細胞内送達

細胞内送達は、外部物質を生きた細胞に導入するプロセスです。細胞内に送達される物質には、核酸（DNAとRNA）、タンパク質、ペプチド、不浸透性小分子、合成ナノ材料、細胞小器官、ミクロンスケールのトレーサー、デバイス、物体などがあります。 ^{[1] [2]}このような分子や物質は、細胞の挙動を調査したり、細胞の操作を操作したり、病的な機能を修正したりするために使用できます。

細胞内送達の医療用途は、体外受精（IVF）^[3]やmRNAワクチン^[4]から遺伝子治療^[5]やCAR-T細胞の準備^[6]まで多岐にわたります。産業用途には、タンパク質生産[7]、バイオ製​​造[8]、植物や動物の遺伝子工学[9]が含まれます。細胞^内 送達は^、 DNAプラスミドトランスフ^{ェクション}を使用して生きた細胞内のタンパク質機能を調べるなど、生物学と遺伝学の研究における基本的な技術です。^[10]細胞内送達を実行するための幅広いアプローチがあり、膜破壊または送達材料をキャリアにパッケージ化することで機能する生物学的、化学的、物理的技術が含まれます。^{[1] [11] [12]}

細胞内送達は細胞生物学と技術の交差点にあり、遺伝学、バイオテクノロジー、バイオエンジニアリング、薬物送達など、科学と医学の多くの分野に関連しています。

コンピュータが電子信号を介して動作するのと同様に、細胞は分子を介して情報を処理および伝達します。細胞に取り込まれる分子や材料に応じて、さまざまな結果や用途が実現されます (例については、図「細胞内送達の用途」を参照してください)。以下は、細胞内送達による細胞の調査および操作に使用される貨物材料の主な分類の一部です。

トランスフェクションとは、核酸（DNA、RNA、およびそれらの類似体）を細胞内に送達することを指します。細胞に一般的にトランスフェクトされる核酸材料は、プラスミドDNA、mRNA、siRNA、およびオリゴヌクレオチドです。トランスフェクションの用途は、3つの主要な領域にわたります：^[1]

1. 基礎生物学研究、
2. バイオ製造、および
3. 遺伝子および細胞ベースの治療

基礎研究において、トランスフェクションは細胞生物学や遺伝学から免疫学や創薬に至るまでの分野における基礎技術です。^[13]バイオ製造において、トランスフェクションはタンパク質、抗体、ウイルスベクター、ワクチン用のウイルス様粒子の製造に使用されます。細胞ベースの治療において、トランスフェクションは体外遺伝子治療、^[14] 造血幹細胞工学、^[15]誘導多能性幹細胞の製造、^[16]免疫療法用の細胞の体外調製^[17]などの用途に使用されます。過去50年間、核酸トランスフェクションは細胞内送達の最も一般的なサブカテゴリーでした。

プラスミドDNAは、1970年代後半にマイクロインジェクション ^[18]とリン酸カルシウム法^[19]を介して、遺伝子発現の目的で動物細胞に導入され始めました。それ以来、プラスミドはさまざまな研究で遺伝子とタンパク質の機能を調べるために使用されてきました。DNAプラスミドは物理的に大きくて扱いにくい分子であり、5〜10キロ塩基対のプラスミドは、自由で凝縮していないときの溶液中での直径が100nmを超えます。 ^[20]しかし、それらを編集および準備するための確立された比較的低コストの技術により、生物学研究では非常に一般的に使用されてきました。

1970年代には、mRNAのマイクロインジェクションがタンパク質発現をもたらすことが示されました。^[21]特定の状況では、mRNAトランスフェクションはDNAプラスミドと比較して、以下の理由によりタンパク質発現を誘導するのに有利であると考えられています。

^[22]

1. ゲノム統合のリスクの低減、
2. 核への送達を必要とせず、細胞質への送達で十分である。
3. タンパク質発現は用量依存的かつ急速であり、
4. 適切に化学的に修飾された場合、DNAベクターよりも毒性と免疫原性が低くなります。

したがって、mRNA はより高価で本質的に不安定であるにもかかわらず、ほとんどの治療用途では DNA よりも優れた選択肢であると考えられています。

オリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチド未満のDNAまたはRNAの一本鎖または二本鎖配列です。低分子干渉RNA（siRNA）は、遺伝子発現をサイレンシングするために細胞に導入できる、21〜22塩基対の短いRNA二重鎖です 。 ^[23] 1998年にノーベル賞を受賞した発見以来、siRNAは遺伝子機能を撹乱するために何千もの生物学的研究で細胞に導入されてきました。細胞内送達に興味深い他のオリゴヌクレオチドには、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）、マイクロRNA（miRNA）、アプタマーなどがあります。このようなオリゴヌクレオチドは、いくつかの異なるメカニズムを通じて細胞の行動を変えるために使用できます。 ^[24]

