逆転写ポリメラーゼ連鎖反応

エンドポイントRT-PCRの測定アプローチでは、臭化エチジウムなどの蛍光色素の使用による遺伝子発現レベルの検出、^{[ 24 ] [ 25 ]}フォスフォイメージャーを使用したPCR産物のP32標識、^{[ 26 ]}またはシンチレーションカウンティングによる検出が必要です。^{[ 18 ]}エンドポイントRT-PCRは、一般的に相対的、競合的、比較的の3つの異なる方法を使用して行われます。^{[ 27 ] [ 28 ]}

相対的RT-PCR

RT-PCR の相対定量では、目的遺伝子と同時に内部コントロールを共増幅します。内部コントロールはサンプルを正規化するために使用されます。正規化後、複数の mRNA サンプル間で相対転写産物量を直接比較できます。注意すべき点として、内部コントロールは実験処理の影響を受けないように選択する必要があります。結果が正確で意味のあるものとなるためには、発現レベルはすべてのサンプルで、目的の mRNA と一定である必要があります。結果の定量は、ターゲットとコントロールの増幅の線形範囲を比較することによって分析されるため、分析を開始する前に、開始ターゲット分子濃度とその増幅率を考慮することが重要です。分析結果は、遺伝子シグナルと内部コントロールシグナルの比として表され、これらの値は、相対ターゲット RNA 発現の推定においてサンプル間の比較に使用できます。^{[ 25 ] [ 28 ] [ 29 ]}

競合的RT-PCR

競合RT-PCR法は絶対定量に使用されます。この方法では、サイズまたは配列のわずかな違いによって標的RNAと区別できる合成「競合」RNAを使用します。正確な結果を得るためには、合成RNAの設計が配列は同一であるが標的RNAよりわずかに短いことが重要です。設計および合成後、既知量の競合RNAを実験サンプルに添加し、RT-PCRを使用して標的とともに共増幅します。次に、競合RNAの濃度曲線を作成し、内因性転写産物から生成されたRT-PCRシグナルと比較することで、サンプル中に存在する標的の量を決定します。^{[ 28 ] [ 30 ]}

比較RT-PCR

比較RT-PCRは、標的RNAが単一の反応内で無関係な配列の内部標準と増幅試薬をめぐって競合するという点で、競合RT-PCRと類似しています。反応が完了すると、結果は外部標準曲線と比較され、標的RNA濃度が決定されます。相対定量法および競合定量法と比較すると、比較RT-PCRは、研究者がパイロット実験を行う必要がないため、より便利な方法であると考えられています。相対RT-PCRでは、mRNAの指数関数的増幅範囲を事前に決定する必要があり、競合RT-PCRでは、合成競合RNAを合成する必要があります。^{[ 28 ] [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]}

過去数年間に新しい蛍光DNA標識技術が登場したことで、PCR産物のリアルタイムでの分析と検出が可能になり、その結果、遺伝子発現の分析にリアルタイムRT-PCRが広く採用されるようになった。^{[ 35 ]}リアルタイムRT-PCRは、遺伝子発現の定量化に最適な方法であるだけでなく、アレイ分析や遺伝子発現をグローバルな規模で得るための好ましい方法でもある。^{[ 36 ]}現在、 PCR産物のリアルタイムRT-PCR検出に使用できる蛍光DNAプローブは、 SYBR Green、TaqMan、分子ビーコン、スコーピオンプローブの4種類がある。これらのプローブはすべて、蛍光シグナルを生成することでPCR産物の検出を可能にする。 SYBR Green色素は溶液中の二本鎖DNAに結合するだけで蛍光シグナルを発するのに対し、TaqManプローブ、分子ビーコン、スコーピオンの蛍光生成は、色素分子とクエンチャー部分がオリゴヌクレオチド基質に結合するFörster共鳴エネルギー移動（FRET）結合に依存している。^{[ 37 ]}

SYBRグリーン

SYBR GreenはPCR産物の二本鎖DNAに結合すると、励起時に発光します。PCR産物が蓄積するにつれて蛍光強度は増加します。この技術は、結合特異性がないためプローブの設計が不要で使いやすいです。しかし、この色素はPCR産物の二本鎖DNAとプライマーダイマーの二本鎖DNAを区別しないため、標的濃度の過大評価がよく問題となります。正確な定量が絶対的に必要な場合は、結果を検証するための追加のアッセイを実施する必要があります。それでも、リアルタイムRT-PCR産物検出法の中で、SYBR Greenは最も経済的で使いやすい方法です。^{[ 22 ] [ 23 ]}

