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遺伝学において、相補的DNA（cDNA）とは、RNA（例えば、メッセンジャーRNAやマイクロRNA ）から逆転写酵素によって逆転写されたDNAのことである。cDNAは一本鎖と二本鎖の両方の形態で存在し、天然の形態と人工の形態の両方が存在する。
人工的に作られたcDNAは、多くの場合、特定の生物の自然ゲノム由来の天然DNAのコピー（複製）です。生物自身のmRNAは、そのDNAから自然に転写され、cDNAはmRNAから逆転写されて、元のDNAの複製が作られます。人工cDNAは、通常そのタンパク質を発現しない細胞で特定のタンパク質を発現させるため（異種発現）、またはDNAベースの方法（qPCR、RNA-seq）を使用してmRNA分子をシーケンスまたは定量するためによく使用されます。特定のタンパク質をコードするcDNAは、組換えDNAの一部として、多くの場合細菌または酵母の発現システムとして、受容細胞に導入して発現させることができます。[ 1 ] cDNAはまた、マイクロアレイ、qPCR、 RNA -seqなどのアッセイで、バルク組織、単一細胞、または単一核のトランスクリプトームプロファイルを分析するためにも生成されます。
自然界では、cDNAはレトロウイルス（HIV-1、HIV-2、サル免疫不全ウイルスなど）によって生成され、宿主のゲノムに組み込まれてプロウイルスを形成する。[ 2 ]
cDNAという用語は、特にバイオインフォマティクスの分野では、mRNA転写産物の配列を指す場合にも使用され、RNA塩基（GCAU）ではなくDNA塩基（デオキシGCAT）として表現されます。
cDNAの特許性については、2013年の米国最高裁判所のAssociation for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, Inc.事件の判決で争点となった。最高裁は妥協案として、エクソンのみからなるcDNAは特許適格である一方、イントロンを含む天然由来のDNAの単離配列は特許適格ではないと宣言した。
RNAはcDNA合成の鋳型として機能します。[ 3 ]細胞生活では、cDNAはウイルスやレトロトランスポゾンによって生成され、RNAを標的ゲノムDNAに組み込むために使用されます。分子生物学では、ゲノムDNA、タンパク質、その他の細胞成分を除去した後、原料からRNAを精製します。その後、試験管内逆転写によってcDNAが合成されます。[ 4 ]
RNAは宿主細胞のゲノムDNAから転写され、まず細胞を溶解し、フェノールクロロホルム、シリカカラム、ビーズベースのRNA抽出法などの広く用いられている方法を用いてRNAを精製することによって抽出されます。[ 5 ]抽出方法は原料によって異なります。例えば、植物組織からRNAを抽出するには、ポリビニルピロリドン（PVP）などの試薬を追加して、フェノール化合物、炭水化物、およびRNAを不使用にするその他の化合物を除去する必要があります。[ 6 ] DNAとタンパク質を除去するために、DNaseやプロテイナーゼKなどの酵素が分解に使用されます。[ 7 ]重要なのは、グアニジンイソチオシアネート、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、フェノール、またはクロロホルムなどのカオトロピック剤でRNaseを不活性化することにより、RNAの完全性が維持されることです。その後、全RNAは他の細胞成分から分離され、アルコールで沈殿されます。特定の用途向けに、簡単かつ迅速なRNA抽出のための市販キットが数多く存在します。[ 8 ]サイズや固有のRNA領域に基づいて、特定のサブタイプのRNA（例えばmRNAやマイクロRNA ）を分離するために、ビーズベースの追加的な方法を使用できます。 [ 9 ] [ 10 ]
逆転写酵素と精製されたRNAテンプレートを使用して、cDNAの1本鎖が生成されます（第一鎖cDNA合成）。モロニーマウス白血病ウイルス由来のM-MLV逆転写酵素は、RNase H活性が低く、より長いRNAの転写に適しているため、一般的に使用されています。[ 11 ]鳥類骨髄芽球症ウイルス由来のAMV逆転写酵素も、強い二次構造（つまり、高い融解温度）を持つRNAテンプレートに使用できます。[ 12 ] cDNAは、 RT-qPCRやRNA-seqなどの遺伝子発現解析のために、mRNAから一般的に生成されます。[ 13 ] mRNAは、すべてのmRNAの3'末端のポリAテールの逆相補鎖であるオリゴdTプライマーを使用して選択的に逆転写されます。オリゴdTプライマーは、mRNAのポリAテールにアニーリングして、逆転写酵素が逆転写を開始するための結合部位として機能します。オリゴdTプライマーとランダムヘキサマープライマーの最適化された混合物は、5'または3'バイアスを低減しながら、全長cDNAを得る可能性を高めます。[ 14 ]リボソームRNAは、mRNAと非ポリA付加転写産物（一部の非コードRNAなど）の両方を濃縮するために除去することもできます。[ 15 ]