脂質ナノ粒子と電気穿孔法は現在、核酸トランスフェクションの一般的な戦略である。しかし、多くの一次細胞、幹細胞、患者由来細胞、ニューロンでは、効果的なトランスフェクションが依然としてハードルとなっている。^[25]このような細胞で生物学的研究を実施し、潜在的な医療応用を行う能力は、トランスフェクションの効率と治療に対する耐性によって制限されることが多い。さらに、人体内の細胞にトランスフェクションを行うことによる長期的な影響については、現在のところ十分に理解されていない。

ゲノム編集 ヌクレアーゼ、活性阻害抗体、刺激性転写因子などのタンパク質を生きた細胞に送達することは、細胞機能を操作および分析するための強力なツールセットとなります。^[26]さらに、現在のタンパク質ベースの治療薬のほとんどは細胞外の標的を標的としており、これが現在の研究努力の最前線であるため、効果的な細胞内送達により、使用可能なタンパク質薬のレパートリーが拡大する可能性があります。^[27]

精製タンパク質の細胞への送達は、1960年代に始まりました。例としては、フェリチンをマイクロインジェクションしたアメーバ^{[28]やウシ}アルブミンをマイクロインジェクションしたマウスの卵などがあります。タンパク質はサイズ、形状、電荷が多様なため、カチオン性脂質が核酸トランスフェクションに使用する万能の溶液で細胞に簡単に送達することはできません。対照的に、マイクロインジェクション、ピノソームの浸透圧溶解、低張ショック、スクレープローディング、ビーズローディング、シリンジローディング、洗剤曝露、エレクトロポレーション、孔形成毒素、細胞透過性ペプチド、ナノキャリア、細胞スクイージング、ナノニードル、音響摂動、蒸気ナノバブルなど、多様な方法がタンパク質を細胞に送達するために使用されてきました。^[1]ゲノム編集の目的で、 sgRNAと組み合わせたCas9タンパク質は、電気穿孔法、マイクロインジェクション、脂質ナノ粒子製剤、浸透圧誘導エンドサイトーシスとそれに続くエンドソーム破壊、マイクロ流体変形、細胞浸透ペプチドなどのさまざまな方法で送達されてきました。^[1]

細胞内送達を必要とする小分子には以下のものがあります。

1. 不浸透性低分子医薬品、
2. 小分子プローブ、および
3. 凍結防止剤。

前者の例としては、正電荷と疎水性のために透過性が低い抗がん剤であるブレオマイシンが挙げられる。エレクトロポレーションによる細胞内送達を行うことで、ブレオマイシンの効力を100倍以上高めることができる。^[29]小分子プローブに関しては、細胞内部に送達されると、これらの分子は膜電位、pH、イオン濃度などの細胞特性を報告することができる。^[1]一例は、細胞内カリウム濃度の測定に使用できる蛍光染料であるPFBIである。最後に、不浸透性糖などの候補となる凍結保護分子の中には、親水性が高く、細胞膜を容易に透過しないものがある。例えば、トレハロース（Mw = 342 Da）は、さまざまな生物が乾燥や凍結に耐えられるように合成する天然の二糖類である。最大200 mMの濃度で動物細胞に取り込まれたトレハロースは、凍結および解凍中に優れた凍結保護効果を発揮することがわかっている。^[30]

マイクロスケールの貨物材料は、さまざまな用途で細胞に送達されることに成功しています。1世紀にわたって、マイクロインジェクションはマイクロスケールの貨物を細胞に導入する主な方法でした。典型的な例は、カエルの卵に体細胞核を移植し、完全に分化した体細胞の核を卵に挿入すると新しい動物に成長できることを実証したものです。^[31]マイクロインジェクションは、動物の体外受精の概念実証として、卵に精子を注入するために最初に使用されました。^[32]人工染色体は、概念実証遺伝子治療のためにマイクロインジェクションによって設計され、細胞に移植されました。^[33]ミトコンドリアの移植も、マイクロインジェクションを介していくつかの細胞タイプで実証されています。^[34]最近では、レーザーでトリガーされるキャビテーションバブルを使用して、細菌やミトコンドリアを送達する目的で細胞膜に一時的な穴を開けています。^[35]マイクロインジェクションや弾道推進法を用いて、ミクロンスケールの粒子、球体、ビーズを細胞内に注入し、細胞の内部の機械的挙動を評価する細胞マイクロレオロジー研究が行われてきた。^[36]例えば、最大5.6ミクロンのマイクロインジェクションされたPEG化トレーサービーズを使用することで、モーター駆動の細胞質混合により、小さな細胞成分と大きな細胞成分の両方の細胞内運動が大幅に強化されることが示された。^[37]

細胞内送達に興味深い他の材料としては、カーボンナノチューブ、量子ドット、磁性ナノ粒子、センサーやプローブとして機能するナノデバイスなどがある^{[38] [39]}

