SNPジェノタイピング

動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（DASH）ジェノタイピングは、ミスマッチ塩基対の不安定性によって生じるDNAの融解温度の差を利用する。このプロセスは高度に自動化することが可能で、いくつかの単純な原理に基づいている。

最初のステップでは、ビオチン化プライマーを用いたPCR反応によりゲノム断片を増幅し、ビーズに結合させます。2番目のステップでは、増幅産物をストレプトアビジンカラムに結合させ、NaOHで洗浄してビオチン化されていない鎖を除去します。次に、二本鎖DNAに結合すると蛍光を発する分子の存在下で、アレル特異的オリゴヌクレオチドを添加します。その後、融解温度（Tm）が決定できるまで温度を上昇させながら蛍光強度を測定します。SNPは予想よりも低いTm値をもたらします。^{[ 2 ]}

DASHジェノタイピングはTm値の定量的な変化を測定するため、SNPだけでなくあらゆる種類の変異を測定できます。DASHのその他の利点としては、ラベルフリープローブに対応できること、設計がシンプルで動作条件が簡便なことが挙げられます。

分子ビーコンによるSNP検出では、特別に設計された一本鎖オリゴヌクレオチドプローブが利用されます。オリゴヌクレオチドは、両端に相補領域があり、その間にプローブ配列が配置されるように設計されています。この設計により、プローブは自然な単離状態でヘアピン構造、またはステムループ構造をとることができます。プローブの一方の端には蛍光色素が、もう一方の端には蛍光消光剤が結合しています。プローブのステムループ構造のため、蛍光色素は消光剤に近接しており、分子が蛍光を発するのを防ぎます。また、この分子は、プローブ配列のみがアッセイで使用されるゲノムDNAと相補的になるように設計されています。^{[ 3 ]}

分子ビーコンのプローブ配列がアッセイ中に標的ゲノムDNAに遭遇すると、アニーリングおよびハイブリダイゼーションが起こります。プローブ配列が長いため、プローブのヘアピン構造部分は変性し、より長く安定したプローブ-標的ハイブリッドが形成されます。この構造変化により、ヘアピン構造による近接状態から蛍光色素と消光剤が解放され、分子が蛍光を発するようになります。

一方、プローブ配列が、たとえ1つの非相補的なヌクレオチドを含む標的配列に遭遇した場合、分子ビーコンは優先的に自然なヘアピン構造を維持し、蛍光色素が消光されたままとなるため、蛍光は観察されない。

これらの分子ビーコンの独自の設計により、特定の部位のSNPを同定するための簡単な診断アッセイが可能になります。分子ビーコンが野生型アレルに、もう1つがそのアレルの変異型にそれぞれ適合するように設計されている場合、この2つを用いて個人の遺伝子型を同定できます。アッセイ中に最初のプローブの蛍光色素の波長のみが検出された場合、その個人は野生型ホモ接合体です。2番目のプローブの波長のみが検出された場合、その個人は変異型アレルに対してホモ接合体です。最後に、両方の波長が検出された場合、両方の分子ビーコンがそれぞれの相補鎖とハイブリダイズしているはずであり、したがってその個人は両方のアレルを持ち、ヘテロ接合体であるはずです。

高密度オリゴヌクレオチドSNPアレイでは、数十万個のプローブが小さなチップ上に配列され、多数のSNPを同時に解析できます。^{[ 1 ]} SNPアレルは1つのヌクレオチドしか異ならず、アレイ上のすべてのプローブに対して最適なハイブリダイゼーション条件を達成することは困難であるため、ターゲットDNAはミスマッチプローブとハイブリダイズする可能性があります。この問題は、各SNPを解析するために複数の冗長プローブを使用することで、ある程度解決されます。プローブは、SNP部位が複数の異なる位置にあるように設計されており、SNPアレルとのミスマッチも含まれています。ターゲットDNAとこれらの冗長プローブのそれぞれとのハイブリダイゼーションの差分量を比較することで、特定のホモ接合型およびヘテロ接合型アレルを判定できます。^{[ 1 ]}オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、比較的特異性と感度が低いものの、解析できるSNPの規模は大きな利点です。 Affymetrix Human SNP 5.0 GeneChipは、 50万を超えるヒトSNPの遺伝子型判定が可能なゲノムワイドアッセイを実行します。^{[ 4 ]}

