ポリメラーゼ連鎖反応

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）は、特定のDNAサンプルを数百万から数十億回迅速に複製するために広く使用されている方法であり、科学者はDNAの非常に小さなサンプル（またはその一部）を十分に増幅して詳細な研究を行うことができます。PCRは、1983年にCetus Corporationのアメリカ人生化学者 Kary Mullisによって発明されました。Mullisと生化学者Michael Smithは、DNAを操作する他の重要な方法を発明し、1993年に共同でノーベル化学賞を受賞しました。 ^[1]

PCRは、古代DNAサンプルの分析や感染性物質の特定など、遺伝子検査や研究で使用される多くの手順の基礎となっています。PCRを使用すると、非常に少量のDNA配列のコピーが一連の温度変化サイクルで指数関数的に増幅されます。PCRは現在、生物医学研究や法医学を含む幅広い用途の医療研究室研究で使用される一般的な、そしてしばしば不可欠な技術です。^{[2] [3]}

PCR 法の大部分は、熱サイクリングに依存しています。熱サイクリングでは、試薬を加熱と冷却のサイクルに繰り返しさらして、さまざまな温度依存反応、具体的にはDNA の融解と酵素によるDNA 複製を可能にします。PCRでは、プライマー(標的 DNA 領域に相補的な配列であるオリゴヌクレオチドと呼ばれる短い一本鎖 DNA 断片) と耐熱性 DNA ポリメラーゼという2 つの主な試薬を使用します。PCR の最初のステップでは、核酸変性と呼ばれるプロセスで、DNA 二重らせんの 2 つの鎖が高温で物理的に分離されます。2 番目のステップでは、温度が下げられ、プライマーが DNA の相補的な配列に結合します。2 つの DNA 鎖は、DNA ポリメラーゼのテンプレートとなり、DNA の構成要素である遊離ヌクレオチドから新しい DNA 鎖を酵素的に組み立てます。PCR が進むにつれて、生成された DNA 自体が複製のテンプレートとして使用され、元の DNA テンプレートが指数関数的に増幅される連鎖反応が開始されます。

PCRのほとんどすべてのアプリケーションでは、もともと好熱性細菌Thermus aquaticusから分離された酵素であるTaqポリメラーゼなどの熱安定性DNAポリメラーゼが使用されています。使用されるポリメラーゼが熱に弱い場合、変性段階の高温下で変性します。Taqポリメラーゼを使用する前は、DNAポリメラーゼをサイクルごとに手動で追加する必要があり、面倒でコストのかかるプロセスでした。^[4]

この技術の応用としては、配列決定のためのDNAクローニング、遺伝子クローニングと操作、遺伝子変異誘発、DNAに基づく系統樹の構築、または遺伝子の機能解析、遺伝性疾患の診断とモニタリング、古代DNAの増幅、^[5] DNAプロファイリングのための遺伝子指紋の分析（例えば、法医学や親子鑑定）、感染症の診断のための核酸検査における病原体の検出などがあります。

PCRはDNA鎖の特定の領域（DNAターゲット）を増幅します。ほとんどのPCR法では、長さ0.1～10キロ塩基対（kbp）のDNA断片を増幅しますが、一部の技術では最大40kbpの断片を増幅できます。^[6]増幅産物の量は反応中の利用可能な基質によって決まり、反応が進むにつれて制限されます。^[7]

基本的なPCRセットアップには、次のようないくつかのコンポーネントと試薬が必要です^[8]。

• 増幅するDNA標的領域を含むDNAテンプレート
• DNAポリメラーゼ;新しいDNA鎖を重合する酵素。耐熱性のTaqポリメラーゼは特に一般的であり、^[9]高温のDNA変性プロセス中に無傷のままである可​​能性が高いためである。
• DNA標的のセンス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれの3'末端（3プライム末端）に相補的な2つのDNAプライマー（DNAポリメラーゼはDNAの二本鎖領域にのみ結合して伸長することができる。プライマーがなければ、ポリメラーゼが結合できる二本鎖開始部位が存在しない）^[10] DNA標的領域に相補的な特定のプライマーが事前に選択され、多くの場合、研究室でカスタムメイドされるか、商業的な生化学サプライヤーから購入される。
• デオキシヌクレオシド三リン酸、または dNTP（「デオキシヌクレオチド三リン酸」と呼ばれることもある。三リン酸基を含むヌクレオチド）。DNA ポリメラーゼが新しい DNA 鎖を合成するための構成要素である。
• DNAポリメラーゼの最適な活性と安定性に適した化学環境を提供する緩衝液
• 二価陽 イオン、典型的にはマグネシウム（Mg）またはマンガン（Mn）イオン。Mg ²⁺が最も一般的ですが、 ^{Mn 2+}濃度が高いとDNA合成中のエラー率が増加するため、 PCRによるDNA変異誘発にはMn ^2+を使用できます^{。 [11]}および一価陽イオン、典型的にはカリウム（K）イオン^{[より良い情報源が必要]}

反応は、通常、サーマルサイクラーの小さな反応チューブ（0.2～0.5 mL 容量）で10～200 μLの容量で行われます 。サーマルサイクラーは、反応チューブを加熱および冷却して、反応の各ステップで必要な温度を実現します（下記参照）。多くの最新のサーマルサイクラーはペルチェ素子を使用しており、デバイスの電流を逆転させるだけで、PCR チューブを保持するブロックの加熱と冷却の両方が可能です。壁の薄い反応チューブは熱伝導率が高く、急速な熱平衡を可能にします。ほとんどのサーマルサイクラーには、反応チューブの上部での結露を防ぐために加熱蓋が付いています。加熱蓋のない古いサーマルサイクラーでは、反応混合物の上に油の層を塗るか、チューブ内にワックスのボールを入れる必要があります。^[要出典]

通常、PCR は、熱サイクルと呼ばれる 20～40 回の一連の温度変化の繰り返しで構成され、各サイクルは一般に 2 つまたは 3 つの個別の温度ステップで構成されます (下の図を参照)。サイクルの前には、多くの場合、非常に高い温度 (>90 °C (194 °F)) での単一の温度ステップが行われ、最後に最終生成物の伸長または短時間の保管のために 1 回保持されます。各サイクルで使用される温度と適用される時間の長さは、DNA 合成に使用される酵素、反応中の二価イオンと dNTP の濃度、プライマーの融解温度( T _m ) など、さまざまなパラメーターによって異なります。^[12]ほとんどの PCR 方法に共通する個々のステップは次のとおりです。

