指向性進化

指向性進化( DE ) は、タンパク質工学で用いられる手法であり、自然選択の過程を模倣して、タンパク質または核酸をユーザーが定義した目標に向かわせるものである。 ^{[1]これは、遺伝子に対して、}突然変異誘発 (変異体のライブラリを作成)、選択 (それらの変異体を発現させ、所望の機能を持つメンバーを分離)、増幅 (次のラウンドのテンプレートを生成)の反復ラウンドを施すことから構成される。これは、生体内(生体内) または試験管内(細胞内または溶液中の遊離) で実行することができる。指向性進化は、改変タンパク質を合理的に設計する代替手段としてのタンパク質工学、および制御された実験室環境での基本的な進化原理の実験的進化研究の両方に用いられる。

指向性進化は、1960年代^[2]の「シュピーゲルマンのモンスター」実験におけるRNA分子の進化に端を発しています。 ^[3]この概念は、ゲノム内の単一遺伝子の進化に有利な選択圧を受けた細菌の進化を通じて、タンパク質の進化にまで拡張されました。^[4]

1980年代の初期のファージディスプレイ技術では、変異の標的化と単一タンパク質の選択が可能でした。^{[5]これにより、強化された}結合タンパク質の選択が可能になりましたが、酵素の触媒活性の選択とはまだ互換性がありませんでした。^[6]酵素を進化させる方法は1990年代に開発され、この技術がより広い科学的な聴衆にもたらされました。^[7]この分野は、遺伝子変異体のライブラリーを作成し、その活性をスクリーニングするための新しい方法によって急速に拡大しました。^{[2] [8]指向性進化法の開発は、2018年に}フランシス・アーノルドに酵素の進化に対して、ジョージ・スミスとグレゴリー・ウィンターにファージディスプレイに対するノーベル化学賞が授与されたことで称えられました。^[9]

指向進化は、実験室環境で自然の進化サイクルを模倣したものです。進化には、複製子間の変異、変異が選択の対象となる適応度の違いを引き起こすこと、そしてこの変異が遺伝性であることという3つのことが必要です。指向進化では、突然変異誘発、選択またはスクリーニング、増幅の反復ラウンドによって単一の遺伝子が進化します。^[10]これらのステップのラウンドは通常繰り返され、1ラウンドの最良の変異を次のステップのテンプレートとして使用して段階的な改善を実現します。

指向性進化実験の成功の可能性は、総ライブラリサイズに直接関係しており、より多くの変異体を評価すれば、望ましい特性を持つ変異体を見つける可能性が高まる。^[11]

指向性進化のサイクルを実行する最初のステップは、変異遺伝子のライブラリを生成することです。ランダム配列の配列空間は広大で（100アミノ酸タンパク質に対して10 ^130の可能な配列）、機能性タンパク質が極めてまばらに存在します。実験的進化も^[12]自然進化も^{[13] [検証失敗]、}これほど多くの配列をサンプリングすることは決してできません。もちろん、自然進化は機能性タンパク質配列に近い変異配列をサンプリングし、DEでは既に機能している遺伝子を変異させることでこれを模倣します。いくつかの計算は、地球上の生命の進化の過程で、あらゆる実用的な目的（つまり機能的および構造的目的）で、タンパク質配列空間が完全に探索されたことは完全に実現可能であることを示唆しています。^[13]

出発遺伝子は、ランダムな点突然変異（化学的変異原またはエラーを起こしやすいPCRによる）^{[14] [15]}および挿入と欠失（トランスポゾンによる）^{[16]によって変異させることができる。} 遺伝子組み換えは、いくつかの配列（通常70%以上の配列同一性）をDNAシャッフル^{[17] [18]}して、シャッフルされた親遺伝子間の配列空間の領域にジャンプすることによって模倣することができる。最後に、遺伝子の特定の領域を体系的にランダム化して^[19]、構造と機能の知識に基づいたより焦点を絞ったアプローチをとることができる。方法に応じて、生成されたライブラリに含まれる機能的変異体の割合は変化する。目的の遺伝子を発現するために生物が使用される場合でも、その遺伝子のみを変異させることによって、生物のゲノムの残りの部分は同じままであり、進化実験では無視することができる（一定の遺伝的環境を提供する限りにおいて）。

突然変異の大部分は有害であるため、突然変異体のライブラリには活性が低下した変異体がほとんど含まれる傾向がある。^[20]そのため、望ましい特性を改善する有益な突然変異を持つ希少な変異体を見つけるには、活性を測定するハイスループットアッセイが不可欠である。機能的変異体を単離する方法には、主に2つのカテゴリがある。選択システムは、タンパク質機能と遺伝子の生存を直接結び付けるのに対し、スクリーニングシステムは各変異体を個別にアッセイし、望ましい活性の変異体または変異体の集団を選別するための定量的閾値を設定できるようにする。選択とスクリーニングはどちらも、生きた細胞内で行うことも（in vivo進化）、細胞なしでタンパク質またはRNAに直接行うこともできる（ in vitro進化）。^{[21] [22]}