制限酵素断片長多型（RFLP）は、SNPを検出する最も単純で初期の方法と考えられています。SNP-RFLPは、様々な制限エンドヌクレアーゼと、それらが特異的な制限部位に高い親和性を持つことを利用します。ゲノムサンプルを消化し、ゲル電気泳動によって断片長を測定することで、酵素が期待される制限部位を切断したかどうかを判断できます。ゲノムサンプルが切断されなかった場合、予想よりも明らかに大きな断片が生成されます。これは、制限部位に突然変異があり、ヌクレアーゼ活性から保護されていることを示唆しています。

ほとんどの真核生物ゲノムの複雑性の高さ、特定の制限酵素が必要であること、正確な変異を単一の実験で必ずしも特定できないこと、ゲルアッセイの速度が遅いことといった要因が複合的に作用するため、RFLPはハイスループット解析には不向きである。

テトラプライマー増幅抵抗性変異システムPCR（ARMS-PCR）は、2組のプライマーを用いて1回のPCR反応で2つの対立遺伝子を増幅する。プライマーは、2組のプライマーがSNPの位置で重複するように設計されているが、それぞれが可能なSNPのうち1つにのみ完全に一致するように設計されている。本発明の基礎は、予想外にも、3'末端にミスマッチ残基を持つオリゴヌクレオチドは、適切な条件下ではPCRのプライマーとして機能しないという点にある。^{[ 5 ]}その結果、PCR反応に特定の対立遺伝子が存在する場合、その対立遺伝子に特異的なプライマーペアは産物を生成するが、異なるSNPを持つ別の対立遺伝子には生成しない。また、2組のプライマーペアは、PCR産物の長さが大きく異なるように設計されており、ゲル電気泳動や融解温度分析によって容易にバンドを区別できる。^{[ 6 ] [ 7 ]}結果を調べると、ゲノムサンプルがホモ接合型の場合、得られるPCR産物は、SNPの位置に一致するプライマーと外側の反対鎖プライマー、および2つの外側プライマーから得られます。ゲノムサンプルがヘテロ接合型の場合、各アレルのプライマーとそれぞれの外側プライマーの対応物、および外側プライマーから産物が得られます。

別の戦略としては、各アレルを個別に標的とする異なるプライマーセットを用いて複数のqPCR反応を実行する方法がある。適切に設計されたプライマーは、他のSNPよりもはるかに早いサイクルで標的SNPを増幅する。これにより、2つ以上のアレルを区別できるが、各SNPごとに個別のqPCR反応が必要となる。十分な特異性を得るためには、プライマー配列の3'末端付近に人工的なミスマッチを配置する必要がある場合があり、これは一般にTaq-MAMAとして知られる手法である。^{[ 8 ]}

フラップエンドヌクレアーゼ（FEN）は、構造特異的な切断を触媒するエンドヌクレアーゼです。この切断はミスマッチに非常に敏感で、高い特異性でSNPを調べるために使用できます^{[ 9 ]。}

基本的なインベーダーアッセイでは、クリーバーゼと呼ばれるFENが2つの特異的なオリゴヌクレオチドプローブと組み合わされ、標的DNAとともにクリーバーゼによって認識される三部分構造を形成できます。^{[ 9 ]} 最初のプローブはインベーダーオリゴヌクレオチドと呼ばれ、標的DNAの3'末端に相補的です。インベーダーオリゴヌクレオチドの最後の塩基は、標的DNAのSNPヌクレオチドと重なる非一致塩基です。2番目のプローブはアレル特異的プローブで、標的DNAの5'末端に相補的ですが、SNPヌクレオチドの3'側を超えて伸びています。アレル特異的プローブは、SNPヌクレオチドに相補的な塩基を含みます。標的DNAに目的のアレルが含まれている場合、インベーダープローブとアレル特異的プローブが標的DNAに結合して三部分構造を形成します。この構造はクリーバーゼによって認識され、アレル特異的プローブの3'末端を切断して放出します。標的DNA中のSNPヌクレオチドがアレル特異的プローブと相補的でない場合、正しい三部分構造は形成されず、切断は起こりません。Invaderアッセイは通常、切断イベントを検出するために蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）システムと組み合わされます。このセットアップでは、クエンチャー分子がアレル特異的プローブの3'末端に、蛍光色素が5'末端に結合しています。切断が起こると、蛍光色素がクエンチャー分子から分離され、検出可能なシグナルが生成されます。^{[ 9 ]}