以下は、少なくとも 1 つのステップで細胞内送達に依存する医療治療の例です。

造血幹細胞を用いた遺伝子治療：

• ストリムベリスは、機能的なアデノシンデアミナーゼ（ADA）遺伝子の体外ガンマレトロウイルスベクター遺伝子送達によって製造された、アデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全症（ADA-SCID）の治療薬です（2017年に欧州で承認）。ストリムベリスは、欧州医薬品庁から承認を受けた最初の体外自己遺伝子治療薬でした。^[40]
• 機能的ヒトアリルスルファターゼA （ARSA）遺伝子の体外レンチウイルス遺伝子送達によって生産された、異染性白質ジストロフィー（MLD）の治療のためのアティダルサゲン・オートテムセル（Libmeldyというブランド名）（2020年に欧州で承認）。
• 輸血依存性ベータサラセミア（TDT）の治療薬であるベチベグロゲン・オートテムセル（商品名：Zynteglo）は、機能的ヒトHBB遺伝子の体外レンチウイルス遺伝子送達によって製造されます（欧州および米国での承認は2022年に付与されます）。

CAR-T細胞 免疫療法：

• チサゲンレクロイセル（商品名：キムリア）は、 CD-19を標的とするCAR遺伝子の体外レンチウイルス遺伝子送達によって製造され、B細胞急性リンパ性白血病（B細胞ALL）の治療薬です（米国では2017年に承認）。
• 大細胞型B細胞リンパ腫の治療薬であるアキシカブタゲン シロレウセル（商品名：Yescarta）は、 CD-19を標的とするCAR遺伝子の体外ガンマレトロウイルス遺伝子送達によって製造されています（2017年に米国で承認）。
• Brexucabtagene Autoleucel（商品名：Tecartus）は、 CD-19を標的とするCAR遺伝子の体外ガンマレトロウイルス遺伝子送達によって製造され、再発性/難治性マントル細胞リンパ腫（r/r MCL）の成人患者の治療薬です（2021年に米国で承認）。

生体内ウイルスベクターによる遺伝子治療：

• オナセムノゲン アベパルボベック（商品名：ゾルゲスマ）は脊髄性筋萎縮症の治療薬で、機能的なSMN1トランスジーンを影響を受ける運動ニューロンに送達するAAV9ウイルスベクターの静脈内注入によって投与されます（米国では2019年に承認）。
• レーバー先天性黒内障（進行性失明を引き起こす遺伝性網膜疾患）の治療薬であるVoretigene neparvovec （商品名Luxturna）は、 RPE65遺伝子の機能的コピーを眼細胞に送達してRPE65変異を補うAAV2ウイルスベクターの網膜下注射によって投与されます（米国では2017年に承認）。

siRNA医薬品:

• パティシラン（オンパトロ）は、遺伝性トランスサイレチン媒介アミロイドーシス患者の多発性神経障害の治療薬で、肝細胞に入り込んで病原性トランスサイレチンmRNAの発現を抑制する脂質ナノ粒子に配合されたsiRNAの静脈内注入によって投与されます（米国および欧州で2018年に承認）。
• ジボシラン（ジブラアリ）は、急性肝性ポルフィリン症の成人の治療薬で、肝細胞に侵入して病原性アミノレブリン酸合成酵素1（ALAS1）mRNAの発現を抑制するsiRNA-GalNAc複合体の静脈内注入によって投与されます（2019年に米国で承認）。

mRNAワクチン:

• モダナ社のCOVID-19ワクチン（Spikevaxというブランド名）は、SARS-CoV-2ウイルスの感染によって引き起こされるCOVID-19に対する防御を提供するように設計されています（米国緊急使用許可2020）。生理食塩水に溶かしたmRNA-LNP複合体0.5mLを筋肉内注射して投与します。局所注射により、mRNA-LNP複合体が常在/浸潤APC、関連免疫細胞、筋肉細胞に送達され、局所発現を刺激することが報告されています^[41]

将来のSARS-CoV-2への曝露に備えて免疫系を準備するために、COVIDスパイクタンパク質を産生する。^[42]

• ファイザー-ビオンテックCOVID-19ワクチン（Comirnatyというブランド名）は、SARS-CoV-2ウイルスの感染によって引き起こされるCOVID-19に対する防御を提供するように設計されています（米国緊急使用許可2020）。メカニズムはモデルナ（上記）と同じですが、脂質ナノ粒子の組成が異なり、ファイザーはALC-0315と呼ばれるイオン化脂質を使用し、モデルナはSM-102と呼ばれるイオン化脂質を使用しています。^[4]

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）：

• ミポメルセン（商品名：キナムロ）は、ホモ接合性家族性高コレステロール血症の治療薬で、化学的に修飾されたASOを皮下注射して投与され、半減期は約30日で肝臓に蓄積します。^[4]

ASO は肝細胞に侵入し、病原性ApoB mRNA の発現を阻止します (米国では 2013 年に承認済み)。

• スピンラザ（商品名ヌシネルセン）は脊髄性筋萎縮症（SMA）の治療薬で、化学的に修飾されたASOを脊髄内注射して運動ニューロン細胞に入り、SMN2 mRNAに結合し、SMN2遺伝子の選択的スプライシングを変化させてタンパク質の発現を回復させます。^[43]