• 初期化：このステップは、ホットスタートPCRによる熱活性化を必要とするDNAポリメラーゼにのみ必要です。^[13]反応チャンバーを94〜96℃（201〜205℉）の温度に加熱するか、非常に耐熱性の高いポリメラーゼを使用する場合は98℃（208℉）に加熱し、1〜10分間保持します。^[要出典]
• 変性: このステップは最初の通常のサイクル イベントであり、反応チャンバーを 94～98 °C (201～208 °F) で 20～30 秒間加熱します。これにより、相補塩基間の水素結合が切断され、二本鎖 DNA テンプレートのDNA が融解、つまり変性し、2 つの一本鎖 DNA 分子が生成されます。
• アニーリング: 次のステップでは、反応温度を 50～65 °C (122～149 °F) に下げて 20～40 秒間保持し、プライマーを各一本鎖 DNA テンプレートにアニーリングさせます。反応混合物には通常、2 つの異なるプライマーが含まれます。1 つは、ターゲット領域を含む 2 つの一本鎖補完配列のそれぞれに 1 つです。プライマー自体は一本鎖配列ですが、ターゲット領域の長さよりもはるかに短く、各鎖の 3' 末端の非常に短い配列のみを補完します。 ^{[引用が必要]}

アニーリング温度は効率と特異性に大きく影響するため、アニーリングステップの適切な温度を決定することは非常に重要です。この温度は、プライマーが鎖にハイブリダイズできる程度に低く、ハイブリダイズが特異的である程度に高くなければなりません。つまり、プライマーは鎖の完全に相補的な部分にのみ結合し、他の部分には結合しない必要があります。温度が低すぎると、プライマーは不完全に結合します。温度が高すぎると、プライマーはまったく結合しません。一般的なアニーリング温度は、使用するプライマーのT _mより約 3～5 °C 低い温度です。相補的な塩基間の安定した水素結合は、プライマー配列がテンプレート配列と非常によく一致する場合にのみ形成されます。このステップでは、ポリメラーゼがプライマーとテンプレートのハイブリッドに結合し、DNA の形成を開始します。^{[引用が必要]}

• 伸長/伸長: このステップの温度は使用する DNA ポリメラーゼによって異なります。耐熱性 DNA ポリメラーゼであるTaqポリメラーゼの最適活性温度は約 75～80 °C (167～176 °F) ですが、 ^{[14] [15]、}この酵素では 72 °C (162 °F) の温度が一般的に使用されます。このステップでは、DNA ポリメラーゼは、反応混合物からテンプレートに相補的な遊離 dNTP を 5 ' から 3' の方向に添加し、dNTP の5'リン酸基を新生 (伸長) DNA 鎖の末端の 3'ヒドロキシ基と縮合させることで、DNA テンプレート鎖に相補的な新しい DNA 鎖を合成します。伸長に必要な正確な時間は、使用する DNA ポリメラーゼと、増幅する DNA ターゲット領域の長さの両方によって異なります。経験則として、最適な温度では、ほとんどの DNA ポリメラーゼは 1 分間に 1,000 塩基を重合します。最適な条件 (つまり、制限的な基質や試薬による制限がない場合) では、各伸長/伸長ステップで DNA ターゲット シーケンスの数が 2 倍になります。各連続サイクルで、元のテンプレート ストランドと新しく生成されたすべてのストランドが次の伸長ラウンドのテンプレート ストランドになり、特定の DNA ターゲット領域の指数関数的 (幾何学的) 増幅が起こります。^{[引用が必要]}

変性、アニーリング、伸長のプロセスは 1 つのサイクルを構成します。DNA ターゲットを数百万のコピーに増幅するには、複数のサイクルが必要です。所定のサイクル数の後に形成される DNA コピーの数を計算する式は 2 ⁿです( nはサイクル数)。したがって、30 サイクルに設定された反応では、元の二本鎖 DNA ターゲット領域のコピーが 2 ³⁰、つまり 1,073,741,824 個生成されます。

• 最終伸長: この単一ステップはオプションですが、最後の PCR サイクル後に 5 ～ 15 分間、70 ～ 74 °C (158 ～ 165 °F) (PCR で使用されるほとんどのポリメラーゼの最適な活性に必要な温度範囲) で実行され、残っている一本鎖 DNA が完全に伸長されていることを確認します。
• 最終ホールド: 最終ステップでは、反応チャンバーを 4～15 °C (39～59 °F) に無期限に冷却し、PCR 産物の短期保存に使用できます。

PCR によって予想された DNA ターゲット領域 (アンプリマーまたはアンプリコンとも呼ばれる) が正常に生成されたかどうかを確認するには、 PCR 産物のサイズを分離するためにアガロース ゲル電気泳動を使用します。PCR 産物のサイズは、既知のサイズの DNA 断片を含む分子量マーカーであるDNA ラダーとの比較によって決定され、PCR 産物とともにゲル上を移動します。

他の化学反応と同様に、PCR の反応速度と効率は制限要因の影響を受けます。したがって、PCR プロセス全体は、反応の進行に基づいてさらに 3 つの段階に分けられます。

• 指数関数的増幅：サイクルごとに、生成物の量は2倍になります（反応効率が100％であると仮定）。30サイクル後、DNAの1つのコピーは1,000,000,000（10億）コピーまで増加します。つまり、ある意味では、個別のDNA鎖の複製が制御された条件下でチューブ内で操作されていることになります。^[16]この反応は非常に敏感で、微量のDNAしか存在しなくてもよいのです。
• 安定化段階: DNA ポリメラーゼの活性が低下し、dNTP やプライマーなどの試薬の消費が制限されるようになるため、反応が遅くなります。
• プラトー: 試薬と酵素が枯渇したため、生成物が蓄積されなくなります。

実際には、PCRは感度や汚染などさまざまな理由で失敗する可能性があります。^{[17] [18]外来DNAによる} 汚染は偽造品につながる可能性があり、PCR前の混合物を潜在的なDNA汚染物質から分離する実験室プロトコルと手順で対処されます。^[8]たとえば、犯罪現場のDNAを分析する場合、研究室の人員のDNA分子1つが増幅され、捜査を誤らせる可能性があります。したがって、PCRセットアップエリアは他のPCR製品の分析や精製エリアから分離され、使い捨てのプラスチック器具が使用され、反応セットアップ間の作業面は徹底的に洗浄する必要があります。