ミスマッチプローブでは最小限の切断しか起こらないため、Invaderアッセイは非常に特異的です。しかし、元の形式では、反応サンプルごとに1つのSNPアレルしか検査できず、妥当な時間枠で検出可能なシグナルを生成するには大量のターゲットDNAが必要でした。^{[ 9 ]}いくつかの開発により、元のInvaderアッセイが拡張されました。二次FEN切断反応を実行することにより、Serial Invasive Signal Amplification Reaction（SISAR）は、単一の反応で両方のSNPアレルを検査できます。SISAR Invaderアッセイは、ターゲットDNAも少なくて済むため、元のInvaderアッセイの感度が向上します。^{[ 9 ]} このアッセイは、ハイスループット形式で使用するためにいくつかの方法で適応されています。あるプラットフォームでは、アレル特異的プローブがマイクロビーズに固定されています。FENによる切断によって検出可能な蛍光シグナルが生成されると、フローサイトメトリーを使用してシグナルが測定されます。フローサイトメトリーの感度により、ターゲットDNAのPCR増幅が不要になります。^{[ 10 ]}これらのハイスループットプラットフォームは原理実証段階を超えて進展しておらず、これまでのところ、Invader システムは大規模な SNP ジェノタイピング プロジェクトでは使用されていません。^{[ 9 ]}

プライマー伸長法は、まずプローブをSNPヌクレオチドのすぐ上流の塩基にハイブリダイズさせ、次に「ミニシーケンシング」反応を行う2段階のプロセスです。この反応では、DNAポリメラーゼがハイブリダイズしたプライマーにSNPヌクレオチドに相補的な塩基を追加して伸長させます。この追加された塩基を検出してSNPアレルを決定します。^{[ 11 ] [ 12 ]} プライマー伸長法は高精度のDNAポリメラーゼ酵素に基づいているため、この方法は一般的に非常に信頼性が高いです。プライマー伸長法は、非常に類似した反応条件下でほとんどのSNPの遺伝子型を決定できるため、柔軟性も非常に高いです。プライマー伸長法は、さまざまなアッセイ形式で使用されています。これらの形式では、MALDI-TOF質量分析法（Sequenomを参照）やELISAのような方法など、幅広い検出技術が使用されています。^{[ 1 ]}

一般的に、蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）または蛍光標識デオキシヌクレオチド（dNTP）のいずれかを組み込む2つの主要なアプローチがあります。ddNTPの場合、プローブはSNPヌクレオチドのすぐ上流の標的DNAにハイブリダイズし、SNPアレルに相補的な単一のddNTPがプローブの3'末端に追加されます（ジデオキシヌクレオチドには3'-ヒドロキシル基がないため、それ以上のヌクレオチドの追加はできません）。各ddNTPは異なる蛍光シグナルで標識されているため、同じ反応で4つのアレルすべてを検出できます。dNTPの場合、アレル特異的プローブは、検査対象の各SNPアレルに相補的な3'塩基を持っています。標的DNAにプローブの3'塩基に相補的なアレルが含まれている場合、標的DNAはプローブに完全にハイブリダイズし、DNAポリメラーゼがプローブの3'末端から伸長できるようになります。これは、蛍光標識されたdNTPがプローブの末端に取り込まれることで検出されます。標的DNAにプローブの3'塩基に相補的な対立遺伝子が含まれていない場合、標的DNAはプローブの3'末端でミスマッチを生じ、DNAポリメラーゼはプローブの3'末端から伸長することができません。2番目の方法の利点は、複数の標識dNTPが伸長中の鎖に取り込まれる可能性があり、シグナルが増加することです。ただし、まれにDNAポリメラーゼがミスマッチした3'プローブから伸長し、偽陽性の結果をもたらすことがあります。^{[ 1 ]}

Sequenom社のiPLEX SNPジェノタイピング法は、MassARRAY質量分析計を用いるという異なるアプローチを採用しています。伸長プローブは、PCRカクテル中で40種類のSNPアッセイを増幅・分析できるように設計されています。伸長反応には上記と同様にddNTPを使用しますが、SNPアレル検出は蛍光分子ではなく、伸長産物の実際の質量に依存します。この方法は低～中程度のハイスループット向けであり、全ゲノムスキャンには適していません。

