アプタマー

アプタマーは、特定の標的分子または標的分子ファミリーに結合する人工のssDNA、RNA、XNA、またはペプチドのオリゴマーです。アプタマーはさまざまな親和性（K D はpMからμMの範囲）を示し[ 1 ] [ 2 ] 、オフターゲット結合のレベル_もさまざま^で[ 3 ] 、^化学抗体に分類されることもあります。アプタマーと抗体は多くの同じ用途で使用できますが、ほとんどがオリゴヌクレオチドであるアプタマーの核酸ベースの構造は、タンパク質である抗体のアミノ酸ベースの構造とは大きく異なります。この違いにより、アプタマーはいくつかの目的では抗体よりも優れた選択肢となる場合があります（抗体の置換を参照）。

アプタマーは、生物学研究室の研究や医療検査で使用されています。複数のアプタマーを 1 つのアッセイに組み合わせると、サンプル内のさまざまなタンパク質を多数測定できます。アプタマーは、病気の分子マーカーを特定するために使用したり、薬剤、薬剤送達システム、制御薬剤放出システムとして機能したりできます。また、他の分子工学タスクにも使用されます。

アプタマーのほとんどは、膨大な種類の DNA 配列の中から有用なアプタマーを見つけるための試験管実験であるSELEXに由来しています。このプロセスは、自然選択、指向性進化、または人為選択によく似ています。SELEX では、研究者は、ランダムに生成された約1,000 兆個の異なるDNA または RNA 断片から構成される開始 DNA ライブラリから、最適なアプタマーを繰り返し選択します。SELEXの後、研究者はアプタマーを変異させたり、化学的性質を変えたりして別の選択を行ったり、合理的な設計プロセスを使用して改良を図ったりする場合があります。アプタマーを発見するためのSELEX 以外の方法も存在します。

研究者は、さまざまな有益な機能を実現するためにアプタマーを最適化しています。最も重要な機能は、選択したターゲットへの特異的かつ高感度な結合です。血清検査やアプタマー治療薬のように、アプタマーが体液にさらされる場合、 DNAやRNAを破壊するタンパク質による消化に耐えることが重要になることがよくあります。治療用アプタマーは、体内からゆっくりと排出されるように変更する必要があることがよくあります。ターゲットに結合すると形状が劇的に変化するアプタマーは、センサーのオン/オフを切り替える分子スイッチとして役立ちます。一部のアプタマーは、バイオセンサーや生物学的サンプルのテストに適合するように設計されています。アプタマーが事前に定義されたレベルまたは結合速度を達成することが有用な場合もあります。既知のアプタマーを生成するために使用される合成の収率は、より長いシーケンスでは急速に低下するため、^[4]研究者は製造コストを削減するために、アプタマーを最小限の結合シーケンスに切り詰めることがよくあります。

「アプタマー」という言葉は、アンドリュー・エリントンとジャック・ショスタックがこのテーマに関する最初の出版物で作った造語です。彼らは正確な定義を示しておらず、「私たちはこれらの個々のRNA配列をラテン語の「aptus」（適合する）から「アプタマー」と呼んでいます」と述べています。^[5]

しかし、この単語自体は、ギリシャ語のἅπτω（接続する、適合する、ホメロス（紀元前8世紀頃）^{[6] [7]}が使用した）とμέρος（より大きなものの構成要素）から派生したものです。^[8]

典型的なアプタマーは、DNA、RNA、XNA、またはペプチドの組み合わせの多様性を利用して、特定の標的分子または標的分子のファミリーに対する強力で特異的な結合を実現する合成リガンドです。アプタマーは、 「化学抗体」または「抗体模倣体」に分類されることがあります。^[9]しかし、ほとんどのアプタマーは、抗体の150 kDaのサイズとは対照的に、分子量が6〜30 kDaと小さく、典型的な抗体の2つの一致する抗原結合領域ではなく1つの結合部位を含みます。

1967年に初めて応用されて以来、^{[10]指向性進化法は新しい特性や機能を持つ}生体分子の開発に使用されてきました。初期の例としては、バクテリオファージQbeta複製システムの改変や、切断活性を改変したリボザイムの生成などが挙げられます。^[11]

