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DNAシーケンシングは、核酸配列（ DNA内のヌクレオチドの順序）を決定するプロセスです。これには、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの4つの塩基の順序を決定するために使用されるあらゆる方法または技術が含まれます。迅速なDNAシーケンシング方法の出現により、生物学および医学の研究と発見が大幅に加速されました。[1] [2]
DNA配列に関する知識は、基礎生物学研究、DNAジェノグラフィックプロジェクト、医療診断、バイオテクノロジー、法医学、ウイルス学、生物系統学などの数多くの応用分野で不可欠となっている。健康なDNA配列と変異したDNA配列を比較することで、さまざまな癌を含むさまざまな疾患を診断したり、[3]抗体レパートリーを特徴付けたり、[4]患者の治療を導くために使用したりすることができる。[5] DNAを迅速に配列決定する方法があれば、より迅速かつ個別化された医療を施すことができ、より多くの生物を識別してカタログ化することができる。[4]
DNA 配列決定技術の急速な進歩は、人間だけでなく、数多くの動物、植物、微生物種を含むさまざまな生命体の完全なゲノムの配列決定に重要な役割を果たしてきました。
最初のDNA配列は、1970年代初頭に学術研究者によって2次元クロマトグラフィーに基づく面倒な方法を用いて得られました。DNAシーケンサーを使用した蛍光ベースの配列決定法の開発に続いて、[6] DNA配列決定はより簡単かつ桁違いに速くなりました。[7] [8]
アプリケーション
DNA 配列決定は、個々の遺伝子、より大きな遺伝子領域 (遺伝子のクラスターまたはオペロン)、完全な染色体、またはあらゆる生物のゲノム全体の配列を決定するために使用できます。DNA 配列決定は、 RNAまたはタンパク質を間接的に配列決定する (オープン リーディング フレーム経由)最も効率的な方法でもあります。実際、DNA 配列決定は、生物学や医学、法医学、人類学などの他の科学の多くの分野で重要な技術になっています。
分子生物学
シーケンシングは分子生物学においてゲノムとそれがコード化するタンパク質を研究するために使用されます。シーケンシングによって得られた情報により、研究者は遺伝子と非コード化 DNA (調節配列を含む) の変化、疾患と表現型との関連性を特定し、潜在的な薬剤ターゲットを特定することができます。
進化生物学
DNAは世代から世代への伝達に関して情報量の多い高分子であるため、DNA配列は進化生物学において、さまざまな生物がどのように関連し、どのように進化したかを研究するために使用されます。2021年2月、科学者たちは初めて、 100万年以上前の動物の遺体（この場合はマンモス）のDNA配列を解析したと報告しました。これは、これまでに配列解析された最古のDNAです。[9] [10]
メタゲノミクス
メタゲノミクスの分野には、水域、下水、土、空気からろ過された破片、または生物の綿棒サンプルに存在する生物の識別が含まれます。特定の環境にどのような生物が存在するかを知ることは、生態学、疫学、微生物学、およびその他の分野の研究にとって重要です。研究者は、たとえば、 配列決定によって、マイクロバイオームに存在する可能性のある微生物の種類を判断できます。
ウイルス学
ほとんどのウイルスは光学顕微鏡では見えないほど小さいため、シーケンシングはウイルスを特定し研究するためのウイルス学の主要なツールの1つです。[11]ウイルスゲノムはDNAまたはRNAに基づいています。RNAウイルスは臨床サンプルでより速く分解されるため、ゲノムシーケンシングにはより時間に敏感です。[12]従来のサンガーシーケンシングと次世代シーケンシングは、基礎研究と臨床研究、新興ウイルス感染症の診断、ウイルス病原体の分子疫学、薬剤耐性試験でのウイルスのシーケンシングに使用されています。 GenBankには230万を超える固有のウイルス配列があります。[11]最近、NGSは従来のサンガーを上回り、ウイルスゲノムを生成するための最も人気のあるアプローチになりました。[11]
1997年の鳥インフルエンザの流行の際、ウイルスの配列解析により、インフルエンザの亜型はウズラと家禽の間で遺伝子組換えによって発生したことが判明した。これにより香港では、市場で生きたウズラと家禽を一緒に販売することを禁止する法律が制定された。ウイルスの配列解析は、分子時計技術を使用してウイルスの流行がいつ始まったかを推定するためにも使用できる。[12]
薬
医療技術者は、遺伝性疾患のリスクがあるかどうかを判断するために、患者の遺伝子（または理論的には全ゲノム）の配列を決定することがあります。これは遺伝子検査の一種ですが、遺伝子検査によっては DNA 配列決定を伴わないものもあります。
2013年現在、DNAシークエンシングは希少疾患の診断と治療にますます利用されています。希少遺伝性疾患を引き起こす遺伝子がますます多く特定されるにつれて、患者に対する分子診断がより主流になります。DNAシークエンシングにより、臨床医は遺伝性疾患を特定し、疾患管理を改善し、生殖カウンセリングを提供し、より効果的な治療を行うことができます。[13]遺伝子シークエンシングパネルは、疑われる疾患の複数の潜在的な遺伝的原因を特定するために使用されます。[14]