生体内進化では、各細胞（通常は細菌または酵母）が、変異体ライブラリの異なるメンバーを含むプラスミドで形質転換されます。この方法では、目的の遺伝子のみが細胞間で異なり、他のすべての遺伝子は同じままです。細胞は、その機能をテストできる細胞質または表面のいずれかでタンパク質を発現します。この形式の利点は、細胞環境での特性を選択することであり、進化したタンパク質または RNA を生体内で使用する場合に便利です。細胞を使用せずに DE を実行する場合、溶液中に遊離した、または人工の微小液滴に区画化されたタンパク質または RNA を生成するために、in vitro転写翻訳が使用されます。この方法の利点は、選択条件（温度、溶媒など）においてより汎用性が高く、細胞に有毒なタンパク質を発現できることです。さらに、in vitro進化実験では、ライブラリ DNA を細胞に挿入する必要がないため（多くの場合、これが制限ステップになります） 、はるかに大きなライブラリ（最大 10 ^{15 ）を生成できます。}

結合活性の選択は概念的に単純である。標的分子を固体支持体上に固定化し、変異タンパク質のライブラリをその上に流し、結合性の低いものを洗い流し、結合した残りの変異体を回収して遺伝子を単離する。^[23]酵素を固定化共有結合阻害剤に結合することも、活性触媒を単離する試みとして使用されている。しかし、このアプローチでは単一の触媒ターンオーバーのみが選択されるため、基質結合や真の基質反応性の良いモデルではない。重要な代謝産物を合成するか毒素を破壊することによって、酵素活性が細胞の生存に必要となる場合、細胞の生存は酵素活性の関数である。^{[24] [25]このようなシステムは、一般に、細胞の}形質転換効率によってのみスループットが制限される。また、スクリーニングよりも安価で労働集約的であるが、通常、エンジニアリングが難しく、アーティファクトが発生しやすく、ライブラリに存在する 活性の範囲に関する情報が得られない。

選択の代替として、スクリーニング システムがあります。各変異遺伝子は個別に発現され、活性を定量的に測定するために分析されます(ほとんどの場合、発色性または蛍光性生成物によって)。次に、変異がランク付けされ、実験者は次の DE ラウンドのテンプレートとして使用する変異を決定します。最もハイ スループットな分析でも、通常は選択方法よりもカバレッジは低くなりますが、スクリーニングされた変異のそれぞれについて詳細な情報を生成できるという利点があります。この細分化されたデータは、単純な選択システムでは不可能な、ライブラリ内の活性の分布を特徴付けるためにも使用できます。したがって、スクリーニング システムには、適応進化と適応度ランドスケープを実験的に特徴付けるという点で利点があります。

機能性タンパク質が単離された場合、その遺伝子も単離される必要があり、そのため遺伝子型と表現型の関連が必要となる。^[24]これは共有結合である可能性があり、例えば、mRNAディスプレイでは、mRNA遺伝子がピューロマイシンによって翻訳の終わりにタンパク質に結合している。^{[12]あるいは、タンパク質とその遺伝子は、生細胞[26]}またはエマルジョン液滴[ ^27]内の区画化によって共局在化される可能性がある。単離された遺伝子配列は、次にPCRまたは形質転換された宿主細菌によって増幅される。単一の最良の配列、または配列のプールのいずれかを、次のラウンドの突然変異誘発のテンプレートとして使用することができる。多様化-選択-増幅の繰り返しサイクルにより、適用された選択圧に適応したタンパク質変異体が生成されます。

タンパク質の合理的な設計は、タンパク質の構造とその触媒メカニズムに関する詳細な知識に依存します。^{[28] [29]次に、タンパク質の機能を変更するために、}部位特異的変異誘発によって特定の変更が行われます。この欠点は、タンパク質の構造と作用メカニズムがよくわかっていても、突然変異による変化を予測することが依然として難しいことです。したがって、DEの利点は、目的の活性のメカニズムや突然変異がそれにどのような影響を与えるかを理解する必要がないことです。^[30]

指向性進化の制約は、多数の異なるランダム突然変異の影響を測定するために、ハイスループットアッセイが必要であることである。これは、指向性進化に使用する前に、広範な研究開発を必要とする可能性がある。さらに、このようなアッセイは、特定の活動を監視することに非常に特化していることが多く、新しいDE実験に転用することはできない。^[31]