1990年に、2つのチームが独立してSELEX（ Systematic Evolution of Ligands by EXponential enhancement）法を開発して発表し、RNAアプタマーを生成しました。ラリー・ゴールドの研究室では、 T4 DNAポリメラーゼに対するRNAリガンドを選択するプロセスにSELEXという用語を使用しました^[12]。ジャック・ショスタックの研究室では、さまざまな有機染料に対するRNAリガンドを選択しました^{[5] [13]。} 2年後、ショスタック研究室とギリアド・サイエンシズは、互いに独立して、in vitro選択スキームを使用して、それぞれ有機染料^[14]とヒトトロンビン^[15]のDNAアプタマーを生成しました。2001年に、SELEXはエリントン研究室のJ.コリン・コックスによって自動化され、数週間に及ぶ選択実験の期間がわずか3日間に短縮されました。^{[16] [17] [18]}

2002年、ロナルド・ブレーカーとエフゲニー・ヌドラーが率いる2つのグループが、核酸ベースの遺伝子調節要素であるリボスイッチの最初の決定的な証拠を発表しました。リボスイッチは、アプタマーと同様の分子認識特性を持っています。この発見は、地球上の生命の起源の仮定段階であるRNAワールド仮説を裏付けるものとなりました。^[19]

ほとんどのアプタマーは、20〜100塩基および3〜20 kDaの特定のオリゴマー配列に基づいています。機能強化のため、またはより大きな人工分子システムとの適合性のために化学修飾されているものもあります。 DNA、RNA、XNA、およびペプチドアプタマーの化学的性質はそれぞれ、保存安定性、血清または生体内での耐久性、特異性および感度、コスト、生成、増幅、および特性評価の容易さ、およびユーザーへの馴染みやすさの点で、異なるプロファイルを提供できます。通常、DNAベースおよびRNAベースのアプタマーは免疫原性が低く、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅可能で、複雑な二次構造および三次構造を持っています。^{[20] [21] [22] [23] DNAベースおよびXNAベースのアプタマーは優れた保存安定性を示します。XNAベースのアプタマーは、}結合親和性を高めたり、血清または生体内での耐久性を高めたりするために、追加の化学的多様性を導入できます。

遺伝的にコード化されたアミノ酸が22種類、天然に存在するアミノ酸が500種類以上存在するため、ペプチドアプタマーや抗体は、DNAやRNAの4つの核酸に比べて、単位長さあたりの組み合わせの多様性がはるかに高い可能性がある。^[24]核酸塩基またはバックボーンの化学修飾は、標準的な核酸塩基の化学的多様性を高める。^[25]

スプリットアプタマーは、分子切れによって2つに分断された大きな親アプタマーの断片である2本以上のDNA鎖で構成されています。^[26]各成分鎖がターゲットに結合する能力は、切れ目の位置と娘鎖の二次構造に依存します。^[27]ターゲット分子の存在は、DNA断片の結合をサポートします。これは、バイオセンサーの基礎として使用できます。^[28]組み立てられると、2本の別々のDNA鎖を1本の鎖に 連結できます。

未修飾アプタマーは血流から急速に除去され、半減期は数秒から数時間です。これは主に、アプタマーを物理的に破壊するヌクレアーゼ分解と、アプタマーの分子量とサイズが低いために腎臓から除去されるためです。2'-フッ素置換ピリミジンやポリエチレングリコール(PEG) 結合などのいくつかの修飾により、血清半減期は数日から数週間になります。PEG化により、体内での腎臓による除去を防ぐのに十分な質量とサイズを追加できます。未修飾アプタマーは凝固障害を治療できます。ヌクレアーゼの濃度が低く、除去率が低い眼に適用すると、除去とヌクレアーゼ消化の問題は軽減されます。 ^{[29]血清からの迅速な除去は、}体内診断画像などの一部の用途にも役立ちます。^[30]

^{エボラ感染に関連するタンパク質と結合するように設計されたアプタマー[31]}に関する研究では、標的タンパク質 EBOV sGP に結合する能力について、単離された 3 つのアプタマーの比較が行われました。これらのアプタマーは配列と構造の両方で異なりますが、EBOV と SUDV の sGP、および EBOV GP1.2 に対して非常に類似した相対的親和性を示しています。特に、これらのアプタマーは GP 遺伝子産物に対して高い特異性を示しました。特に、1 つのアプタマーは電気化学センサーの認識要素として効果的であることが証明され、溶液中の sGP と GP1.2、および膜コンテキスト内の GP1.2 の検出が可能になりました。この研究の結果は、タンパク質表面の特定の領域がアプタトロピック特性を持つ可能性があるという興味深い可能性を示しています。このような部位の主な特徴を特定し、アプタマーの 3D 構造予測を向上させることで、タンパク質上のアプタマー相互作用部位の予測精度を高めることができます。これにより、タンパク質に高い親和性で結合する可能性が高いアプタマーを特定できるほか、アプタマー結合に大きく影響する可能性のあるタンパク質変異を解明できる可能性があります。アプタマーとタンパク質間の構造に基づく相互作用を包括的に理解することは、アプタマーとタンパク質の結合の計算予測可能性を高めるために不可欠です。さらに、実験的な SELEX プロトコルの必要性を最終的に排除できる可能性があります。

