。SYBR反応混合物に無機ピロホスファターゼを使用すると、正しい増幅を区別するために融解分析を使用することができます^[34]

この方法に基づくアッセイにおける偽陽性結果に対してはさまざまな軽減戦略が提案されているが、温度ゲーティング機構の欠如を含むさまざまな要因による非特異的増幅は、ループ介在等温増幅の主な制限の1つである。^{[35] [36]}

最後に、LAMP 法では、維持された高温の培養温度 (60～65 °C) が必要なため、何らかの加熱機構、サーモスタット、絶縁体 (必ずしもサーマル サイクラーである必要はありません) が必要になります。この要件により、LAMP 法は、理想的には常温で機能する現場でのポイント オブ ケア診断にはあまり適していません。^[要出典]

RNaseハイブリダイゼーションアシスト増幅（RHAM）は、LAMPとRNase HIIを介した蛍光報告を統合する。この方法では、従来のLAMPプライマーセットを使用して標的配列を指数関数的に増幅し、続いてリボヌクレオチドを含む蛍光プローブを増幅産物にハイブリダイズさせる。その後、RNase HIIがプローブを切断し、検出可能な蛍光信号を放出する。^{[37] [38]}