プライマー伸長法の柔軟性と特異性により、ハイスループット解析に適しています。プライマー伸長プローブはスライド上に配列できるため、一度に多くのSNPの遺伝子型判定が可能です。アレイプライマー伸長法（APEX）と総称されるこの技術は、プローブの差分ハイブリダイゼーションに基づく方法に比べていくつかの利点があります。比較すると、APEX法は、この差分ハイブリダイゼーションを使用する方法よりも識別力が高く、DNAマイクロアレイ上の数千個のプローブに対して最適なハイブリダイゼーション条件を得ることはしばしば不可能です（通常、これは冗長性の高いプローブを使用することで対処されます）。ただし、APEX法では同じプローブ密度を達成できないため、1回のランあたりの出力が低くなります。^{[ 1 ]}

Illumina IncorporatedのInfiniumアッセイは、プライマー伸長法に基づく全ゲノムジェノタイピングパイプラインの一例です。Infiniumアッセイでは、10万個以上のSNPをジェノタイピングできます。このアッセイでは、プライマー伸長反応でハプテン標識ヌクレオチドを使用します。ハプテン標識は抗体によって認識され、抗体は検出可能なシグナルと結合します。^{[ 13 ]}

APEX-2は、効率的な均一マルチプレックスPCR （最大640プレックス）とマイクロアレイ上での4色シングルベース伸長法を用いて、数百のSNPまたは変異を並行して同定できるアレイ型プライマー伸長ジェノタイピング法です。マルチプレックスPCRでは、SNP/変異ごとに2つのオリゴヌクレオチドが必要で、検査対象の塩基対を含むアンプリコンが生成されます。同じオリゴヌクレオチドは、次のステップでマイクロアレイ上に固定化されたシングルベース伸長プライマーとして使用されます（Krjutskov et al. 2008）。

Taq DNAポリメラーゼの5'-ヌクレアーゼ活性は、 SNPジェノタイピングのためのTaqManアッセイで使用されます。TaqManアッセイはPCR反応と同時に実行され、PCR反応の進行に合わせてリアルタイムで結果を読み取ることができます。^{[ 14 ]} このアッセイでは、SNP多型部位を含む領域を増幅する順方向および逆方向のPCRプライマーが必要です。対立遺伝子の識別は、 SNP多型部位にハイブリダイズする1つまたは2つの対立遺伝子特異的プローブとFRETを組み合わせて行われます。プローブには、5'末端に蛍光色素が、3'末端に消光分子が結合しています。プローブが無傷である間、消光分子は蛍光色素のすぐ近くに留まり、蛍光色素のシグナルを消します。 PCR増幅ステップにおいて、アレル特異的プローブがSNPアレルと完全に相補的であれば、標的DNA鎖に結合し、PCRプライマーからDNAを伸長するTaqポリメラーゼの5'-ヌクレアーゼ活性によって分解される。プローブの分解により蛍光色素がクエンチャー分子から分離され、検出可能なシグナルが生成される。アレル特異的プローブが完全に相補的でない場合、融解温度が低くなり、結合効率が低下する。これにより、ヌクレアーゼがプローブに作用できなくなる。^{[ 14 ]}

TaqManアッセイはPCRに基づいているため、比較的簡単に実装できます。TaqManアッセイは、1つの反応で最大7つのSNPの検出を組み合わせることでマルチプレックス化できます。ただし、各SNPには異なるプローブが必要なため、TaqManアッセイはSNPがどれだけ近接して配置できるかによって制限されます。アッセイの規模は、マイクロタイタープレートで多数の同時反応を行うことで大幅に拡大できます。一般的に、TaqManは、各SNPに対して最適なプローブと反応条件を設計する必要があるため、少数のSNPを調査するアプリケーションに限定されます。^{[ 11 ]}

