分子量サイズマーカー

分子量サイズマーカーは、タンパク質ラダー、DNAラダー、またはRNAラダーとも呼ばれ、分子量がゲルマトリックスを通る移動速度に反比例するという原理を使用して、電気泳動中にゲル上を流れる分子のおおよそのサイズを識別するために使用される一連の標準です。したがって、ゲル電気泳動で使用する場合、マーカーは効果的に対数スケールを提供し、それによって他のフラグメントのサイズを推定します（マーカーのフラグメントサイズがわかっている場合）。

あらかじめ決められた断片サイズと濃度を持つタンパク質、DNA、RNA マーカーが市販されています。これらはアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルで実行できます。実行開始前に、マーカーをサンプルレーンに隣接するレーンにロードします。

分子量マーカーの概念は維持されていますが、開発技術は年々変化しています。分子量マーカーの新しい発明は、マーカーの種類に特化したキットで配布されています。

マーカー開発における初期の課題は、マーカーの全長にわたって高解像度を達成することであった。^[1]ゲル電気泳動の条件によっては、断片が圧縮され、鮮明さが損なわれる可能性がある。この問題に対処するために、 1990年にサザンブロット分析キットが開発され、ターゲットDNAとプローブDNAを組み合わせた最初のマーカーが提供された。この技術は対数間隔を利用し、20,000ヌクレオチドの長さに及ぶターゲットバンドを識別するために使用できた。^[2]

DNA 分子量サイズマーカーを構築する一般的な方法は 2 つあります。^{[3]そのような方法の 1 つは、部分的}ライゲーションの技術を採用しています。^{[3] DNA ライゲーションは、線状 DNA 断片が}共有結合を介して互いに接続されるプロセスです。より具体的には、これらの結合はホスホジエステル結合です。^[4]ここでは、100bp の二重鎖 DNA 断片が部分的にライゲーションされています。その結果、200bp の二量体、300bp の三量体、400bp の四量体、500bp の五量体などが形成されます。さらに、100bp の dsDNA の一部が残ります。その結果、既知の分子量の DNA 断片で構成された DNA「ラダー」がゲル上に作成されます。^[3]

2番目の方法は、制限酵素と認識されたDNA配列を使用する方法です。^[3] DNAは特定の制限酵素によって消化され、さまざまな分子量のDNA断片が生成されます。この方法の利点の1つは、既知のDNAをさらに消化するだけで、より多くのマーカーを簡単に作成できることです。^[3]一方、DNA断片のサイズは、制限酵素が切断する部位に基づいています。これにより、マーカーの断片のサイズを制御することがより困難になります。^[5]

最近では、DNA分子量サイズマーカーを構築するための別の方法が研究室で採用されています。この戦略では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用します。^{[5]これは、1）}プライマーセットを介してDNAターゲットを同時に増幅するか、2）特定のプライマーを介して異なるDNAターゲットを個別に増幅するかの1つまたは2つの方法で実現されます。^[5]

実験サンプルと同様に、ゲルの状態は、それらと一緒に流れる分子量サイズマーカーに影響を与える可能性があります。バッファー、電荷/電圧、ゲルの濃度などの要因は、マーカー/ラダー/標準の移動度や外観に影響を与える可能性があります。マーカーを選択するとき、およびゲルの最終結果を分析するときには、これらの要素を考慮する必要があります。

バッファ

緩衝液は、1) pH を確立し、2)イオンを提供して導電性を維持する働きをします。DNA電気泳動では、TAE (トリス酢酸 EDTA)とTBE (トリスホウ酸 EDTA)が通常の緩衝液として選ばれます。^[6] TBE 緩衝液は小さな DNA 断片に適していますが、TAE は 1500 塩基対を超える断片に適しています。緩衝能力の点では、TAE は TBE に比べて低く、一般的に DNA の移動度が遅くなります。TBE は解像度も優れています。^[7]