人間の妊娠のための体外受精（IVF）：

• 精子の数や運動性が低い場合や、精子が卵子に容易に侵入できない場合には、卵細胞質内精子注入法（ICSI）と呼ばれる手順を使用して、単一の精子を卵子に直接マイクロ注入することがあります。注入後、受精卵は特別な成長培地で約48時間培養され、卵子が6〜8個の細胞で構成されます。次に、膣と子宮頸部を通過する細いプラスチックカテーテルを介して患者の子宮に移植されます。ICSIによる最初の人間の妊娠は、1991年にジャンピエロ・パレルモと彼のチームによって行われました。 ^[44] ICSIによる体外受精は、1990年代以降、世界中で何百万もの妊娠を促進してきました。

安全性。ヒト細胞への物質の細胞内送達の即時および長期的な医学的影響を理解するための研究はまだ初期段階にあります。たとえば、調査により、ICSI で生まれた子供は自然に妊娠した子供よりも健康上の問題を抱えることが多いことがわかっています。ただし、これが両親の生殖器系の健康状態が悪いためなのか、体外受精や ICSI 手順の側面によるものなのかはわかっていません。 ^[45]ガンマレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを使用して調製された HSC ベースの遺伝子治療は、ストリンベリスで発生したように、遺伝毒性のために将来的に白血病のリスクが増加するケースがいくつか示されています。^{[46]さらに}、治療用 siRNA および mRNA の細胞内送達に使用される脂質は、炎症反応を引き起こす可能性があります。^{[48] [49]}パティシランの場合、ナノ粒子への反応を最小限に抑えるために、複数の抗炎症薬による前処理が使用されています。^[50]現在、SM-102やALC-0315などのmRNAワクチンの新規化学成分の細胞内送達が、受信者集団の短期的および長期的な健康に及ぼす医学的影響に関するデータはほとんどありません。^[51]そのため、安全性と意図しない副作用は、細胞内送達を利用する医療治療にとって引き続き重要な問題となります。

現在の細胞内送達方法は、大きく 2 つのカテゴリに分類できます。

1. 膜破壊を介した
2. キャリア媒介

膜破壊を介した技術では、細胞膜に一時的な穴を開け、貨物分子を ^{[1] [11]}
A) 透過処理と細胞外溶液からの物質の拡散流入、B)細胞膜を穿孔して目的の貨物を導入する
媒体またはキャリアによる直接浸透のいずれかで送達します。 細胞の細胞膜は、機械的、電気的、化学的、光学的、または熱的手段によって破壊できます。透過処理を使用する細胞内送達方法には、次のものがあります。

• エレクトロポレーション
• 熱処理
• オプトポレーション（通常はレーザーを使用）
• キャビテーション効果（通常は超音波またはレーザー/粒子の相互作用による）
• 流体せん断（通常はマイクロ流体またはキャビテーションによる）
• 洗剤/界面活性剤
• 毛穴形成毒素
• 浸透圧/静水圧
• マイクロ流体セルスクイーズ、スクレイプローディング、ビーズローディングなどの直接的な機械的方法。

直接浸透を利用した細胞内送達方法には以下のものがあります。

• 古典的なマイクロインジェクション
• 新しい形式のマイクロインジェクション（ナノピペット、自動化など）
• 弾道粒子 /遺伝子銃
• ナノニードルと、ナノストロー、ナノスピア、ナノワイヤなどのそのバリエーション。

膜破壊を介した送達方法は、溶液中に分散できるほぼすべての物質を送達できるため、キャリアを介した方法よりも汎用性があります。膜破壊を介した方法の主な課題は、必要な送達アプリケーションに最適な形状、サイズ、位置、および持続時間の穴を作成することです。過度の膜損傷は細胞を死滅させたり、機能を損なったりする可能性があるため、避ける必要があります。

キャリア媒介送達技術は、ナノスケールのキャリアの中または上に貨物をパッケージ化し、それが細胞内に入り貨物を送達する。キャリアは通常、 ^{[52] [53]のいずれかの方法で細胞内部に侵入する。}

1. エンドサイトーシス（キャリアの大多数）または
2. 細胞の細胞膜との融合

しかし、特定のキャリアがこれまで知られていないメカニズムによって細胞膜を通過したり、一時的に細胞膜を破壊したりするという稀な報告がある。^[54]

キャリアベースのアプローチは、主に分子からナノスケールのさまざまな生化学的アセンブリで構成されています。キャリアの目的は3つあります。

1. 貨物を梱包し劣化から保護するため、
2. 意図した細胞内区画にアクセスし、
3. 適切な時間と場所でペイロードを放出します。

キャリアは、再構成ウイルス、ウイルス様粒子、小胞、細胞ゴースト、機能性リガンドやペプチドなど、生物にヒントを得たものになります。これらは、有機および無機起源の高分子複合体の組み立てを含む、化学、材料科学、ナノテクノロジーの合成技術に基づいている場合があります。細胞内送達に使用されているキャリアには、次のものがあります。