DNAリガーゼは、DNA断片の3'末端を隣接するDNA断片の5'末端に連結する反応を触媒します。このメカニズムは、2つのプローブをSNP多型部位に直接ハイブリダイズさせることでSNPを解析するために使用できます。プローブが標的DNAと同一であれば、連結反応が起こります。オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイでは、2つのプローブが設計されます。1つは、3'塩基がSNPヌクレオチドの真上に位置するように標的DNAにハイブリダイズするアレル特異的プローブ、もう1つは、SNP多型部位の上流（相補鎖では下流）のテンプレートにハイブリダイズし、連結反応のための5'末端を提供するプローブです。アレル特異的プローブが標的DNAと一致する場合、標的DNAに完全にハイブリダイズし、連結反応が起こります。3'塩基がミスマッチしている場合、一般的に連結反応は起こりません。連結または非連結の産物は、ゲル電気泳動、MALDI-TOF質量分析、または大規模アプリケーション用のキャピラリー電気泳動によって検出できます。^{[ 1 ]} オリゴヌクレオチドに適切な配列とタグを付けることで、連結産物からハイスループットシーケンスデータを生成し、遺伝子型を決定できます。^{[ 15 ]} 多数のサンプルインデックスを使用することで、ハイスループットシーケンスランのごく一部で、数千のサンプル中の数百のSNPに関するハイスループットシーケンスデータを生成できます。これは、シーケンス技術による大規模遺伝子型決定（MGST）です。

一本鎖DNA（ssDNA）は三次構造に折り畳まれる。その構造は配列に依存し、ほとんどの単一塩基対変異は構造の形状を変化させる。ゲルに適用すると、三次構造がssDNAの移動度を決定し、SNPアレルを区別するメカニズムを提供する。この方法は、まず標的DNAのPCR増幅を伴う。二本鎖PCR産物は、熱とホルムアルデヒドを使用して変性され、ssDNAが生成される。ssDNAは非変性電気泳動ゲルに適用され、三次構造に折り畳まれる。DNA配列の違いは三次構造を変化させ、ssDNA鎖の移動度の違いとして検出される。^{[ 16 ]}この方法は、技術的に単純で、比較的安価で、一般的に入手可能な機器を使用するため、広く使用されている。しかし、他のSNPジェノタイピング方法と比較すると、このアッセイの感度は低い。 ssDNAの構造は温度に大きく依存することがわかっており、理想的な温度が一般的に明らかではありません。多くの場合、アッセイは複数の異なる温度を使用して実施されます。また、400 bpを超える配列を使用すると感度が低下するため、断片の長さにも制限があります。^{[ 16 ]}

温度勾配ゲル電気泳動(TGGE) または温度勾配キャピラリー電気泳動 (TGCE) 法は、部分的に変性した DNA はゲルなどの多孔質材料内でより制限され、移動速度が遅くなるという原理に基づいています。この特性により、融解温度による DNA の分離が可能になります。これらの方法を SNP 検出に適用するには、2 つの断片を使用します。1 つは、検査対象の SNP 多型部位を含むターゲット DNA、もう 1 つは、正常 DNA 断片と呼ばれる対立遺伝子特異的 DNA 配列です。正常断片は、ターゲット DNA では不明な SNP 多型部位を除いて、ターゲット DNA と同一です。断片は変性され、その後再アニーリングされます。ターゲット DNA が正常断片と同じ対立遺伝子を持っている場合、同じ融解温度を持つホモ二本鎖が形成されます。温度勾配のあるゲルで泳動すると、1 つのバンドのみが現れます。ターゲット DNA が異なる対立遺伝子を持っている場合、再アニーリングのステップの後、4 つの産物が形成されます。標的DNAからなるホモ二重鎖、正常DNAからなるホモ二重鎖、および標的DNAの各鎖が正常DNA鎖とハイブリダイズした2つのヘテロ二重鎖。これら4つの生成物はそれぞれ異なる融解温度を持ち、変性ゲル中で4つのバンドとして現れる。^{[ 1 ]}