特異性は実験条件によって調整できるため、偽の産物が生成されません。プライマー設計技術は、PCR産物の収量を改善し、非特異的な産物の形成を回避する上で重要です。代替のバッファー成分またはポリメラーゼ酵素を使用すると、DNAの長い領域や問題のある領域の増幅に役立ちます。たとえば、Q5ポリメラーゼはTaqポリメラーゼよりも約280倍エラーが発生しにくいと言われています。^{[19] [20]実行パラメータ（温度やサイクル期間など）または}ホルムアミドなどの試薬の添加の両方により、PCRの特異性と収量が向上する可能性があります。^{[21]理論的なPCR結果（}電子PCR ）のコンピューターシミュレーションを実行して、プライマー設計を支援することができます。^[22]

PCR は、DNA の特定の領域を選択的に増幅することで、ゲノム DNA から DNA 断片を分離することを可能にします。PCR を使用すると、サザンハイブリダイゼーションやノーザン ハイブリダイゼーション、DNA クローニング用のハイブリダイゼーション プローブの生成など、特定の DNA 領域を表す大量の DNA を必要とするさまざまな方法で使用できます。PCR はこれらの技術に大量の純粋な DNA を供給し、非常に少量の開始材料からでも DNA サンプルを分析できます。^{[引用が必要]}

PCR の他の用途としては、増幅プライマーの 1 つをサンガー配列決定に使用できる未知の PCR 増幅配列を決定するための DNA 配列決定、プラスミド、ファージ、コスミド(サイズによって異なる) または他の生物の遺伝物質への DNA 配列の挿入を伴う組み換え DNA 技術を促進するための DNA 配列の分離などがある。細菌コロニー(大腸菌など)は、PCR によって正しい DNAベクター構成を迅速にスクリーニングできる。^{[23] PCR は、}遺伝子指紋法にも使用されることがある。遺伝子指紋法は、異なる PCR ベースの方法で実験 DNA を比較することにより、人物または生物を識別するために使用される法医学的手法である。^[要出典]

いくつかのPCRフィンガープリント法は高い識別力を持ち、親子や兄弟など個人間の遺伝的関係を識別するために使用でき、父子鑑定に使用されます（図4）。この技術は、特定の分子時計（微生物の16S rRNAおよびrecA遺伝子など）を使用すると、生物間の進化的関係を決定するためにも使用できます。^[24]

PCRは標的とするDNA領域を増幅するため、非常に少量のサンプルを分析するために使用できます。これは、証拠として微量のDNAしか利用できない場合の法医学分析にとって非常に重要です。PCRは、数万年前の古代DNAの分析にも使用できます。これらのPCRベースの技術は、4万年前のマンモスなどの動物や人間のDNAに使用され、エジプトのミイラの分析からロシア皇帝やイギリス王リチャード3世の遺体の身元確認まで、さまざまな用途に使用されています。^[25]

定量PCRまたはリアルタイムPCR（qPCR、^[26] RT-PCRと混同しないでください）法では、サンプル中に存在する特定の配列の量を推定することができます。これは、遺伝子発現のレベルを定量的に決定するためによく適用される技術です。定量PCRは、PCR増幅の各ラウンドの後にDNA産物の蓄積を測定するDNA定量化のための確立されたツールです。

qPCR は、合成プロセスが行われている間に濃度を測定するため、特定の DNA 配列をリアルタイムで定量および検出できます。同時検出と定量には 2 つの方法があります。最初の方法は、二重鎖の間に非特異的に保持される蛍光染料を使用する方法です。2 番目の方法は、特定の配列をコードし、蛍光標識されたプローブを使用します。これらの方法を使用した DNA の検出は、プローブとその相補 DNA (cDNA) のハイブリダイゼーションが行われた後にのみ確認できます。興味深い技術の組み合わせは、リアルタイム PCR と逆転写です。RT-qPCR と呼ばれるこの高度な技術により、少量の RNA を定量できます。この組み合わせた技術により、mRNA は cDNA に変換され、qPCR を使用してさらに定量されます。この技術により、PCR のエンドポイントでのエラーの可能性が低くなり、^[27]がんなどの遺伝性疾患に関連する遺伝子を検出する可能性が高まります。^[5]研究室では、遺伝子調節を高感度で測定するために RT-qPCR を使用しています。 PCR ^[28]とRT-qPCR ^[29]の信頼性の高い定量化のための数学的基礎は、研究、医療、診断、感染症のアプリケーションにおける実験データの正確なフィッティング手順の実装を容易にします。^{[30] [31] [32] [33]}

将来の親が遺伝子キャリアであるかどうかの検査を受ける場合もあれば、その子供が実際に病気に罹患しているかどうかの検査を受ける場合もあります。^[2]出生前検査用のDNAサンプルは、羊水穿刺、絨毛膜絨毛採取、さらには母親の血流中を循環している希少胎児細胞の分析によっても得られます。PCR分析は、発育中の胚の個々の細胞に変異がないか検査する 着床前遺伝子診断にも不可欠です。

• PCRは、臓器移植に不可欠な組織型判定の感度の高い検査の一部としても使用できます。2008年現在、従来の抗体ベースの血液型検査をPCRベースの検査に置き換える提案さえあります。 ^{[34][アップデート]}
• 多くのがんには、がん遺伝子の変異が関与している。PCR ベースの検査を使用してこれらの変異を調べることで、治療計画を患者ごとにカスタマイズできる場合がある。PCR は白血病やリンパ腫などの悪性疾患の早期診断を可能にし、現在がん研究で最も発達しており、すでに日常的に使用されている。PCR アッセイはゲノム DNA サンプルに対して直接実行でき、転座特異的な悪性細胞を他の方法よりも少なくとも 10,000 倍高い感度で検出できる。^[35] PCR は、腫瘍抑制因子の分離と増幅を可能にするため、医療分野で非常に有用である。たとえば、定量的 PCR は、単一細胞を定量化して分析するだけでなく、DNA、mRNA、タンパク質の確認と組み合わせを認識するために使用できる。^[27]