• ポリマーアセンブリ
• 脂質アセンブリ
• リポソーム（脂質集合体とは異なり、内部が水性の中空構造）
• 塩複合体（例：CaPO ₄ -核酸凝縮物）
• エクソソームとその他の生物に着想を得た小胞
• 細胞透過性ペプチド（CPP）、別名タンパク質伝達ドメイン（PTD）
• リガンド複合体
• タンパク質または糖質ベースのナノアセンブリ（例：キトサン）
• 無機ナノキャリア（例：メソポーラスシリカ、金属ナノ粒子、磁性ナノ粒子）
• ナノテクノロジーベースのキャリア（例：量子ドット、カーボンナノチューブ）
• ウイルスベクター（レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、その他のウイルスに基づく）
• 再利用された細菌毒素とウイルス成分

キャリアがどのように細胞に進入するかを研究したところ、ほとんどのキャリアはエンドサイトーシスによって進入し、その後エンドソーム区画から細胞質に脱出することが示されている 。^{[53] [52]} ナノキャリアが利用できるエンドサイトーシスのメカニズムには、クラスリン依存性およびクラスリン非依存性経路を介した食作用および飲作用がある。 ^[53] 標的細胞が使用する内部化経路は、キャリアの大きさ、形状、材料組成、表面化学、および/または電荷に依存する。^{[53] [52]} エンドソームから脱出できない貨物は、分解のためにリソソームに輸送されるか、細胞表面にリサイクルされる。^{[55] [56]} 脂質ナノ粒子や細胞透過性ペプチドを含むほとんどの非ウイルス性キャリア戦略では、約1%のエンドソーム脱出効率が報告されている。^{[56] [52] [57]} さらに、エンドソーム脱出の正確なメカニズムは不明のままであり、現在も研究が続けられている。^[57]

エンドサイトーシスとは別に、一部のキャリアは融合によって細胞膜と直接融合することができます。生物学における融合イベントには、小胞融合、細胞間融合、細胞とウイルスの融合が含まれます。これらの場合、並置された膜は特定のタンパク質間相互作用によって密接に接触し、界面の水が排除されて脂質の混合とそれに続く融合が促進されます。エンベロープウイルスは、膜貫通ウイルスタンパク質を使用して標的細胞膜との融合を仲介することがあり、このメカニズムは人工細胞内送達に利用されています。 ^[52] 初期の例としては、センダイウイルスを使用して、事前にロードされた赤血球ゴーストを標的細胞の細胞膜と融合させたことが挙げられます。 ^[58] この技術のバリエーションでは、標的細胞膜でのインフルエンザヘマグルチニン（HA）の発現を利用し、これが赤血球表面のシアリン酸残基に結合して融合を誘導します。^{[59]ウイルス膜成分をリポソームまたは小胞に再構成した}ビロソームも、細胞内送達の目的で融合能力を示す。機能的なビロソームは、センダイ、インフルエンザ、水疱性口内炎、およびその他のウイルスの融合成分で構築されている。^[52] 一部のエクソソームと細胞外小胞は標的細胞と融合することが報告されており ^[60] 、さらに必要に応じて融合するように設計されている可能性がある。^[61] 興味深いことに、タンパク質送達に使用される融合性リポソームは、融合性タンパク質またはペプチドの存在を必要とせずに、脂質組成のみを調節することによって融合できることが報告されている。^[62] 細胞内送達に使用されている融合性キャリアには、

^{[1] [52]}

（1）細胞ゴースト、細胞質が積み荷に置き換えられた死細胞、
（2）ヴィロソーム、機能性ウイルスタンパク質を呈示するために再構成された積み荷を積んだ小胞、および
（3）融合性リポソーム。

ウイルスベクター。ウイルスベクターは、ウイルス感染経路を利用して細胞に侵入しますが、複製と病原性につながるウイルス遺伝子のその後の発現を回避します。これは、ウイルスゲノムのコード領域を削除し、送達されるDNAで置き換えることによって行われます。送達されるDNAは、宿主染色体DNAに組み込まれるか、エピソームベクターとして存在します。ウイルスベクターは、1970年代から遺伝子送達に初めて使用され、SV40 ^[63] またはレトロウイルスから構築されました 。^{[64]新しい世代のウイルスベクタープラットフォームは、}レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス、およびその他のウイルス のコンポーネントに基づいて作成されています。^[65]ウイルスベクター はDNA送達に非常に効率的であるが、注目すべき弱点として、（1）労働集約的で高価なプロトコル、（2）安全性の問題、（3）免疫/炎症反応を引き起こすリスク、（4）組み換えベクターによるゲノムへの組み込み、（5）挿入遺伝毒性のリスク、および（6）パッケージング容量の制限（アデノおよびAAVは通常5〜7.5kbに制限されている）が挙げられる。