さらに、アッセイ機能の改善を選択することは、アッセイ機能の改善を生むだけです。これらの改善がどのように達成されるかを理解するためには、進化する酵素の特性を測定する必要があります。アッセイ活性の改善は、酵素触媒活性または酵素濃度の改善による可能性があります。また、1 つの基質の改善が別の基質の活性を改善するという保証はありません。これは、目的の活性を直接スクリーニングまたは選択することができず、「プロキシ」基質が使用される場合に特に重要です。DE は、目的の活性を改善することなく、プロキシへの進化的特化につながる可能性があります。したがって、適切なスクリーニングまたは選択条件を選択することは、DE を成功させる上で不可欠です。^[32]

実験における進化の速度も、指向性進化の有用性に限界を生じさせる。例えば、特定の表現型の進化は理論的には可能だが、実際には不可能な時間スケールで起こる可能性がある。^{[33]最近の理論的アプローチは、統計物理学の}反非断熱駆動技術を応用して速度の限界を克服することを目指しているが、これはまだ指向性進化実験で実装されていない。^[34]

合理的設計と指向性進化の両方の限界に対処するために、組み合わせた「半合理的」アプローチが研究されています。^{[1] [35]}有益な突然変異はまれであるため、改善された変異体を見つけるには、多数のランダム突然変異体をスクリーニングする必要があります。「フォーカスライブラリ」は、DEの突然変異誘発ステップに有益な突然変異が豊富であると考えられるランダム化領域に集中しています。フォーカスライブラリには、従来のランダム突然変異誘発ライブラリよりも少ない変異体が含まれているため、このようなハイスループットスクリーニングは必要ありません。

焦点を絞ったライブラリを作成するには、構造内のどの残基を変異させるかについての知識が必要です。たとえば、酵素の活性部位に関する知識があれば、基質と相互作用することが知られている残基だけ をランダム化することができます。^{[36] [37]あるいは、どのタンパク質領域が本質的に}可変であるかについての知識があれば、それらの領域のみで突然変異を誘発することができます。^{[38] [39]}

指向性進化は、合理的設計の代替としてタンパク質工学によく使用されますが、^[40]酵素進化の基本的な問題を調査するためにも使用できます。^[41]

タンパク質工学ツールとして、DE は次の 3 つの分野で最も成功を収めています。

1. 高温や過酷な溶媒中でのバイオテクノロジー用途におけるタンパク質の安定性の向上^{[42] [43] [44]}
2. 治療用抗体の結合親和性の向上（親和性成熟）^{[45]および}新規に設計された酵素の活性^[30]
3. 既存の酵素の基質特異性を変えること^{[46] [47] [48] [49]}（多くの場合、産業での使用）^[40]

自然進化の研究は、伝統的に現存する生物とその遺伝子に基づいています。しかし、研究は化石の不足（特に古代のDNA配列の不足）^{[50] [51]}と古代の環境条件に関する知識の不完全さによって根本的に制限されています。指向性進化は、個々の酵素^{[52] [53] [35]} リボザイム^[54]および複製子^{[55] [3]}の遺伝子の制御されたシステムにおける進化を調査します（真核生物[56] [57]原核生物[58]およびウイルス[59]の実験的^進化に 似^ています^）。

DEは選択圧、突然変異率、環境（温度などの非生物的環境と生物内の他の遺伝子などの生物的環境の両方）の制御を可能にする。さらに、すべての進化中間遺伝子の完全な記録が存在する。これにより、エピスタシス、進化可能性、適応制約[ ^{60] [61]} 適応度地形^[62]、ニュートラルネットワーク^[63]などの進化プロセスの詳細な測定が可能になる。

プロテオームの天然アミノ酸組成は、実験的に課された選択圧下で、適切な非標準的な対応物による全体的な標準的なアミノ酸の置換によって変更することができます。たとえば、天然アミノ酸のフッ素化類似体による全体的なプロテオーム全体の置換は、大腸菌^[64]と枯草菌[ ^65]で試みられています。大腸菌の20899 UGGコドンに応答して、トリプトファンがチエノピロールアラニンに完全に置換されたことが、2015年にBudisaとSöllによって報告されました。^{[66]追加のアミノ酸を明確に適応させた微生物株の実験的進化は、実験的に}遺伝暗号を拡大するのに役立つと期待されています。^{[67]指向性進化は典型的には}突然変異誘発のために特定の遺伝子を標的とし、その結果生じた変異体を、適応度効果とは無関係に、関心のある表現型についてスクリーニングするが、適応的実験室進化は活発に成長している培養物の適応度に寄与するゲノム全体の多くの突然変異を選択する。^[68]

Scholia には、Directed evolutionのトピックプロファイルがあります。

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  • ネッド・ブディサ研究グループ
• SeSaM-Biotech – 指向的進化 2018-05-27 にWayback Machineでアーカイブ
• リーツ教授が指向性進化の原理を説明する
• 株式会社コデキシス