アプタマーの標的には、小分子や重金属イオン、タンパク質などのより大きなリガンド、さらには細胞全体が含まれます。^{[32] [33]}これらの標的には、リゾチーム、^[34] トロンビン、^{[35] [36]}ヒト免疫不全ウイルストランスアクティング応答配列（HIV TAR）、^[37] ヘミン、^[38] インターフェロンγ、^[39] 血管内皮増殖因子（VEGF）、^{[40] [41]} 前立腺特異抗原（PSA）、^{[42] [43]} ドーパミン、^[44]および非古典的な癌遺伝子である熱ショック因子1（HSF1）が含まれます。^[45]

^{アプタマーは癌細胞、 [46]} プリオン、^[47]細菌、^[48]ウイルスに対して生成されている。アプタマーのウイルス標的には、インフルエンザA型およびB型ウイルス、^[49] 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、^[49] SARSコロナウイルス（SARS-CoV）^[49]およびSARS-CoV-2 ^{[50] が}含まれる。

アプタマーは、環境科学のプロテオミクスに特に有用である可能性がある。 ^[51]抗体は、他のタンパク質と同様に、核酸よりも配列決定が難しい。また、細胞培養によって生成されるか、動物の血清から採取されるため、維持および生成にコストがかかり、常に汚染のリスクがある。このため、あまり研究されていないタンパク質や種に関心のある研究者は、企業が関心のあるターゲットに対する抗体を製造、維持、または適切に品質検証しないことに気付く可能性がある。^[52]対照的に、アプタマーは配列決定が簡単で、正確な構造をデジタルで保存し、必要に応じて合成できるため、維持にコストがかからない。このため、資金不足の生物学研究対象に対する研究ツールとして、より経済的に実現可能になる可能性がある。アプタマーには、テオフィリン（お茶に含まれる）^[53]やアブシジン酸（植物免疫ホルモン）などの植物化合物用が存在する。^[54]キノコを標的としたアプタマーの例として、α-アマニチン（致死的なテングタケ中毒を引き起こす毒素）に対するアプタマーが開発されている。^[55]

アプタマーの用途は、センシング、治療、試薬製造、エンジニアリングのカテゴリーに大まかに分類できます。センシング用途は、環境、生物医学、疫学、バイオセキュリティ、基礎研究の用途で重要であり、アプタマーはアッセイ、イメージング法、診断アッセイ、バイオセンサーのプローブとして機能します。^{[32] [56] [57] [58] [59] [60]}治療用途と精密医療では、アプタマーは薬剤として、^[61]標的薬物送達媒体として、^[62]制御放出メカニズムとして、および小分子^{[63]およびタンパク質の}ハイスループットスクリーニングによる薬剤発見の試薬として機能します。^{[64] [65]}アプタマーは、タンパク質生産のモニタリング、品質管理、および精製に使用されます。^{[66] [67] [68]}アプタマーは、PCR の信頼性を高めるために DNA ポリメラーゼを強化するなど、分子工学用途でタンパク質を改変する方法として機能することができます。^{[69] [70] [71] [72]}

アプタマーの親和性はダイナミックレンジと検出限界にも影響するため、高濃度の標的分子を分析する場合は親和性の低いアプタマーが望ましい場合があります。^[73]アフィニティークロマトグラフィーは、アプタマーなどの親和性試薬が標的に結合して放出する能力にも依存し、親和性が低いと標的分子の放出が促進される可能性があります。^[74]したがって、特定のアプリケーションによってアプタマー親和性の有効範囲が決まります。

アプタマーは、多くのバイオテクノロジー用途で抗体の代わりとなることができる。^{[75] [52]}実験室研究および臨床診断では、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、^[76]ウエスタンブロット、^[77]免疫組織化学（IHC）、^[78]フローサイトメトリーなど、アプタマーベースの免疫測定法で使用することができる。^[79]治療薬としては、リガンドのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能することができる。 ^[80]抗体はよく発達した市場を持つ馴染みのある技術であるが、アプタマーはほとんどの研究者にとって比較的新しい技術であり、アプタマーは重要な研究ターゲットのほんの一部に対してのみ生成されている。^{[81]抗体とは異なり、未修飾アプタマーは血清中のヌクレアーゼ分解や}生体内での腎クリアランスの影響を受けやすい。アプタマーは抗体よりもサイズと質量がはるかに小さいため、特定の用途に最も適したものを選択する際に重要な要因となる可能性がある。アプタマーが特定の用途に利用できる場合、抗体に比べてアプタマーの利点としては、免疫原性が低い可能性があること、複製性が高くコストが低いこと、 in vitro選択条件による制御レベルが高いこと、耐久性、特異性、感度を効率的に設計できることなどが挙げられます。^[82]