水はこれらの緩衝液の代用としては使えないことに注意する必要がある。なぜなら、DNAはゲルに沿って移動しないからである。 ^{[6]さらに、緩衝液の代わりに水を使用すると、ゲルが}溶けてしまう。^[8]

電荷/電圧

電圧に関しては、推奨範囲は4〜10 V/cm（ボルト/cm）です。^[8]アガロースゲルは通常5 V/cmの電圧で動作します。^{[3] [6]}距離の単位cmは、電極（つまり、陽極と陰極）間の距離を指し、ゲル自体の長さではありません。^{[3] [6]}

この範囲よりはるかに低いまたは高い電圧は、バンドの移動度と解像度に影響します。低電圧は移動度を低下させ、バンドを広げます。一方、高電圧はバンドの解像度を低下させます。これは主に、電圧が高すぎるとゲルが過熱し、溶けてしまう可能性があるためです。^[8]

集中

マーカーを選択する際には、アガロース濃度を考慮する必要があります。ゲルの割合はDNA の移動に影響します。^{[3] [6]}一般的に、ゲル濃度が高いほど、DNA がゲルを通過する速度は遅くなります。これは、DNA マーカーまたはサンプルの移動において分子量が果たす役割に加えて、分子量が高いほど DNA の移動が遅くなることを意味します。^{[3] [6]}

ゲル濃度は、ゲル上のバンドを視覚化する能力にも影響します。より小さなバンドは、より高い濃度のゲルでよりよく分離されますが、分子量の大きいバンドは、より低い濃度のゲルでより簡単に視覚化されます。^[6]

これまで、タンパク質マーカーは様々なタンパク質全体を用いて開発されてきた。タンパク質断片に基づく分子量サイズマーカーを含むキットの開発は1993年に始まりました。このタンパク質マーカーは49の異なるアミノ酸配列で構成され、マルチドメインタンパク質を含み、異なる部位で切断されたタンパク質の分析を可能にしました。^[9]

タンパク質マーカーの現在の技術改善には自動開発の利用が含まれます。最初の自動開発の定常重量タンパク質マーカーは2012年に発明されました。^[10]

DNAマーカーと同様に、これらのマーカーは通常、分子量がすでにわかっている精製​​されたタンパク質で構成されています。^[3]以下のリストは、タンパク質マーカーを構築する際に一般的に使用されるタンパク質と分子量の一部を示しています。

分子量サイズマーカーは、分子量マーカーと分子ラダーマーカーの2つのカテゴリに分類できます。^[14]マーカーは染色されているか染色されていないかのいずれかであり、状況に応じて、どちらかが他のマーカーよりも適切である可能性があります。分子量サイズマーカーは、生化学的に変更することもできます。^[15]ビオチンとの結合が最も一般的です。分子量サイズマーカーは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロッティングで最も一般的に使用されます。分子量サイズマーカーにはさまざまな種類と用途があるため、適切なタンパク質標準を選択することが重要です。サンプルの分子量を計算する方法としての最も一般的な用途に加えて、タンパク質の移動と転写効率の視覚的証拠を可能にするなどの用途があり、陽性対照として使用されることもあります。^[16]

MWマーカーとタンパク質ラダー

分子量マーカーはタンパク質標準物質の一種です。ロード前に染色するかしないかは自由です。実験の種類によっては、どちらかが有利な場合があります。どちらの場合も、通常はゲルの外側のレーンで実行され、サンプルは中央のレーンにロードされます。^[14]分子マーカーは、仕様が適切に分類されているものの整数に対応していないネイティブタンパク質の混合物で構成されている点で、タンパク質ラダーとは異なります。[ ^14]一般的にこれらははるかに安価ですが、分析では電気泳動で分離されたタンパク質のおおよその値しか得られません。^[14]