PCRは、細菌やウイルスによって引き起こされるものも含め、感染症の迅速かつ高度に特異的な診断を可能にする。^{[36] PCRはまた、}組織培養アッセイや動物モデルからの結核菌、嫌気性細菌、ウイルスなどの培養不可能または増殖の遅い微生物の同定も可能にする。微生物学におけるPCR診断応用の基礎は、感染性因子の検出と、特定の遺伝子による病原性株と非病原性株の区別である。^{[36] [37]}

PCR によって、感染症生物の特性評価と検出は次のように革命的に変化しました。

• ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、発見して根絶するのが難しいターゲットです。感染の最も初期の検査は、血流中を循環するウイルスに対する抗体の存在に依存していました。しかし、抗体は感染後何週間も経たないと現れず、母親の抗体は新生児の感染を隠し、感染と戦う治療薬は抗体に影響を与えません。50,000を超える宿主細胞のDNAからわずか1つのウイルスゲノムを検出できるPCR検査が開発されました。 ^{[38]感染をより早く検出し、献血された血液を直接ウイルス検査し、新生児の感染を直ちに検査し、抗ウイルス治療の効果}を定量化することができます。
• 結核などの病原菌は患者から採取するのが難しく、実験室で増殖させるのに時間がかかります。PCR ベースの検査により、便利なサンプルで少数の病原菌 (生菌と死菌の両方) を検出できるようになりました。詳細な遺伝子分析を使用して抗生物質耐性を検出し、即時かつ効果的な治療を行うこともできます。治療の効果もすぐに評価できます。
• 家畜や野生動物の集団を通じた病原体の拡散は、PCR 検査によって監視できます。多くの場合、新しい毒性サブタイプの出現を検出し、監視できます。以前の流行の原因となった病原体のサブタイプも、PCR 分析によって特定できます。
• ウイルスDNAはPCRで検出できる。使用するプライマーはウイルスDNAの標的配列に特異的でなければならず、PCRは診断分析やウイルスゲノムのDNA配列決定に使用できる。PCRの高感度により、感染直後、さらには発症前にウイルスを検出することができる。^[36]このような早期検出により、医師は治療にかなりのリードタイムを割くことができる。患者のウイルス量（「ウイルス量」）もPCRベースのDNA定量技術で定量できる（下記参照）。PCRの変種（ RT-PCR）は、DNAではなくウイルスRNAを検出するために使用される。この検査では、逆転写酵素を使用してウイルスRNAと一致するDNA配列を生成し、このDNAを通常のPCR法に従って増幅する。RT-PCRは、SARS-CoV-2ウイルスゲノムの検出に広く使用されている。^[39]
• 百日咳などの病気は、百日咳菌によって引き起こされます。この菌は重篤な急性呼吸器感染症を特徴とし、さまざまな動物や人間に感染し、多くの幼児の死につながっています。百日咳毒素はタンパク質外毒素で、2つの二量体によって細胞受容体に結合し、細胞免疫の役割を果たすTリンパ球などのさまざまな細胞型と反応します。^[40] PCRは、百日咳毒素の遺伝子内の配列を検出できる重要な検査ツールです。PCRは毒素に対する感度が高く、ターンアラウンドタイムが短いため、培養に比べて百日咳の診断に非常に効率的です。^[41]

PCR ベースの遺伝子(またはDNA ) 指紋採取プロトコルの開発は、法医学の分野で広く応用されています。

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  最も識別力の高い形態では、遺伝子指紋鑑定は世界中の全人口から特定の人物を一意に識別することができます。犯罪現場から DNA の微小なサンプルを分離し、容疑者の DNA サンプルや、以前の証拠や有罪判決を受けた者のDNA データベースと比較することができます。これらの検査の簡易版は、犯罪捜査中に容疑者を迅速に除外するためによく使用されます。数十年前の犯罪の証拠を検査して、当初有罪判決を受けた人物の無罪または無罪を確定することができます。
• 法医学的DNAタイピングは、犯罪現場で発見された証拠を分析することで、犯罪容疑者を特定または無罪とする効果的な方法となっている。ヒトゲノムには、遺伝子配列内またはゲノムの非コード領域に見られる反復領域が多数ある。具体的には、ヒトDNAの最大40％が反復している。^[5]ゲノム内のこれらの反復非コード領域には、2つの異なるカテゴリがある。最初のカテゴリは可変数タンデムリピート（VNTR）と呼ばれ、長さは10〜100塩基対で、2番目のカテゴリは短いタンデムリピート（STR）と呼ばれ、繰り返される2〜10塩基対のセクションで構成される。PCRは、各反復領域を挟むプライマーを使用して、いくつかのよく知られたVNTRとSTRを増幅するために使用される。各STRについて個人から得られた断片のサイズは、どの対立遺伝子が存在するかを示す。個人の複数のSTRを分析することで、統計的にユニークである可能性が高い各人の対立遺伝子のセットが見つかります。^[5]研究者はヒトゲノムの完全な配列を特定しました。この配列はNCBIのウェブサイトから簡単にアクセスでき、多くの実際のアプリケーションで使用されています。たとえば、FBIは識別に使用されるDNAマーカーサイトのセットをコンパイルしており、これらはCombined DNA Index System（CODIS）DNAデータベースと呼ばれています。^[5]このデータベースを使用すると、統計分析を使用してDNAサンプルが一致する確率を判断できます。PCRは、法医学的DNAタイピングに使用する非常に強力で重要な分析ツールです。研究者は分析に使用するターゲットDNAのごく少量しか必要としないためです。たとえば、毛包が付いた人間の髪の毛1本には、分析を行うのに十分なDNAが含まれています。同様に、数本の精子、爪の下の皮膚サンプル、または少量の血液から、決定的な分析に十分なDNAが得られます。^[5]
• あまり差別的でない形式のDNA 指紋採取は、個人を近親者と照合するDNA 親子鑑定に役立ちます。身元不明の遺体から採取した DNA を検査し、可能性のある親、兄弟、または子供の DNA と比較することができます。同様の検査は、養子 (または誘拐) された子供の実の親を確認するために使用できます。新生児の実際の実の父親を確認(または除外) することもできます。
• PCR AMGX/AMGY設計は、非常に微量のゲノムからDNA配列を増幅するのに役立つだけでなく^{（説明が必要）}、法医学的骨サンプルからリアルタイムで性別を判定するためにも使用できることが示されています。これは、法医学的ケースや古代の標本で性別を判定するための強力で効果的な方法を提供します。^[42]