トランスフェクション用ナノ粒子。核酸の細胞内送達に最も一般的に使用されるナノ粒子は、カチオン性脂質とポリマーの集合体に基づいています。これらのカチオン性分子は、 DNAプラスミド（約50〜200 nm）、mRNA（10〜100 nm）およびその他の核酸（「細胞内送達に関心のある一般的な分子の特性」を参照）を、数十ナノメートルの大きさのコンパクトなナノ粒子に凝縮します。これらの粒子の正電荷は、ほとんどの動物細胞が自然に負に帯電しているため（膜電位-35〜-80 mV ）、細胞表面への粒子の引き付けを容易にします。結合すると、100 nm未満のサイズ範囲の粒子ではエンドサイトーシスが最も効率的であると考えられています。^[53] ナノ粒子への複合化は、核酸が適切な細胞内区画に放出されるまで、核酸を分解から保護します。^[66]

1960年代から、核酸をカチオン性分子と混合すると、細胞にトランスフェクトでき​​る高分子複合体が形成されることが観察されました。初期の2つの例は、ポリマージエチルアミノエチルデキストラン（DEAE-デキストラン）/核酸の組み合わせ（1968） ^[67] と不溶性イオン塩リン酸カルシウム/核酸沈殿剤（1973）でした。^[68]トランスフェクション におけるカチオン性脂質の使用は1980年代に始まり ^{[69] 、「}リポフェクション」 と呼ばれ、1993年に発売された人気商品リポフェクタミンの基礎となりました。他のカチオン性トランスフェクション試薬は、1993年のPAMAM ^[70] （1990年代後半に発売された「スーパーパーフェクト」試薬）などのデンドリマーや、 1995年の PEI ^[71]（その後すぐに「ポリジェット」として販売）などのカチオン性ポリマーをベースに1990年代に開発されました。現在、研究では、ほとんどの核酸トランスフェクションは脂質試薬で行われ、ポリマー試薬とエレクトロポレーションが他の主要な選択肢として使用されています。特定の扱いにくい細胞や生体内アプリケーションでは、ウイルスベクターの方が適している場合があります。^[72]

微細加工、ナノテクノロジー、化学などの研究分野の進歩は、細胞内送達方法の精度と性能の向上に貢献しています。 ^{[11] [12] [73] [74]}

電気穿孔法。初期の電気穿孔法では、バルク電極を使用して、キュベット内の溶液中の細胞に規定電圧の電気パルスを印加していました 。^[75]電気穿孔法は、 90年代後半にマイクロ流体工学 の使用によりマイクロスケールにまで縮小されました。 ^[76]その後、ナノアパーチャとナノストローの使用によりナノ電気穿孔法が実現しました。^[77] ナノおよびマイクロバージョンの電気穿孔法は、標的細胞に課される膜破壊のサイズと場所をはるかに高い精度で制御できます。^[78] Maxcyteという会社は、数億個の細胞を数十分で処理できるフロー電気穿孔法の高スループットバージョンを開発しました。^[79]さらに、他の研究グループは、高スループットマルチウェルシステムで電気穿孔パラメータを改善するためにディープラーニング を採用しました。 ^[80]

機械的接触。細胞膜に衝突する物体の機械的力を利用する細胞内送達プロトコルの最初のバージョンは、スクレイプローディングやガラスビーズローディングなどの単純で粗雑な方法でした。^[81] たとえば、スクレイプローディングでは、平らな基質上で培養された接着細胞の上をスパチュラで引きずります。細胞が基質から剥がれると、さまざまな量の膜損傷が発生し、溶液中の分子を取り込むことができます。スクレイプローディングとビーズローディングは、タンパク質や小分子を細胞に導入するために多くの生物学研究で使用されてきました。^[1]

1990年代後半から研究者たちは、ナノニードルと微細加工デバイスの使用を通じて、固体接触ベースの膜破壊の精度を向上させる研究を行ってきました。^[11] ナノニードルは2003年に初めて核酸トランスフェクションに使用され、 ^[82] 、2010年に多様な貨物の送達を実証しました。^[83]ナノニードル は、電気穿孔法、フローリザーバー、洗剤と組み合わせて、より多くの機能を追加してきました。^[84] さらに、ナノストローは、時間分解方式で細胞に分子を挿入および抽出するために使用されてきました。^[85]

1999年、ポリカーボネートフィルターの穴に細胞を通すと、細胞膜が一時的に破壊され、DNAトランスフェクションが実現することがわかった。^[86] この方法は「フィルトロポレーション」と呼ばれ、当時はあまり注目されなかった。2012年、MITの研究者は、シリコン製マイクロ流体デバイスの狭窄部に細胞を通すと、細胞膜が破壊され、さまざまな物質を細胞内に送達できることを発見した。^{[87] [88]セルスクイージングと呼ばれるこの方法は、細胞内送達技術を活用して}細胞ベースの治療法を 開発することに焦点を当てたSQZバイオテックという会社にスピンアウトした。細胞の流速とマイクロ流体狭窄部の形状とサイズを調整することで、セルスクイージングをさまざまな細胞タイプと送達アプリケーションに合わせて調整できる。他の研究グループは、マイクロふるいとPDMSベースのマイクロ流体デバイスでセルスクイージングの概念を実証した。^[89]