タンパク質ラダーは、別のタイプのタンパク質標準です。ほとんどの場合、染色されています。^[14]タンパク質ラダーは、仕様が既知で整数に対応する高度に精製されたタンパク質の混合物で構成されている点で、分子マーカーとは異なります。^[14]一般に、タンパク質ラダーは10〜12個のタンパク質で構成されています。^[14]実験の最後に、サイズ移動が発生した後、1つのバンドがラダーに含まれる各タンパク質のサイズを表します。^[17]マーカーは均等に配置されており、これらのマーカーを使用したサイズ分析により、対象のタンパク質の正確な値が得られます。場合によっては、分子確認方法として、MWマーカーをタンパク質ラダーで実行して検証します。^[14]

染色済みマーカーと未染色マーカー

タンパク質マーカーには染色されていないものと染色済みのものがありますが、どちらにも利点と欠点があります。^[18]染色済みのマーカーを使用すると、タンパク質の分離と転写を簡単に視覚化できます。^[18]これらは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロッティングの両方で一般的に使用されています。SDS-PAGEでは、タンパク質バンドが分離して電気泳動中に確認できるため、タンパク質の移動を監視できます。ウェスタンブロットでは、染色されたタンパク質標準により、膜へのタンパク質転写を視覚化できます。^{[17]ただし、これらのマーカーではサイズ決定がそれほど}正確ではありません（詳細については、組換えマーカーと天然マーカーのセクションを参照してください）。^[18]

染色されていないマーカーはより正確なサイズ測定を可能にしますが、ゲルを流している間は見ることができません。そのため、バンドを視覚化するにはゲルを染色する必要があります。^[19]

組み換えマーカーと天然マーカー

染色マーカーと非染色マーカーの他に、タンパク質マーカーは組み換え型と天然型という観点から考えることができます。^[18]組み換え型マーカーは高度に精製された組み換えタンパク質で構成されています。これらのマーカーは特定の特性を強調するように設計されています。^[18]これらの特性の例には、互いに均一に配置された親和性タグと分子量が含まれます。 ^[18]

天然マーカーは、その名前が示すように、天然に存在するタンパク質の混合物です。^[18]染色済みの天然マーカーは、ゲル分離の可視化に適しています。ただし、これらのマーカーは、さまざまな量とさまざまな位置で共有結合して染色剤に結合する傾向があります。 ^[18]その結果、結果として得られるバンドは広くなる可能性があります。これは、染色済みの組み換えマーカーと比較する場合に特に当てはまります。この影響により、染色済みの天然マーカーでは分子量の決定の精度が低くなる可能性があります。^[18]

生化学的に変化した

タンパク質標準物質は化学的に改変することもできる。一般的な改変法はビオチンの使用によるものである。ビオチンはストレプトアビジンに対して非常に高い親和性を持つため、結合すると非常に強力な複合体を形成する。視覚化のために、ストレプトアビジンにカラータグが付けられる。^[15]

DNA 電気泳動と同様に、タンパク質マーカーを選択する際には、バッファー、電荷/電圧、濃度などの条件を考慮する必要があります。

バッファ

緩衝液はマーカーとサンプルの両方の移動度に影響を与える可能性があります。緩衝液のpHは使用するシステムによって異なるため、各緩衝液システムはタンパク質の電荷に異なる影響を与えます。^[20]さらに、SDS-PAGEの場合、 SDSに対する結合親和性は緩衝システムの影響を受ける可能性があります。^[20]同じ割合とタイプのゲルを使用した場合でも、使用する緩衝液に応じて同じタンパク質が異なる速度で移動します。^[20]

電荷/電圧

電圧はゲル上のタンパク質の移動度に影響を及ぼします。タンパク質は電圧が高いほど速く移動します。その結果、ゲルの泳動時間は短くなります。逆に、電圧が高いとバンドの拡散が大きくなる可能性があります。^[20]また、電圧が高すぎると、電気泳動チャンバー内の温度が上昇してゲルが溶け始める可能性があります。^[20]

