ホットスタートPCR

ホットスタートPCRは、従来のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の改良版であり、室温（またはより低温）での非特異的DNA増幅による不要な産物やプライマーダイマーの存在を低減します。 ^{[1] [2]}より高い収量を達成するために、PCR手順の多くのバリエーションと改良が開発されており、ホットスタートPCRはその1つです。^[3]ホットスタートPCRは、DNAポリメラーゼを使用して一本鎖テンプレートからDNAを合成するという点で、従来のPCRと同じ原理に従います。^{[4]ただし、} Taqポリメラーゼの結合を不活性化または阻害し、Taqポリメラーゼを後から追加するなどの追加の加熱および分離方法を利用して、産物の収量を増やすとともに、より高い特異性と感度を提供します。^{[5]非特異的結合およびプライミングまたはプライマーダイマーの形成は、}変性後に反応混合物を完了させることで最小限に抑えられます。^[6]高温で反応混合物を完成させる方法には、低温でDNAポリメラーゼの活性を阻害する修飾、 ^{[1] [7]}修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）の使用、^[8]および変性後に必須試薬の1つを物理的に添加することが含まれる。^[9]

これらの追加方法により、ホットスタートPCRは、従来のPCRでは依然として問題となっている、低温時に自然に発生する非特異的増幅の量を減らすことができます。これらの変更は、最適なアニーリング温度に達するまで、溶液中の特定の酵素が不活性のままであるか阻害されるように全体的に機能します。^[10]特に初期サイクルでの非特異的PCR産物の形成を阻害すると、PCRによる増幅の感度が大幅に向上します。これは、PCRまたはRT-PCRの診断アプリケーションにおいて非常に重要です。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、特定のDNAセグメントを数桁増幅するために使用される分子生物学技術です。DNAの特定のセグメントは、変性、アニーリング、伸長の3つのプロセスで増幅されます。これらのプロセスでは、温度を室温から最適温度まで上昇させることでDNA鎖が分離され、その後プライマーが結合してポリメラーゼがヌクレオチドをテンプレート鎖に揃えます。低温でわずかに活性なDNAポリメラーゼを使用します。 ^[1]従来のPCRでは、反応ミックスは室温で完了し、DNAポリメラーゼの活性により、プライマーはプライマーダイマーを形成したり、DNAに非特異的にアニールしたりする可能性があります。PCR手順中、DNAポリメラーゼは結合したプライマーを持つDNAの一部を伸長させ、標的産物だけでなく、収率を低下させる非特異的産物も生成します。ホットスタートPCRでは、混合物が特定のアニーリング温度まで加熱されるまで、一部の試薬は分離したままになります。これによりアニーリング時間が短縮され、非特異的DNA伸長の可能性と変性前の非特異的プライマー結合の影響が減少します。^{[6] [5]}

従来のPCRでは、最適なアニーリング温度（50〜65℃）よりも低い温度では、プライマーが核酸に非特異的に結合する非特異的増幅などのオフターゲット修飾が発生します。^[5]混合物中に過剰に存在するこれらの非特異的プライマー複合体は、プライマーダイマーやミスプライミングなどの副産物の合成の原因となります。^[10]ミスプライミングは、増幅のためにターゲット配列と積極的に競合することにより、PCR増幅の効率を大幅に妨げ、低下させます。同様に、プライマーダイマーは複合体を形成し、得られるコピー数増幅の量を減らします。^[10]これは、最適温度に達するまでプライマー伸長をブロックできるホットスタートPCRを実装することで制御できます。^[2]

ホットスタートPCRでは、重要な試薬（DNAポリメラーゼやマグネシウム補因子など）は、物理的分離または化学的修飾によって最適温度に達するまでPCR混合物中で反応しない。^{[5] [2]ホットスタートPCRは、Taqポリメラーゼが阻害/不活性化された場合、またはその添加が最適なアニーリング温度まで遅延された場合、デオキシリボヌクレオチド三リン酸修飾によって、またはケージングおよび}二次構造操作によってプライマーを修飾した場合にも発生する可能性がある。