TaqManプローブ

TaqManプローブは、5'末端に蛍光プローブ、3'末端にクエンチャーが結合したオリゴヌクレオチドです。PCR増幅中、これらのプローブは増幅産物中の標的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼがTaqMan結合テンプレートを複製する際に、ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性により蛍光プローブも切断されます。クエンチ分子と蛍光プローブが近接しているため、通常はFRETによる蛍光の検出が妨げられますが、この分離により、プローブ切断サイクルの数に比例して蛍光強度が増加します。適切に設計されたTaqManプローブは正確なリアルタイムRT-PCR結果をもたらしますが、分析するmRNA標的ごとに個別のプローブを作成する必要があるため、合成にはコストと時間がかかります。^{[ 22 ] [ 16 ] [ 38 ]}さらに、これらのプローブは光に敏感であるため、分解を防ぐために分注して慎重に凍結する必要があります。

分子ビーコンプローブ

TaqManプローブと同様に、分子ビーコンもオリゴヌクレオチド基質の5'末端に蛍光プローブ、3'末端にクエンチャーを結合させたFRET検出を利用します。ただし、TaqMan蛍光プローブは増幅中に切断されますが、分子ビーコンプローブは切断されずに各反応サイクル中に新しいターゲットに再結合します。溶液中で遊離している場合、蛍光プローブとクエンチャー分子が近接しているため、FRETによる蛍光は発生しません。しかし、分子ビーコンプローブがターゲットにハイブリダイズすると、蛍光色素とクエンチャーが分離され、励起時に発光します。TaqManプローブと同様に、分子ビーコンの合成は高価であり、RNAターゲットごとに個別のプローブが必要です。^{[ 19 ]}

サソリ型プローブ

スコーピオンプローブは、分子ビーコンと同様に、非ハイブリダイズ状態では蛍光活性を示さない。これは、5'末端の蛍光プローブがオリゴヌクレオチドの3'末端の部分によって消光されるためである。しかし、スコーピオンの場合、3'末端には5'末端のプライマーの伸長産物と相補的な配列も含まれている。スコーピオン伸長がアンプリコン上の相補配列に結合すると、スコーピオン構造が開き、FRETが防止され、蛍光シグナルを測定できるようになる。^{[ 39 ]}

マルチプレックスプローブ

TaqManプローブ、分子ビーコン、およびスコーピオンにより、1本のチューブ内でPCR産物を同時に測定できます。これは、異なる蛍光色素それぞれが特定の発光スペクトルと関連付けられるためです。マルチプレックスプローブの使用は、テストの有用性を損なうことなく時間と労力を節約するだけでなく、遺伝子欠失解析、突然変異および多型解析、定量的解析、RNA検出などの幅広い研究分野への応用により、多くの分野の研究室にとって非常に貴重な技術となっています。^{[ 39 ] [ 40 ] [ 41 ]}

リアルタイムRT-PCRで得られた結果を定量化するために、標準曲線法と比較閾値法という2つの戦略が一般的に用いられています。^{[ 42 ]}

まず、PCRチューブに鋳型RNA、プライマー、dNTPミックス、ヌクレアーゼフリー水を入れます。次に、RNase阻害剤と逆転写酵素をPCRチューブに加えます。続いて、PCRチューブをサーマルサイクラーに入れ、1サイクル反応させます。このサイクルでは、逆転写酵素のアニーリング、伸長、および不活性化が行われます。最後に、ステップ2であるPCRに直接進むか、PCRを行うまで製品を氷上で保存します。

各PCRチューブに、バッファー、dNTPミックス、MgCl2、Taqポリメラーゼ、ヌクレアーゼフリー水を含むマスターミックスを加えます_。次に、必要なプライマーをチューブに加えます。続いて、PCRチューブをサーマルサイクラーに入れ、増幅プログラムを30サイクル実行します。これには、変性、アニーリング、伸長が含まれます。RT-PCRの産物は、ゲル電気泳動で分析できます。^{[ 54 ]}