さらに、アプタマーは研究動物の使用削減にも貢献する。^[83]抗体は初期の発見やポリクローナル抗体の場合には生産に動物に頼ることが多いが、アプタマーの選択と生産は通常は動物を使用しない。しかし、ファージディスプレイ法では、試験管内で抗体を選択し、続いてモノクローナル細胞株から生産することができるため、動物の使用を完全に回避できる。^[84]

アプタマーはタンパク質などの分子に可逆的に結合する能力があるため、成長因子などの治療用生体分子の制御放出を促進するためにアプタマーを使用することに関心が高まっています。これは、成長因子を受動的に放出するように結合強度を調整することによって達成できます^[85] 。また、アプタマーと相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション^[86]や、細胞の牽引力によるアプタマーの展開などのメカニズムによる能動的な放出も可能です^{[87] 。}

アプタマーは特定の分子に可逆的に結合する能力があることで知られており、血管新生を促進する成長因子を正確に送達するために3Dバイオプリンティング組織で使用されています。^{[88] [89]}この制御された送達により、成長因子を適切な場所と時間に放出することができ、局所的で複雑な血管ネットワークの形成が促進されます。さらに、これらのネットワークの特性は、成長因子が時間の経過とともにどのように放出されるかを調整することによって微調整できるため、このアプローチは血管化された人工組織を作成するための強力なツールになります。

AptaBiD（アプタマー促進バイオマーカー発見）は、バイオマーカー発見のためのアプタマーベースの方法である。^[90]

ほとんどのアプタマーはDNA、RNA、またはXNAに基づいていますが、ペプチドアプタマー^[91]は特定の標的分子に結合するように選択または設計された人工タンパク質です。

ペプチドアプタマーは、タンパク質骨格によって表示される可変配列の1つ以上のペプチドループで構成されています。ペプチドアプタマーの「ヘッド」が独自の配列の二本鎖DNAの「テール」に共有結合しているオタマジャクシと呼ばれる誘導体は、DNAテールのPCR（たとえば、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用）によって混合物中の希少な標的分子を定量化できます。^[92]アプタマー可変領域を形成するペプチドは、骨格と同じポリペプチド鎖の一部として合成され、骨格との結合によってN末端とC末端で制約されます。この二重構造制約により、可変領域が採用できる3D構造の多様性が減少します。^[93]この構造多様性の減少により、標的との相互作用によって可変領域が均一な構造を採用する場合、 分子結合のエントロピーコストが低下します。

最も一般的なペプチドアプタマー選択システムは酵母ツー ハイブリッドシステムである。ペプチドアプタマーは、ファージディスプレイやmRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、バクテリアディスプレイ、酵母ディスプレイなどの他の表面ディスプレイ技術によって構築されたコンビナトリアルペプチドライブラリから選択することもできる。これらの実験手順はバイオパニングとしても知られている。コンビナトリアルペプチドライブラリからパニングされたすべてのペプチドは、 MimoDBデータベースに保存されている。^{[94] [95]}

ペプチドアプタマーのライブラリは「変異原」として使用され、研究者は異なるペプチドアプタマーを発現するライブラリを細胞集団に導入し、望ましい表現型を選択し、その表現型を引き起こすアプタマーを特定する。研究者は次に、それらのアプタマーを、例えば酵母ツーハイブリッドスクリーニングで餌として使用し、それらのアプタマーが標的とする細胞タンパク質を特定する。このような実験では、アプタマーが結合する特定のタンパク質と、アプタマーが破壊するタンパク質相互作用を特定し、表現型を引き起こす。[ ^{96] [97]}さらに、適切な機能部分で誘導体化されたペプチドアプタマーは、標的タンパク質の特定の翻訳後修飾を引き起こしたり、標的の細胞内局在を変更したりすることができる。^[98]

アプタマーをベースにした商用製品や企業には、医薬品マクゲン（ペガプタニブ）^[99]や臨床診断会社ソマロジック^[100]などがある。アプタマー研究コミュニティの専門団体である国際アプタマー学会（INSOAP）は、このテーマに特化したジャーナル「アプタマー」を発行している。Apta-index ^[101]は、700を超えるアプタマーをカタログ化し、注文プロセスを簡素化する最新のデータベースである。