ゲルを流すのに必要な電圧はゲルの種類によって異なります。ゲルによっては流す間ずっと電圧が一定のままであるものもありますが、他のゲルでは初期電圧が一定時間一定に保たれ、その後電圧が上昇します。^[20]この2番目の電圧は一定時間使用され、その後電圧が上昇することもあります。^[20]

集中

パーセンテージで見ると、タンパク質電気泳動に使用されるゲルは、シングルパーセンテージゲルとグラジエントゲルに分類できます。^[18]シングルパーセンテージゲルはリニアゲルとも呼ばれます。^[20]リニアゲルの場合、選択されるパーセンテージは通常 7.5% から 20% の間です。^[18]グラジエントゲルの一般的なパーセンテージ範囲は 4-15% と 10-20% です。各タイプのゲルにはそれぞれ利点があります。^[18]たとえば、いくつかのタンパク質の分子量が似ている場合はリニアゲルが適しています。リニアゲルを使用すると、これらのタンパク質間の分離がより良好になります。^[18]一方、グラジエントゲルは、対象のサンプルに分子量が大きく異なるタンパク質が含まれている場合や、分子量の範囲が広いタンパク質が含まれている場合に適しています。^{[18] [20]}

RNA分子量サイズマーカーで構成されたRNAラダーは、当初、合成サークル法^[21]を使用して異なるサイズのマーカーを生成することによって開発されました。この技術は、発明者のEric T. Koolによって改良され、環状DNAベクターを使用してRNA分子量サイズマーカーを生成する方法になりました。ローリングサークル法と呼ばれるこの技術の改良は、RNAオリゴヌクレオチドの合成効率に起因しています。環状DNAテンプレートから、プライマーを必要とせず、ヌクレオチド三リン酸をリサイクルすることで、4〜1500 bpの長さの一本鎖RNAを生成できます。DNAも環状テンプレートから合成できるため、この技術の汎用性が高まります。ランオフ転写と比較して、合成サークル法ではランオフなしでRNAオリゴヌクレオチドが生成されます。PCRと比較して、合成サークル法ではポリメラーゼもサーマルサイクラーも必要とせずにRNAオリゴヌクレオチドが生成されます。この方法は、機械合成装置よりも低いエラー率で大量の製品を合成できるため、コスト効率も優れています。^[21]

RNAマーカーは、さまざまな長さのRNA転写産物で構成されています。たとえば、Lonza 0.5-9 kbpマーカー^[22]には、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、および9キロベースペアをマークするバンドがあります。マーカーはEDTAなどの保存バッファーに溶解され、-80°Cで保存した場合、最大2年間の保存期間があります。ノーザンブロット分析などにマーカーを使用するには、まず解凍し、次にゲル電気泳動で検出できるように染色します。マーカーに使用される最も一般的な染料の1つはエチジウムブロマイドです。

特定のマーカーの範囲は、それがマッピングできるバンドの種類を指します。「高」範囲は比較的大きなフラグメント（kb で測定）を指し、「低」範囲は小さなフラグメント（bp で測定）を区別するマーカーを指します。一部のマーカーは「超低範囲」とさえ表現されますが、^[16]さらに正確なのはマイクロ RNA マーカーです。マイクロ RNA マーカーは、17-25 nt マイクロ RNA マーカーなど、12 ヌクレオチド以内の RNA フラグメントを測定するために使用できます。^[23]

同等の分子量では、RNAはDNAよりも速く移動します。しかし、RNAとDNAはどちらも移動距離と対数分子量の間に負の直線 勾配があります。 ^[24]つまり、重量の少ないサンプルの方がより長い距離を移動できます。この関係は、RNAまたはDNAマーカーを標準として選択する際に考慮する必要があります。

RNAマーカーとRNAサンプルをゲル上で走査する場合、RNAは触媒によるリボヌクレアーゼ（RNase）分解に非常に敏感であるため、ヌクレアーゼ汚染を防ぐことが重要です。^{[25] [26]}したがって、手順で使用するすべての材料を考慮する必要があります。RNAと接触するガラス器具はすべてジエチルピロカーボネート（DEPC）で前処理し、プラスチック材料は使い捨てにする必要があります。^[25]