変性高速液体クロマトグラフィー（DHPLC）は、逆相HPLCを使用してSNPを解析します。DHPLCの鍵は、一本鎖DNAと二本鎖DNAに対して異なる親和性を持つ固相です。DHPLCでは、DNA断片は加熱によって変性され、その後再アニーリングされます。再アニーリングされたDNA断片の融解温度によって、カラムに保持される時間が決まります。^{[ 17 ]} PCRを使用して、2つの断片が生成されます。SNP多型部位を含むターゲットDNAと、正常DNA断片と呼ばれる対立遺伝子特異的DNA配列です。この正常断片は、ターゲットDNAでは不明なSNP多型部位を除いて、ターゲットDNAと同一です。断片は変性され、徐々に再アニーリングされます。再アニーリングされた産物はDHPLCカラムに追加されます。ターゲットDNAのSNP対立遺伝子が正常DNA断片と一致する場合、再アニーリングステップ中に同一のホモ二本鎖のみが形成されます。標的DNAが正常DNA断片とは異なるSNPアレルを含む場合、ホモ二本鎖に加えて、ミスマッチ多型部位を含む標的DNAと正常DNAのヘテロ二本鎖が形成される。ミスマッチヘテロ二本鎖はホモ二本鎖とは異なる融解温度を持ち、カラムに長く保持されない。これにより、標的DNA断片と正常DNA断片が同一である場合に生成されるパターンとは異なるクロマトグラムパターンが生成される。溶出されたDNAはUV吸収によって検出される。^{[ 17 ]}

DHPLCは、DNA断片の標識や精製が不要なため、容易に自動化できます。この方法は比較的迅速で、特異性も高いです。DHPLCの大きな欠点の1つは、適切な変性度を達成するために、各ターゲットごとにカラム温度を最適化する必要があることです。^{[ 1 ]}

高解像度融解分析は、最も理解しやすいPCRベースの方法です。基本的に、ゲル電気泳動法が機能するのと同じ熱力学的特性が、ここでもリアルタイムで適用されます。蛍光光度計は、PCR後のdsDNAアンプリコン全体の変性をモニターします。増幅したい部位に特異的なプライマーを作成します。PCRミックスに含まれる二本鎖特異的色素でアンプリコンを「塗装」します。ds特異的色素はPCR産物に組み込まれます。本質的に、アンプリコン全体がプローブになります。これにより、発見の新たな可能性が開かれます。プライマーを問題のSNPの両側に非常に近い位置に配置するか（小さなアンプリコンジェノタイピング）^{[ 18 ]}、スキャン目的でより大きな領域（長さ100～400bp）を増幅します。SNPの単純なジェノタイピングでは、1つのSNPを別のSNPと間違える可能性を最小限に抑えるために、アンプリコンを小さくする方が簡単です。増幅産物全体の融解温度（Tm）が決定され、ほとんどのホモ接合体は（より高性能な機器では）Tmが十分に異なるため、遺伝子型を判定できます。ヘテロ接合体は、ヘテロ二本鎖が生成されるため（ゲルベースの説明を参照）、さらに簡単に区別できます。これにより融解遷移が広がり、通常は2つの識別可能なピークが得られます。蛍光標識プライマーを使用した増幅産物の融解については説明されていますが、^{[ 19 ]}、蛍光プライマーのコストが高いため、ds特異的色素を使用するよりも実用的ではありません。

より大きなアンプリコンのスキャンは、上記で概説したのと同じ原理に基づいています。ただし、融解温度と融解曲線の全体的な形状が情報を提供します。約 150 bp を超えるアンプリコンの場合、多くの場合 2 つ以上の融解ピークがあり、それぞれが DNA テンプレートの構成に応じて変化する可能性があります。多くの研究者は、融解ベースのスキャンによってシーケンスの大部分をうまく排除し、多数の個体の正確な遺伝子座ベースのジェノタイピングを可能にしました。^{[ 20 ]} 多くの研究者は、高解像度融解を使用した変異のスキャンが、遺伝子全体を研究するための実行可能で実用的な方法であることを発見しました。

DNAミスマッチ結合タンパク質は、単一ヌクレオチドミスマッチを識別できるため、SNPの差分解析を容易にします。例えば、Thermus aquaticus由来のMutSタンパク質は、異なる親和性で異なる単一ヌクレオチドミスマッチに結合し、キャピラリー電気泳動で6セットすべてのミスマッチを識別するために使用できます。^{[ 21 ]}

SNPlexは、 Applied Biosystems社が販売する独自の遺伝子型判定プラットフォームです。

サーベイヤーヌクレアーゼは、すべての塩基置換および小さな挿入/欠失（インデル）を認識するミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素であり、両方のDNA鎖のミスマッチ部位の3'側を切断します。