PCR は分子遺伝学の多くの研究分野に応用されてきました。

• PCR では、2 つのプライマーの配列しかわかっていない場合でも、短い DNA 片を迅速に生成できます。PCR のこの機能により、サザン ブロット ハイブリダイゼーションやノーザンブロット ハイブリダイゼーション用のハイブリダイゼーション プローブの生成など、多くの方法が強化されます。PCR では、大量の純粋な DNA (場合によっては 1 本鎖) をこれらの手法に供給できるため、非常に少量の開始材料からでも分析が可能になります。
• DNA 配列決定の作業も PCR によって補助されます。遺伝子疾患の突然変異を持つ患者から、既知の DNA セグメントを簡単に生成できます。増幅技術の改良により、まったく未知のゲノムからセグメントを抽出したり、関心領域の 1 本の鎖だけを生成したりすることができます。
• PCR は、 DNA クローニングのより伝統的なプロセスに多くの用途があります。PCR は、少量しか入手できない可能性のあるより大きなゲノムからベクターに挿入するセグメントを抽出できます。また、1 セットの「ベクター プライマー」を使用して、ベクターにすでに挿入されているフラグメントを分析または抽出することもできます。PCR プロトコルにいくつかの変更を加えると、挿入されたフラグメントの突然変異 (一般的な突然変異または部位特異的突然変異) が発生する可能性があります。
• シーケンスタグ付きサイトは、 PCR を、ゲノムの特定のセグメントが特定のクローン内に存在することを示す指標として使用するプロセスです。ヒトゲノムプロジェクトでは、このアプリケーションが、シーケンス中のコスミドクローンのマッピングと、さまざまな研究室からの結果の調整に不可欠であることがわかりました。
• PCRの応用例としては、ネアンデルタール人の骨、マンモスの凍結組織、エジプトのミイラの脳など古代のDNAの系統解析が挙げられます。 ^[16]場合によっては、これらのDNAの高度に分解されたDNAが増幅の初期段階で再構築されることもあります。
• PCR の一般的な用途は、遺伝子発現のパターンの研究です。組織 (または個々の細胞) をさまざまな段階で分析して、どの遺伝子がアクティブになったか、またはどの遺伝子がオフになっているかを確認できます。この用途では、定量的 PCR を使用して実際の発現レベルを定量化することもできます。
• PCRは個々の精子から複数の遺伝子座を同時に増幅する能力があり^[43]、減数分裂後の染色体交差を研究することで、遺伝子マッピングというより伝統的な作業を大幅に強化しました。非常に近い遺伝子座間のまれな交差イベントは、何千もの個々の精子を分析することで直接観察されています。同様に、異常な欠失、挿入、転座、または逆位も、受精、胚形成などの長くて面倒なプロセスを待つことなく（または費用をかけずに）分析できます。
• 部位特異的突然変異誘発: PCR は、科学者が自由に選択した突然変異を持つ変異遺伝子を作成するために使用できます。これらの突然変異は、タンパク質がどのように機能を果たすかを理解するため、およびタンパク質の機能を変更または改善するために選択できます。

PCR には多くの利点があります。理解も使用も非常に簡単で、結果も迅速に得られます。この技術は非常に感度が高く、特定の産物を数百万から数十億コピーして、配列決定、クローニング、分析に使用できます。qRT-PCR は PCR と同じ利点を持ちますが、合成された産物を定量化できるという利点もあります。そのため、腫瘍、微生物、その他の疾患状態における遺伝子発現レベルの変化を分析するのに使用できます。^[27]

PCR は非常に強力で実用的な研究ツールです。多くの病気の未知の病因の配列は PCR によって解明されています。この技術は、既知のウイルスに関連する未知のウイルスの配列を特定し、病気自体をより深く理解するのに役立ちます。手順がさらに簡素化され、感度の高い非放射測定検出システムが開発されれば、PCR は今後何年も臨床検査室で重要な位置を占めることになります。^[16]

PCRの大きな制限の1つは、選択的な増幅を可能にするプライマーを生成するために、標的配列に関する事前情報が必要であることです。^[27]これは、通常、PCRユーザーは、DNAポリメラーゼがプライマーテンプレートハイブリッドに適切に結合し、その後DNA合成中に標的領域全体を生成することを保証するために、2つの一本鎖テンプレートのそれぞれにおける標的領域の上流の正確な配列を知っておく必要があることを意味します。^[要出典]

すべての酵素と同様に、DNAポリメラーゼもエラーを起こしやすく、その結果、生成されたPCR断片に変異が生じます。^[44]

PCRのもう一つの限界は、汚染されたDNAがごく少量でも増幅され、誤解を招く、または曖昧な結果をもたらす可能性があることである。汚染の可能性を最小限に抑えるために、研究者は試薬の準備、PCR、および生成物の分析のために別々の部屋を用意する必要がある。試薬は使い捨てのアリコートに分配する必要がある。使い捨てのプランジャーと非常に長いピペットチップを備えたピペッターを日常的に使用する必要がある。 ^[16]さらに、ラボのセットアップが一方向のワークフローに従うようにすることが推奨される。PCR室と分析室で使用された材料や試薬は、徹底した汚染除去を行わずにPCR準備室に持ち込んではならない。^[45]

フミン酸を含む環境サンプルはPCR増幅を阻害し、不正確な結果につながる可能性があります。^[要出典]