分子量サイズマーカーの最も一般的な用途の 1 つは、ゲル電気泳動です。ゲル電気泳動の目的は、電荷、分子サイズ、pH などの物理的または化学的特性によってタンパク質を分離することです。サイズに基づいて分離する場合、理想的な方法は SDS-PAGE またはポリアクリルアミドゲル電気泳動であり、分子量サイズマーカーは使用する適切な標準です。

ゲルのサイズはさまざまです。実行するサンプルの数によって、適切なゲルのサイズが決まります。すべてのゲルは、ゲルを平行に走るレーンに分割されます。各レーンには特定のサンプルが含まれます。通常、分子量サイズ標準は外側のレーンに配置されます。ゲルのレーン数が特に多い場合は、透明度を高めるために、複数のラダーをゲル全体に配置することができます。

タンパク質と標準物質をゲル上の適切なレーンにピペットで移します。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) はタンパク質と相互作用し、タンパク質を変性させて負電荷を与えます。すべてのタンパク質は同じ電荷対質量比を持っているため、ゲル中のタンパク質の移動性は分子量のみに基づきます。電場がオンになると、タンパク質の移動が始まります。完了すると、ウェスタンブロッティングなどの検出メカニズムを使用して、バンドの存在を明らかにすることができます。各バンドは特定のタンパク質を表します。移動距離は分子量のみに基づいているため、未知のタンパク質の距離を既知の分子量の標準物質と比較することで、各タンパク質の分子量を決定できます。^[27]

分子量サイズ マーカーには多くの種類があり、それぞれが独自の特性を持っているため、さまざまな生物学的手法に活用されています。分子量サイズ マーカーの選択は、マーカーの種類 (DNA、RNA、またはタンパク質) とマーカーの長さの範囲 (例: 1kb) によって異なります。分子量サイズ マーカーを選択する前に、これらの特性と性質をよく理解しておくことが重要です。特定の状況では、あるタイプが他のタイプよりも適している場合があります。特定のマーカーは、特定の手法のプロトコルによって異なる場合がありますが、このセクションでは一般的なマーカーとその役割について概説します。

ゲル電気泳動で最初に開発され、実行された分子マーカーはアロザイムでした。これらのマーカーはタンパク質の変異の検出に使用されます。「アロザイム」（「アロエンザイム」とも呼ばれる）という言葉は、「酵素の対立遺伝子変異体」に由来しています。^[28]ゲルで実行された場合、タンパク質はサイズと電荷によって分離されます。アロザイ​​ムは、利用可能な他のマーカーと比較すると時代遅れのように見えるかもしれませんが、主に低コストのため、現在でも使用されています。1つの大きな欠点は、利用できる量が限られているため、特異性が問題になることです。^[28]

アロザイムはDNAの変異を検出できますが、間接的な方法であり、あまり正確ではありません。DNAベースのマーカーは1960年代に開発されました。^{[28]これらのマーカーはDNA変異体を区別するのにはるかに効果的です。今日では、これらが最も一般的に使用されているマーカーです。DNAベースのマーカーはヌクレオチドを調査することで機能し、ヌクレオチドの違いを検出したり、}突然変異の数を定量化したりするなど、さまざまな機能を果たすことができます。^[28]

ＲＦＬＰ

制限酵素断片長多型は、相同DNAの変異を検出するために使用される技術である。^[29]特定の制限酵素がDNAを消化するために使用される。RFLP分子マーカーは単一の断片に特異的である。対立遺伝子RFLPマーカーとともに、分子量サイズマーカー（この場合はDNAマーカー）^[30]も電気泳動アガロースゲルに含まれています。DNAマーカーにより、制限酵素断片のサイズを推定することができます。