細胞の圧迫は電気穿孔法と組み合わされ、DNAやその他の物質を核に迅速に送達することを実現しています 。^[90]これは、まず細胞膜に穴を開け、次に電気パルスで1)核膜を破壊し、2) 負に帯電した核酸を細胞内に送り込むという仕組みです。^[91] マイクロ流体細胞の圧迫に続いて下流の電気穿孔法を行うと、核膜が一時的に破壊されますが、15分以内に修復されることが示されています。^[90]

流体せん断。細胞膜を制御的に破壊するために流体せん断力を使用する初期の例としては、従来の超音波 ^[92] 、懸濁液中の細胞に対するシリンジローディング ^[93] 、および接着細胞に対する コーンプレート粘度計の使用^{[94]などがあります。シリンジローディングでは、細胞懸濁液が細い針先を通して}シリンジ から吸い出され、排出されます。針の先端での流体せん断力は流速に依存し、細胞膜を破壊するように調整できます。1990 年代以降、細胞を透過させるために流体せん断力を使用するより正確な戦略には、マイクロ流体工学、超音波、衝撃波、およびレーザーベースの方法があります。^[1]

水性環境における吸収性物体へのレーザー照射は、キャビテーション、プラズマ生成、化学反応、熱など、さまざまな効果を生み出すことができます。^[1] レーザー粒子相互作用とレーザー表面相互作用の両方を利用して、細胞を局所的に集中した流体せん断力にさらすキャビテーションイベントを作成しています。たとえば、金属ナノ構造をシード構造として使用して、短いレーザーパルスエネルギーを収集し、それを非常に局所的な爆発性の蒸気泡に変換できます。このコンセプトの高スループットバージョンは、2015年に発表されました。 ^[95] 金属吸収体で裏打ちされた細孔が並んだ基板にレーザーを照射すると、接着細胞の基底側の下に爆発するキャビテーション気泡が生成されます。膜透過性を細孔を通じた貨物の能動的なポンピングと同期させることで、生きた細菌（> 1ミクロン）をいくつかの種類の細胞の細胞質に導入することに成功しました。

熱効果。細胞に分子を送達する簡単な方法は、穴が開くまで細胞膜を加熱することです。十分に高い温度では、構成分子の運動エネルギーが膜形成を維持する力、つまり脂質尾部から水をはじく疎水力よりも大きいため、脂質二重層が解離します。 ^[1] この方法の欠点は、非常に非特異的であり、細胞に過度の損傷を引き起こす可能性があることです。熱的手段で細胞を透過可能にする戦略には、(1) 凍結を伴う場合と伴わない場合がある冷却‐加熱サイクルを細胞に通す、(2) 生理学的温度を超える温度に細胞を加熱する、(3) 細胞の小さな部分を一時的に強力に加熱するなどがあります。^[1] 後者の場合、サーマルインクジェットプリンターは動物細胞の細胞内送達とトランスフェクションに効果的に使用されています。^[96] レーザー粒子相互作用は、細胞膜を熱的に正確に破壊することが報告されています。金ナノ粒子は高密度表面層に詰め込まれ、10秒を超える赤外線レーザー照射により細胞の裏側が加熱され、透過処理と染料、デキストラン、プラスミドの送達が引き起こされます。^[97] 2021年にこの概念はさらに発展し、研究者らは、生体適合性の電界紡糸ナノファイバーに埋め込まれた光感受性酸化鉄ナノ粒子が、細胞とナノ粒子が直接接触することなく、光熱効果によって膜透過処理を誘発できることを示しました。^{[98]この方法は、}胚性幹細胞やトランスフェクションが難しいT細胞などの接着細胞や懸濁細胞にCRISPR-Cas9機構とsiRNAを 送達することができました。

mRNA医薬品。脂質ナノ粒子製剤と核酸化学の進歩は、mRNAワクチンなどの核酸治療薬の開発に非常に重要でした。たとえば、脂質ナノ粒子製剤の主要成分である陽イオン性脂質の設計は、酸解離定数（pKa）がエンドソーム初期pHに近いため、エンドサイトーシス後に細胞質へのエンドソーム放出が可能になります。^[99] Moderna のCOVIDワクチンの脂質ナノ粒子は、イオン性脂質SM-102、コレステロール、1,2-ジステアロイル-snグリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、およびPEG 2000-DMGで構成され、mRNAをカプセル化します。^[4]ファイザー/ビオンテックのCOVIDワクチンは、アクイタス・セラピューティクス社のALC-0315脂質を使用し、コレステロール、DSPC、PEG脂質（ALC-0159 ）をmRNAとともに配合しています。^[4]筋肉内注射 後、ナノ粒子が細胞に入り、mRNAが細胞質に放出され、患者の細胞内でSARS-CoV2スパイクタンパク質の発現が起こります。