反応混合物中のDNA濃度が低い場合、DNAテンプレートが非常に複雑な場合、またはPCRに複数のオリゴヌクレオチドプライマーのペアがある場合、ホットスタートPCRは従来のPCRよりも優れたアプローチとなることがよくあります。^[3]

ホットスタートPCRは、低温でのDNAポリメラーゼ伸長を防ぎ、非特異的結合を防ぎ、収量損失を最小限に抑える方法です。ホットスタートPCRは、PCRの加熱ステップまで試薬を制限することで非特異的結合の量を減らし、反応中のTaq DNAポリメラーゼを制限することで早期に反応を制限します。非特異的結合は、プライマーダイマーや誤ったプライミング/偽のプライミングターゲットにつながることがよくあります。^[11]これらは、次のような修正方法によって修正できます。

酵素結合抗体/Taq DNA ポリメラーゼと抗 Taq DNA ポリメラーゼ抗体の複合体:

酵素結合抗体は Taq DNA ポリメラーゼを不活性化します。抗体はポリメラーゼに結合して結合し、低温で起こり得る早期の DNA 増幅を防ぎます。最適なアニーリング温度に達すると、抗体は分解して解離し始め、Taq DNA ポリメラーゼが反応物に放出され、増幅プロセスが開始されます。^{[2] [12]} Platinum Taq DNA ポリメラーゼと AccuStart Taq DNA ポリメラーゼ (どちらも Life Technologies の Ayoub Rashtchian 氏と Quanta BioSciences 氏によってそれぞれ開発) は、市販されている抗体ベースのホットスタート Taq DNA ポリメラーゼの例です。これらの Taq DNA ポリメラーゼは、Taq DNA ポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体の混合物と事前に複合化されています。^[13]

ワックスビーズ:

Taq DNAポリメラーゼとPCR成分の残りの間には、温度に依存するワックスビーズによって物理的なバリアが形成されます。温度が70℃を超えると、最初のサイクルの変性段階でワックスビーズが溶け、Taq DNAポリメラーゼがバリアを通り抜けて反応に放出され、増幅プロセスが開始されます。その後、ワックス層は増幅段階で反応混合物の上部に移動し、後で蒸気バリアとして機能します。^[2]

非常に特異性の高いオリゴヌクレオチド:

オリゴヌクレオチドは、結合しやすい短い核酸ポリマーです。アプタマーなどの非常に特異的なオリゴヌクレオチドは、低温でTaq DNAポリメラーゼに結合し、混合物中で不活性になります。高温でのみ、オリゴヌクレオチドはTaqから分離し、反応できるようになります。^[5]

これらはホットスタートPCRに最も効果的な方法であり、特に酵素結合抗体と高度に特異的なオリゴヌクレオチド法は、より短い不活化時間を必要とする手順に最適です。^[14]ただし、次のような他の方法も実装されていることが知られています。

予熱:

PCR装置は、成分が氷上で混合されている間に事前に加熱され、最適な温度に達したらすぐにPCR装置内に置かれます。これにより、必要なウォームアッププロセスがなくなり、プライマーの非特異的アニーリングが減少し、混合物内のミスペアプライマーが確実に分離されます。^[15]

凍結:

凍結はワックスビーズと同様に物理的な分離の一種として機能します。プライマー、テンプレート鎖、水、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）を含む反応混合物を凍結し、その上にTaqポリメラーゼと残りのPCR成分を加えます。これにより非特異的結合が防止されます。^[15]

Taq のその後の追加:

PCR反応液中の成分はTaqを添加せずに調製され、加熱される。Taqは、最適な温度に達した後に混合物に導入される。しかし、この方法は最も信頼性が低く、成分の汚染につながる可能性がある。^[15]

もう 1 つの方法は、保護基を介してヌクレオチド塩基を修飾するデオキシリボヌクレオチド三リン酸を介したホット スタート PCR です。

ホットスタートdNTPは、3プライム末端に熱感受性保護基を含むように化学的に修飾することができる。この修飾により、最適温度に達するまでヌクレオチドがTaqポリメラーゼと相互作用してテンプレート鎖に結合するのを防ぐことができるため、保護基は熱活性化ステップ中に除去される。ホットスタートdNTP、dA、dT、dC、およびdGは、天然ヌクレオチドを置き換える。^{[16] [17]}修飾ヌクレオチドの4つすべてを使用することが推奨されるが、以前の研究では、天然ヌクレオチドの1つまたは2つを修飾dNTPに置き換えるだけで、非特異的増幅が発生しないことがわかっている。^{[16] [17]}核酸の別の化学修飾は、熱可逆性の共有結合修飾によるもので、これはプライマーと目的のテンプレートのハイブリダイゼーションを妨げる働きをする。グアノシンアミノ基はグリオキサールと相互作用してdGを形成する。^[18]