ミニサテライト

RFLPと同様に、この技術も制限酵素を使用してゲノムDNAを消化します。ミニサテライトは、約10〜60塩基対のタンデムリピートの短い配列です。ミニサテライトは、DNAフットプリント法や遺伝子制御の調節因子として使用できます。^[28]

DNAベースのマーカーの成功はPCRの開発につながった。PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は、さまざまな種類の断片に適用できるDNA増幅技術である。この開発以前は、DNAを増幅するには、クローン化または単離する必要がありました。PCRの発見後まもなく、ゲル電気泳動にPCRベースのマーカーを使用するというアイデアが生まれました。これらのタイプのマーカーはPCRプライマーに基づいており、DNA配列多型として分類されます。^[28]

マイクロサテライト

マイクロサテライトはSSR（単純配列反復）またはSTR（短タンデム反復）とも呼ばれ、ミニサテライトとは異なり、通常は2〜6塩基対と短い。マイクロサテライトのこの特性により、簡単に分離できる。マイクロサテライトは集団遺伝学で最も一般的に使用されている。マイクロサテライトは変異率が高く複雑であり、これが大きな欠点である。^[28]

AFLP

増幅断片長多型はPCRベースのDNAフィンガープリンティング技術です。DNAはまずエンドヌクレアーゼで消化されます。次に制限断片が連結されます。^[31]増幅のために特定の断片が選択されると、分子マーカーが生成されます。AFLPマーカーはゲル上でDNAマーカーと一緒に実行されます。一般的なAFLP DNAマーカーの長さは30〜330bpです。^[32]このマーカーの断片は、精度を高めるために10bp間隔で配置されています。

RAPD

ランダム増幅多型DNAはAFLPに似た技術である。違いは分子マーカーがランダムに生成されることである。^[31]この技術で最も一般的な分子量サイズマーカーは1kb DNAラダーである。^{[33] [34]}

技術的に言えば、DNA配列多型は1960年代にRFLPが使用されて以来続いていますが、分析は長年にわたって大きく変化してきました。DNA配列多型は、RFLPのような古い技術を使用しますが、より大規模です。シーケンシングははるかに高速で効率的です。分析は自動化されており、ショットガンシーケンシングと呼ばれる技術を使用しています。このハイスループット方法は、集団遺伝学でよく使用されています。^[28]

SNP

SNP（一塩基多型）は、一塩基の変異を検出するために使用されます。この技術はRFLPと非常によく似ています。SNPは集団遺伝学の研究で頻繁に使用されます。^[35] PCRによる増幅後、これらの小さな断片はゲル電気泳動を使用して視覚化することができ、ここでもDNAマーカーが断片の長さを決定する役割を果たします。

炭水化物マーカーは、測定可能な分離技術である炭水化物ゲル電気泳動による多糖類分析（PACE）と呼ばれる技術で使用されています。 ^{[36]これにより、酵素}加水分解生成物 の分析が可能になります。^{[36]これは、}ヘミセルロース分解に関与する酵素の特性評価、ヘミセルロース多糖類の構造決定、セルロース製品の酵素分解の分析などの用途に使用されています。 ^[36]

PACEは、化合物を誘導体に変換する誘導体化に依存しています。^{[36] [37]}ここで、単糖類、オリゴ糖、多糖類が対象の化合物です。これらの化合物の還元末端には蛍光標識（蛍光体）が付けられています。^[36]この蛍光体による誘導体化により、ゲル上での所望の状況下での分離とゲルの蛍光イメージングの両方が可能になります。この場合、ポリアクリルアミドゲルが使用されます。^[36]

DNA、RNA、タンパク質の電気泳動と同様に、マーカーは炭水化物ゲル電気泳動で対象サンプルと一緒に流されます。^[36]マーカーは分子量が既知のオリゴ糖で構成されています。対象サンプルと同様に、マーカーも蛍光体（通常は8-アミノナフタレン-1,3,6-トリスルホン酸（ANTS）または2-アミノアクリドン）で誘導体化されます。^[36]