siRNA医薬品。 2018年にFDAから規制承認を受けた初のsiRNAベースの医薬品であるパティシランは、異常な病原性トランスサイレチン遺伝子のサイレンシングを目的としたsiRNAをパッケージングして肝臓に送達する脂質ナノ粒子製剤に基づいています。治療用siRNAは、2つの脂質賦形剤、DLin-MC3-DMAとPEG2000-C-DMGを使用して脂質ナノ粒子に製剤化され、患者の静脈内に注入されて肝臓の肝細胞を標的とします。さらに、siRNA治療薬中の化学修飾ヌクレオチドは、化学的安定性と有効性を改善し、特定の細胞タイプを標的とするのを助け、有害な免疫反応を軽減するのに役立ちます。 ^{[100]細胞への取り込みを改善し、特定の細胞タイプを標的とするために、}小分子、炭水化物、アプタマー、ペプチド、抗体などの 多様なリガンドがsiRNAに共有結合しています。例えば、GalNAc -siRNAコンジュゲートは、カチオン性物質を必要とせずにリガンドベースの細胞内在化のアプローチを提供するだけでなく、肝細胞を特異的に標的とします。^[101] GalNAc -siRNAコンジュゲートは、肝臓での ALAS1発現をダウンレギュレーションすることで急性肝性ポルフィリン症を治療するために投与される、FDA承認の2番目のsiRNA医薬品であるGivosiranに採用されました。

ASO医薬品。最初に承認されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）医薬品は、1998年に発表されたフォミビルセンで、サイトメガロウイルスmRNAの翻訳を阻害する21-merオリゴヌクレオチドです。^[102] ASOは、pre-mRNAまたはmRNAに結合することで、pre-mRNAの処理とスプライシングの修正、競合阻害、翻訳機構の立体的遮断、結合した標的RNAの分解などのメカニズムを通じて、転写後にタンパク質合成を調節できます。^{[43] ASOヌクレオシド、核酸塩基、およびヌクレオシド間骨格の化学修飾は、標的親和性と有効性を維持しながら、}薬物動態と薬力学を 改善するための鍵となります。治療効果のあるASOは大幅に修飾されているため、細胞内送達にキャリアを必要としません。医療に応用可能なASOのほとんどは、エンドサイトーシスによって細胞内に侵入し、細胞内の標的に結合することで治療効果を発揮する裸の分子である。^[4]

改良されたウイルスベクター。遺伝子治療の 臨床試験の約70％は、遺伝子送達ステップにウイルスベクターを利用しています。^[103] アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）およびレンチウイルスベクターは現在、バイオテクノロジーおよび臨床応用で使用されている主なウイルスベクターです。^[104] AAVは、ウイルスベクターの改良の顕著な例です。ベクターエンジニアリングは、AAVの形質導入効率（トランスジーンカセットを最適化することにより）、ベクター向性（カプシドエンジニアリングを使用）、カプシドおよびトランスジーンが宿主の免疫応答を回避する能力（これらのコンポーネントを遺伝子組み換えすることにより）を高め、AAVの大規模生産を最適化できます。 ^{[105]さらに、}指向性進化 を含むベクターエンジニアリングアプローチにより、AAVベクターの効率とターゲティングが大幅に強化され、場合によっては送達効率が100倍以上向上しました。^[106] AAVエンジニアリングの別の例として、機械学習を適用して、以前の曝露からの免疫応答を回避できるAAVバリアントを生成しました。^[107]

ウイルス様粒子。 ウイルス様粒子（VLP）は、ウイルスの遺伝物質に加えて、またはその代わりに、mRNA、タンパク質、RNPなどの貨物物質をパッケージ化したウイルスタンパク質の集合体です。VLPは既存のウイルスの足場から作られているため、貨物を包み込む能力、エンドソームを逃れる能力、異なる細胞型を標的とするように再プログラムされる能力など、効率的な細胞内送達を可能にするウイルスの自然特性を活用しています。しかし、ウイルスとは異なり、VLPはDNAではなくmRNAまたはタンパク質として貨物を送達できるため、ウイルスゲノム統合のリスクが大幅に軽減されます。そのため、VLPはウイルス送達と非ウイルス送達の両方の利点を提供できるため、遺伝子編集剤などの分子貨物を送達するための興味深いものです。^[108]遺伝子編集を目的として、 改変されたDNAフリーVLPが、塩基編集因子またはCas9リボ核タンパク質を効率的にパッケージ化して哺乳類細胞に送達することが最近示されました。 ^{[109] VLPによる遺伝子編集タンパク質の送達は、} in vitroでの プラスミドやウイルスの送達と比較して、オフターゲット編集を大幅に最小限に抑えることが報告されています。