• 対立遺伝子特異的PCRまたは増幅難治性変異システム（ARMS）：一塩基変異（SNV、SNPと混同しないでください）（患者における一塩基の差異）に基づく診断またはクローニング技術。一塩基の変化を伴う突然変異は、このシステムで検出できます。対立遺伝子間の差異を含むDNA配列の事前知識が必要であり、3 '末端がSNV（通常、SNVの周囲の塩基対バッファーが組み込まれている）を囲むプライマーを使用します。^[46] 厳格な条件下でのPCR増幅は、テンプレートとプライマーの間に不一致があると効率が大幅に低下するため、SNP特異的プライマーによる増幅が成功すると、特定のSNPまたは配列内の小さな欠失の存在が示されます。^[47]詳細については、SNPジェノタイピングを参照してください。
• アセンブリPCRまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリ（PCA）：短い重複セグメントを持つ長いオリゴヌクレオチドのプールに対してPCRを実行することにより、長いDNA配列を人工的に合成する。オリゴヌクレオチドはセンス方向とアンチセンス方向を交互に繰り返し、重複セグメントがPCRフラグメントの順序を決定し、それによって最終的な長いDNA産物を選択的に生成する。 ^[48]
• 非対称PCR : 二本鎖DNAテンプレートの1本のDNA鎖を優先的に増幅します。これは、2本の相補鎖のうち1本のみの増幅が必要なシーケンシングおよびハイブリダイゼーションプローブに使用されます。PCRは通常どおり実行されますが、増幅対象の鎖に対してプライマーを大量に使用します。制限プライマーが使い果たされた後の反応後半では増幅が遅くなるため(算術的)、PCRの追加サイクルが必要になります。 [ 49 ^]このプロセスの最近の改良版である線形指数PCR (LATE-PCR)では、制限プライマーの濃度が反応途中で低下しても反応効率を維持するために、過剰プライマーよりも融点(Tm)の高い制限プライマーを使用します_。 [ 50 ^]
• 対流PCR：PCRを実行する擬似等温法。PCR混合物を繰り返し加熱および冷却する代わりに、溶液に温度勾配をかけます。その結果生じる熱不安定性によって生じる対流により、PCR試薬が高温領域と低温領域から自動的にシャッフルされ、PCRが繰り返し実行されます。^[51]熱境界条件やPCRエンクロージャの形状などのパラメータは、カオスフローフィールドの出現を利用することで、堅牢で迅速なPCRを実現するために最適化できます。^[52]このような対流PCRセットアップにより、デバイスの電力要件と動作時間が大幅に削減されます。
• ダイヤルアウトPCR：遺伝子合成のための正確なDNA分子を取得するための高度に並列化された方法。DNA分子の複雑なライブラリは、大規模な並列シーケンシングの前に、固有の隣接タグで修飾されます。その後、タグ指向プライマーにより、PCRによって目的の配列を持つ分子を取得できます。^[53]
• デジタル PCR (dPCR) : DNA サンプル内のターゲット DNA 配列の量を測定するために使用されます。DNA サンプルは高度に希釈されているため、多数の PCR を並行して実行した後、一部の PCR ではターゲット DNA の分子が 1 つも検出されません。ターゲット DNA の濃度は、陰性結果の割合を使用して計算されます。そのため、「デジタル PCR」という名前が付けられています。
• ヘリカーゼ依存性増幅：従来のPCRに似ていますが、変性とアニーリング/伸長サイクルを繰り返すのではなく、一定の温度を使用します。熱変性の代わりに、DNAをほどく酵素であるDNAヘリカーゼが使用されます。 ^[54]
• ホットスタートPCR：PCRの初期セットアップ段階での非特異的増幅を減らす技術。ポリメラーゼを添加する前に、反応成分を変性温度（例：95℃）まで加熱することで手動で実行できます。 ^[55]抗体の結合^{[13] [56]}または高温活性化ステップ後にのみ解離する共有結合阻害剤の存在によって、室温でポリメラーゼの活性を阻害する特殊な酵素システムが開発されています。ホットスタート/コールドフィニッシュPCRは、室温では不活性で、伸長温度で即座に活性化される新しいハイブリッドポリメラーゼによって実現されます。
• インシリコPCR（デジタルPCR、バーチャルPCR、エレクトロニックPCR、e-PCR）は、与えられたプライマー（プローブ）のセットを使用して、配列決定されたゲノムまたはトランスクリプトームからDNA配列を増幅し、理論的なポリメラーゼ連鎖反応の結果を計算するために使用される計算ツールを指します。インシリコPCRは、分子生物学の教育ツールとして提案されました。 ^[57]
• インターシーケンス特異的PCR（ISSR）：単純な配列反復間の領域を増幅し、増幅された断片長の固有の指紋を生成するDNAフィンガープリントのためのPCR法。^[58]
• 逆PCR ：ゲノム挿入物の周囲の配列を識別するために一般的に使用されます。一連のDNA消化と自己連結反応を伴い、未知の配列の両端に既知の配列が生じます。 ^[59]
• ライゲーション媒介PCR ：目的のDNAに連結された小さなDNAリンカーと、DNAリンカーにアニーリングする複数のプライマーを使用する。DNAシーケンシング、ゲノムウォーキング、DNAフットプリント法に使用されている。^[60]
• メチル化特異的PCR（MSP）：ジョンズホプキンス大学医学部のスティーブン・ベイリンとジェームズ・G・ハーマンによって開発され、 ^[61]ゲノムDNAのCpGアイランドのメチル化を検出するために使用されます。DNAは最初に亜硫酸水素ナトリウムで処理され、メチル化されていないシトシン塩基がウラシルに変換され、PCRプライマーによってチミンとして認識されます。次に、プライマー配列内のCpGアイランドを除いて同一のプライマーセットを使用して、改変されたDNAに対して2回のPCRが実行されます。これらのポイントでは、1つのプライマーセットはシトシンを含むDNAを認識してメチル化DNAを増幅し、もう1つのセットはウラシルまたはチミンを含むDNAを認識してメチル化されていないDNAを増幅します。qPCRを使用したMSPは、メチル化に関する定性的情報ではなく定量的情報を取得するために実行することもできます。
• ミニプライマーPCR : 9または10ヌクレオチドの短いプライマー（「スモールゴ」）から伸長できる耐熱性ポリメラーゼ（S-Tbr）を使用する。この方法は、より小さなプライマー結合領域をPCRの標的とすることを可能にし、16S（または真核生物の18S）rRNA遺伝子などの保存されたDNA配列を増幅するために使用される。^[62]
• マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（ MLPA）：単一のプライマーペアで複数のターゲットを増幅できるため、マルチプレックスPCRの解像度の制限を回避できます（以下を参照）。
• マルチプレックス PCR : 単一の PCR 混合物内に複数のプライマー セットが含まれており、さまざまな DNA 配列に固有のさまざまなサイズのアンプリコンを生成します。一度に複数の遺伝子をターゲットにすることで、1 回のテスト実行で追加情報を得ることができます。通常は、数倍の試薬と長い実行時間が必要になります。各プライマー セットのアニーリング温度は、1 回の反応で正しく機能するように最適化する必要があります。また、アンプリコンのサイズも最適化する必要があります。つまり、ゲル電気泳動で視覚化したときに明確なバンドを形成できるほど、塩基対の長さが異なっている必要があります。