第一鎖合成の結果であるRNA-DNAハイブリッドは、複数の第二鎖合成法で処理するか、下流のアッセイで直接処理することができます。[ 16 ] [ 17 ]ヘアピンプライミング合成として知られる初期の方法は、第一鎖cDNAの3'末端でのヘアピン形成を利用して第二鎖合成をプライミングしていました。しかし、プライミングはランダムであり、ヘアピン加水分解により情報が失われます。GublerとHoffman法では、E. coli RNase Hを使用してmRNAをニックし、E. coli DNAポリメラーゼIで置き換え、E. coli DNAリガーゼでシールします。この手順の最適化では、M-MLVの低いRNase H活性を利用してmRNAをニックし、残ったRNAは、第二鎖cDNAのDNAポリメラーゼ翻訳後にRNase Hを追加することで除去します。これにより、mRNAの5'末端での配列情報の損失を防ぎます。
相補的DNAは、遺伝子クローニングや遺伝子プローブ、 cDNAライブラリーの作成などによく用いられます。科学者が、ある細胞から別の細胞へ遺伝子を移し、受容細胞で新しい遺伝物質をタンパク質として発現させる場合、受容細胞には（遺伝子全体ではなく）cDNAが加えられます。これは、遺伝子全体のDNAには、タンパク質をコードしないDNAや、タンパク質のコード配列を中断するDNA（例えばイントロン）が含まれている可能性があるためです。cDNAの部分配列は、発現配列タグ（EST ）として得られることがよくあります。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNA配列の増幅が一般的になった現在では、通常、最初のステップとして逆転写を行い、続いてPCRを行い、細胞内発現のための正確なcDNA配列を取得します。これは、タンパク質をコードするcDNA領域の5'末端と3'末端にハイブリダイズする配列特異的なDNAプライマーを設計することによって実現されます。増幅された配列は、ヌクレアーゼで両端を切断し、発現ベクターと呼ばれる多数の小さな環状DNA配列のいずれかに挿入することができます。このようなベクターは、細胞内で自己複製し、宿主DNAに組み込まれる可能性があります。また、通常、標的cDNAをmRNAに転写し、それがタンパク質に翻訳される強力なプロモーターも含まれています。
cDNAは、RNA-seqやRT-qPCRなどの方法を介して遺伝子発現を研究するためにも使用されます。[ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]シーケンスを行うには、シーケンスプラットフォームのサイズ制限のため、RNAを断片化する必要があります。さらに、合成された第2鎖cDNAは、cDNA断片がPCR増幅され、シーケンスフローセルに結合できるようにするアダプターと連結する必要があります。遺伝子特異的な分析方法では、一般的にマイクロアレイとRT-qPCRを使用して、蛍光測定法やその他の方法でcDNAレベルを定量します。
2013年6月13日、米国最高裁判所は、Association for Molecular Pathology対Myriad Geneticsの訴訟において、自然界に存在する遺伝子は特許の対象とはならないが、cDNAは自然界には存在しないため特許の対象となる、との判決を下した。[ 21 ]
一部のウイルスは、cDNAを用いてウイルスRNAをmRNAに変換する（ウイルスRNA → cDNA → mRNA）。このmRNAは、宿主細胞を乗っ取るためのウイルス蛋白質を作るのに用いられる。
ウイルスRNAからcDNAへのこの最初のステップの例は、HIV感染サイクルに見られる。ここでは、宿主細胞膜がウイルスの脂質エンベロープに付着し、2コピーのウイルスゲノムRNAを持つウイルスキャプシドが宿主細胞内に入ることができる。その後、ウイルスRNAの逆転写によってcDNAコピーが作られる。このプロセスは、シャペロンCypAとウイルスキャプシド関連逆転写酵素によって促進される。[ 22 ]
cDNAは真核生物ゲノム内のレトロトランスポゾンによっても生成される。レトロトランスポゾンは、RNA中間体を介してゲノム内、時にはゲノム間を移動する可動遺伝因子である。このメカニズムは、感染性粒子の生成を除いて、ウイルスと共通している。[ 23 ] [ 24 ]
Mark D. Adams 他「相補的DNAシーケンス：発現配列タグとヒトゲノムプロジェクト」Science (American Association for the Advancement of Science) 252.5013 (1991): 1651–1656. Web.
Philip M. Murphy、H. Lee Tiffany。「機能的なヒトインターロイキン-8受容体をコードする相補的DNAのクローニング」。Science (American Association for the Advancement of Science) 253.5025 (1991): 1280–1283。Web。