二次構造:

特定の二次構造はプライマーの機能を妨げる可能性があります。たとえば、ヘアピン構造を持つオリゴヌクレオチドはプライマーとして効率的に機能できません。ただし、反応混合物をアニーリング温度まで加熱すると、プライマーは構造変化を起こし、代わりにプライマーが線状構造を形成するようになり、プライマーがターゲットセグメントに付着してPCRを開始できるようになります。^{[19] [20]}実際には、ヘアピンプライマーには「ダブルバブル」プライマーと呼ばれるより安定した構成があり、これは逆転写とホットスタートPCRの両方に使用できるヘッドツーテールホモダイマー構成を形成します。^[21]

光化学的に除去可能なケージ:

オリゴヌクレオチドプライマーには、ケージドチミジンホスホラミダイトなどの光化学的に除去可能な保護基であるケージング基が組み込まれています。これにより、プライマーの機能は紫外線照射（365 nm）によって活性化および不活性化されます。そのため、プライマーはアニーリング温度に達した後に活性化することができます。^[22]

PCRではマグネシウムが必要であり、Taqポリメラーゼはマグネシウムに依存するため、補因子として機能します。^[23]標準緩衝液試薬のマグネシウムとリン酸の濃度を高めるとマグネシウム沈殿物が生成され、熱サイクリング段階までDNAポリメラーゼ用のマグネシウムがないため、反応のホットスタートが提供されます。熱サイクリング中、マグネシウムは溶液に溶解して戻り、ポリメラーゼが使用できるようになり、正常に機能できるようになります。^[24]

ホットスタートPCRは、取り扱いが少なく、汚染のリスクが低減するという利点があります。ホットスタートPCRは、化学的に修飾されたものと抗体ベースのものがあり、それぞれ手順に異なる利点があります。化学的に修飾されたホットスタートPCRでは、手順を室温で実行でき、PCRプロセスの開始前にプライマーが互いに結合することを防ぎ、非特異的プライミングを制限することでプライマーダイマーの形成を大幅に減らします。同様に、ホットスタートPCRは、プライマーが相同性が低くミスプライミングにつながるテンプレート配列に結合するのを阻害します。また、厳しい条件により特異性と感度が向上し、標的フラグメントの生成物収量も増加します。^{[5]抗体ベースのホットスタートPCRでは、ポリメラーゼはサイクリングプロセス中の最初の変性ステップ後に活性化されるため、必要な時間が短縮されます。これもまた高い}特異性につながります。^[14]

ホットスタートPCRには、その利点とともに、この方法を実施する前に考慮しなければならない制限もあります。ホットスタートPCRでは、従来のPCRに比べて長時間の加熱が必要なため、テンプレートDNAが損傷を受けやすくなります。加熱時間が長くなるため、この手順は、逆転写ステップを実行するために低温を必要とする1チューブ、1バッファー逆転写PCR法などの特定の手順には適合しません。^[12]化学的に改変されたホットスタートPCRでは、第一にポリメラーゼが活性化するために必要な再活性化時間が大幅に長くなるため、第二にターゲットDNAテンプレートの長さが長すぎる場合に、DNAの増幅プロセスに悪影響が出る可能性があります。^[14]抗体ベースの手順では、酵素ごとに異なる抗体が必要になるため、手順を実行するコストが高くなります。^[15]多くの市販のホットスタート酵素は、変性前に実際にある程度の活性があるという証拠もあり、この残留活性のテストに関する情報を提供しているサプライヤーはほとんどありません。^[25]これは、ホットスタート酵素に起因する利点が実現されない可能性があり、せいぜいバッチ間または製造元間で異なる可能性があることを意味します。