• ナノ粒子支援PCR（ナノPCR）：一部のナノ粒子（NP）はPCRの効率を高めることができ（そのためナノPCRと呼ばれています）、中には元のPCRエンハンサーよりも優れた性能を発揮するものさえあります。量子ドット（QD）はPCRの特異性と効率を改善できることが報告されています。単層カーボンナノチューブ（SWCNT）と多層カーボンナノチューブ（MWCNT）は、ロングPCRの増幅を高めるのに効果的です。カーボンナノパウダー（CNP）は反復PCRとロングPCRの効率を改善し、酸化亜鉛、二酸化チタン、Ag NPはPCR収量を増加させることがわかりました。以前のデータでは、非金属NPは許容できる増幅忠実度を維持していることが示されています。多くのNPがPCR効率を高めることができることを考えると、ナノPCR技術の改善と製品開発に大きな可能性があることは明らかです。^{[63] [64]}
• ネスト PCR : DNA の非特異的増幅によるバックグラウンドを減らすことで、DNA 増幅の特異性を高めます。2 セットのプライマーが 2 つの連続した PCR で使用されます。最初の反応では、1 組のプライマーを使用して DNA 産物を生成しますが、これは目的のターゲット以外に、非特異的に増幅された DNA フラグメントで構成される場合があります。次に、この産物は、結合部位が最初の反応で使用された各プライマーと完全にまたは部分的に異なり、3' に位置するプライマー セットを使用した 2 番目の PCR で使用されます。ネスト PCR は、従来の PCR よりも長い DNA フラグメントを特異的に増幅する効果が高いことがよくありますが、ターゲット シーケンスに関するより詳細な知識が必要です。
• オーバーラップ伸長PCRまたはオーバーラップ伸長によるスプライシング（SOEing）：相補的な配列を含む2つ以上のDNA断片をつなぎ合わせるために使用される遺伝子工学技術。遺伝子、調節配列、または突然変異を含むDNA断片を結合するために使用され、この技術により、特定の長いDNA構造を作成できます。また、DNA配列に欠失、挿入、または点突然変異を導入することもできます。 ^{[65] [66]}
• PAN-AC：増幅に等温条件を使用し、生きた細胞で使用できる。^{[67] [68]}
• PAN-PCR：全ゲノム配列データに基づいて細菌型判定アッセイを設計するための計算手法。^[69]
• 定量的 PCR (qPCR): ターゲット配列の量を測定するために使用されます (通常はリア​​ルタイム)。これは、DNA、cDNA、または RNA の開始量を定量的に測定します。定量的 PCR は、サンプル内に DNA 配列が存在するかどうか、およびサンプル内のそのコピー数を決定するために一般的に使用されます。定量的PCR は、非常に高い精度を備えています。定量的 PCR 法では、Sybr Green、EvaGreen などの蛍光色素、またはTaqManなどの蛍光体を含む DNA プローブを使用して、増幅された産物の量をリアルタイムで測定します。RT -PCR (リアルタイムPCR)と略されることもありますが、この略語は逆転写 PCRにのみ使用してください。qPCR は、定量的 PCR (リアルタイム PCR)の適切な短縮形です
• 逆相補PCR (RC-PCR): 単一の密閉チューブ反応で、生成されたアンプリコンの両端に、選択した機能ドメインまたはシーケンスを個別に追加できます。この方法では、ユニバーサルプライマー (追加する目的のシーケンスまたはドメインを含む) と RC プローブの相互作用によって、反応内でターゲット固有のプライマーが生成されます。
• 逆転写PCR（RT-PCR）：RNAからDNAを増幅します。逆転写酵素はRNAをcDNAに逆転写し、それがPCRによって増幅されます。RT-PCRは、遺伝子の発現を決定したり、転写開始部位と転写終結部位を含むRNA転写物の配列を特定したりするために、発現プロファイリングで広く使用されています。遺伝子のゲノムDNA配列がわかっている場合は、RT-PCRを使用して遺伝子のエクソンとイントロンの位置をマッピングできます。遺伝子の5'末端（転写開始部位に対応）は、通常、RACE-PCR（cDNA末端の迅速増幅）によって特定されます。
• RNase H依存性PCR（rhPCR）：耐熱性RNase HII酵素によって除去できる3'延長ブロックを持つプライマーを利用するPCRの改良法。このシステムはプライマーダイマーを減らし、より多くのプライマーで多重反応を行うことを可能にする。 ^[70]
• 単一特異的プライマーPCR（SSP-PCR）：配列情報が片方の末端にしか存在しない場合でも、二本鎖DNAの増幅を可能にする。この方法は、部分的な配列情報しか存在しない遺伝子の増幅を可能にし、染色体の既知領域から未知の領域への一方向のゲノムウォーキングを可能にする。^[71]
• 固相PCR :ポロニー増幅法（PCRコロニーがゲルマトリックスなどで生成される）、ブリッジPCR ^[72]（プライマーが固体支持体表面に共有結合する）、従来の固相PCR（水性プライマーの1つと一致する配列を持つプライマーを含む固体支持体の存在下で非対称PCRを適用する）、および強化固相PCR ^[73]（従来の固相PCRは、高Tmおよびネストされた固体支持体プライマーを使用し、オプションで熱「ステップ」を適用して固体支持体プライミングを優先することで改善できる）など、複数の意味を包含する。
• 自殺PCR :古遺伝学や、偽陽性を回避し、増幅断片の特異性を確保することが最優先されるその他の研究で典型的に使用されます。このPCR法は、中世の黒死病の流行中にペストで死亡したとされる14世紀の人々の墓から採取された歯のサンプルに、微生物であるペスト菌が存在するかどうかを確認する研究で最初に説明されました。^[74]この方法では、PCRでプライマーの組み合わせを1回だけ使用することを規定しています（したがって、「自殺」という用語が使用されています）。このプライマーの組み合わせは、陽性コントロールPCR反応では決して使用すべきではありません。また、プライマーは、このプライマーセットまたは他のプライマーセットを使用してラボで以前に増幅されたことのないゲノム領域を常にターゲットにする必要があります。これにより、以前のPCR反応からの汚染DNAがラボに存在せず、偽陽性を生成する可能性がなくなります。
• 熱非対称インターレースPCR（TAIL-PCR）：既知の配列に隣接する未知の配列を分離するための方法。既知の配列内では、TAIL-PCRは異なるアニーリング温度を持つネストされたプライマーペアを使用し、未知の配列から反対方向に増幅するために縮重プライマーを使用する。^[75]
• タッチダウンPCR（ステップダウンPCR）：PCRの変種で、PCRサイクルが進むにつれてアニーリング温度を徐々に下げることで非特異的バックグラウンドを減らすことを目指している。最初のサイクルでのアニーリング温度は通常、使用するプライマーの_{T mより数度（3～5℃）高いが、後のサイクルではプライマーのT m}より数度（3～5℃）低い。温度が高いほどプライマー結合の特異性が高くなり、温度が低いほど最初のサイクルで形成された特定の産物からの増幅がより効率的になる。 ^[76]
• ユニバーサル ファスト ウォーキング: ラリアット構造形成を伴うメカニズムにより、従来の「片側」アプローチ (遺伝子特異的プライマー 1 つと一般的なプライマー 1 つだけを使用するため、人為的な「ノイズ」が生じる可能性がある) よりも特異性の高い「両側」PCR を使用したゲノムウォーキングと遺伝子フィンガープリンティングに使用されます[ ^77]。UFW の簡素化された派生技術には、LaNe RAGE (ゲノム DNA 末端の迅速な増幅のためのラリアット依存性ネスト PCR)、^[78] 5'RACE LaNe ^[79]および 3'RACE LaNe があります。^[80]

ポリメラーゼ連鎖反応の主要成分である耐熱酵素は、イエローストーンのマッシュルームスプリングの高温水に生息する微生物の産物として1960年代に発見されました。^[81]

1971年に分子生物学ジャーナルに発表された、 H. ゴビンド コラナ研究室のケル クレッペと同僚による論文では、酵素アッセイを使用してプライマーで短いDNAテンプレートをin vitroで複製する方法が初めて説明されました。^[82]しかし、PCRの基本原理のこの初期の現れは当時あまり注目されず、1983年のポリメラーゼ連鎖反応の発明は一般にカリ マリスによるものとされています。^{[83] [ページが必要]}

1983 年にマリスが PCR を開発した当時、彼はカリフォルニア州エメリービルで、バイオテクノロジー企業の最初の 1 つであるCetus Corporationで働いており、そこで短い DNA 鎖の合成を担当していました。マリスは、ある夜、車で太平洋岸ハイウェイを走っているときに PCR のアイデアを思いついたと書いています。 ^[84]彼は DNA の変化 (突然変異) を分析する新しい方法を頭の中で考えていたときに、DNA ポリメラーゼによる複製の繰り返しサイクルを通じて任意の DNA 領域を増幅する方法を発明したことに気づきました。サイエンティフィック アメリカンで、マリスは手順を次のように要約しています。「遺伝物質 DNA の 1 つの分子から始めて、PCR は午後のうちに 1000 億の類似分子を生成できます。反応は簡単に実行できます。必要なのは試験管、いくつかの簡単な試薬、および熱源だけです。」^[85] DNA フィンガープリント法は、1988 年に初めて父子鑑定に使用されました。^[86]

マリスは、 LSDの使用がPCRの開発に不可欠だったと認めている。「LSDを摂取していなかったらPCRを発明できただろうか？本当に疑問だ。DNA分子の上に座ってポリマーが通り過ぎるのを眺めることもできる。それを学んだのは幻覚剤のおかげでもある。」^[87]

マリスと、DNAを操作する他の重要な方法を開発した生化学者マイケル・スミス^[1]は、マリスとシータスの同僚が最初に彼の提案を実践してから7年後の1993年に、共同でノーベル化学賞を受賞した。 ^[88]マリスがRKサイキとHAエルリッヒと1985年に発表した論文「鎌状赤血球貧血の診断のためのβグロビンゲノム配列の酵素増幅と制限部位分析」—ポリメラーゼ連鎖反応の発明—は、2017年にアメリカ化学会化学史部門から化学ブレークスルー賞を受賞した。^{[89] [2]}

PCR法の核となるのは、各複製サイクル後にDNA二重らせん構造の2本のDNA鎖を分離するために必要な90℃（194℉）を超える高温に耐えられる適切なDNAポリメラーゼを使用することです。PCRの前身となるin vitro実験で最初に使用されたDNAポリメラーゼは、これらの高温に耐えることができませんでした。^[2]そのため、DNA複製の初期の手順は非常に非効率的で時間がかかり、大量のDNAポリメラーゼとプロセス全体にわたる継続的な処理が必要でした。

1976年に発見されたTaqポリメラーゼは、温泉などの高温（50～80℃）^{[14]環境に生息する}好熱菌Thermus aquaticusから精製されたDNAポリメラーゼであり、PCR法の劇的な改善への道を開きました。T . aquaticusから単離されたDNAポリメラーゼは高温でも安定しており、DNAが変性した後も活性を維持します^[15]。そのため、サイクルごとに新しいDNAポリメラーゼを追加する必要がありません。^[3]これにより、サーモサイクラーをベースとした自動化されたDNA増幅プロセスが可能になりました。

PCR技術は、カリ・マリスによって特許が取得され、1983年にマリスがこの技術を発明したときに勤務していたCetus Corporationに譲渡されました。Taqポリメラーゼ酵素も特許で保護されていました。この技術に関連して、デュポンが起こした訴訟^[90]を含め、注目を集めた訴訟がいくつかありました。スイスの製薬会社ホフマン・ラ・ロシュは1992年に特許権を購入しました。商用PCR特許の最後のものは2017年に失効しました。^[91]

Taqポリメラーゼ酵素をめぐる関連特許争いは、ロシュ社とプロメガ社の^間で、世界中のいくつかの管轄区域で現在も続いている。この法的論争^{は、2005年3月28日に失効した元のPCRおよび}Taqポリメラーゼの特許の有効期間を超えて続いている。 ^[92]

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