また、DNA配列解析は特定の細菌を特定し、より正確な抗生物質治療を可能にするのに役立ち、細菌集団における抗菌薬耐性の発生リスクを軽減する可能性がある。 [15] [16] [17] [18] [19] [20]
法医学調査
DNAシークエンシングは、 DNAプロファイリング法と併せて、法医学的身元確認[21]や父子鑑定に用いられることがあります。DNA検査は過去数十年で飛躍的に進歩し、最終的にはDNAプリントを調査対象と結び付けるようになりました。指紋、唾液、毛包などのDNAパターンは、各生物を他の生物と区別するものです。DNA検査は、DNA鎖内の特定のゲノムを検出して、ユニークで個別のパターンを生成する技術です。
DNA 配列解析は、過去数十年にわたって DNA 指紋を調査対象と最終的に結び付けるまでに大きく進化したため、法医学的身元確認や親子鑑定にDNA プロファイリング法と併用されることがあります。指紋、唾液、毛包、その他の体液に含まれる DNA パターンは、各生物を一意に区別するものであるため、法医学の分野では非常に貴重なツールとなっています。DNA 検査のプロセスでは、DNA 鎖内の特定のゲノムを検出して、一意で個別のパターンを生成します。このパターンを使用して、個人を特定したり、関係を決定したりできます。
DNA 配列解析技術の進歩により、大量の遺伝子データを迅速かつ正確に分析および比較できるようになり、捜査官は証拠を収集して犯罪をより効率的に解決できるようになりました。この技術は、法医学的身元確認、父子鑑定、従来の身元確認方法が利用できない、または信頼できない場合の人物確認など、さまざまな用途に使用されています。また、DNA 配列解析の使用により、DNA 表現型解析などの新しい法医学技術も開発され、捜査官は遺伝子データに基づいて個人の身体的特徴を予測できるようになりました。
法医学での応用に加えて、DNA シーケンシングは医学研究や診断にも使用されています。これにより、科学者は特定の病気や障害に関連する遺伝子の突然変異や変異を特定できるようになり、より正確な診断と的を絞った治療が可能になります。さらに、DNA シーケンシングは保全生物学でも使用され、絶滅危惧種の遺伝的多様性を研究し、それらの保全戦略を開発しています。
さらに、DNA シーケンシングの使用は、重要な倫理的および法的考慮事項も引き起こしています。たとえば、遺伝子データのプライバシーとセキュリティ、および遺伝子情報に基づく悪用や差別の可能性に関する懸念があります。その結果、DNA シーケンシング技術の責任ある使用を確保するための規制とガイドラインの必要性について議論が続いています。
全体として、DNA 配列解析技術の発展は法医学の分野に革命をもたらし、遺伝学、医学、保全生物学に対する理解に広範囲にわたる影響を及ぼしています。
4つの基準
DNAの標準的な構造は、チミン（T）、アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）の4つの塩基から構成されています。DNA配列決定とは、DNA分子内のこれらの塩基の物理的順序を決定することです。しかし、分子内に存在する可能性のある塩基は他にもたくさんあります。一部のウイルス（具体的にはバクテリオファージ）では、シトシンがヒドロキシメチルシトシンまたはヒドロキシメチルグルコースシトシンに置き換えられている場合があります。 [22]哺乳類のDNAでは、メチル基またはリン酸硫酸基を持つ変異塩基が見つかることがあります。[23] [24]配列決定技術によっては、特定の修飾、例えばヒトによく見られる5mC（5メチルシトシン）が検出される場合とされない場合があります。[25]
ほとんどすべての生物において、DNAは4つの標準塩基のみを使用して体内で合成されます。複製後に起こる修飾により、5メチルCなどの他の塩基が生成されます。ただし、一部のバクテリオファージは非標準塩基を直接組み込むことができます。[26]
DNAは修飾に加え、紫外線や酸素ラジカルなどの環境因子による攻撃を常に受けています。現時点では、このような損傷を受けた塩基の存在はほとんどのDNA配列解析法では検出されませんが、PacBioはこれについて発表しています。[27]
歴史
DNAの構造と機能の発見
デオキシリボ核酸 ( DNA ) は、1869 年にフリードリヒ・ミーシャーによって初めて発見され、単離されましたが、生命の遺伝的設計図を保持しているのは DNA ではなくタンパク質であると考えられていたため、何十年も研究されていませんでした。この状況は、1944 年以降、オズワルド・エイブリー、コリン・マクラウド、マクリン・マッカーティによる実験で、精製された DNA が細菌の 1 つの株を別の株に変えることができることが実証されたことで変わりました。これは、 DNA が細胞の特性を変えることができることが示された初めてのケースでした。
1953年、ジェームズ・ワトソンとフランシス・クリックは、ロザリンド・フランクリンが研究していた結晶化されたX線構造に基づいて、DNAの二重らせんモデルを提唱した。このモデルによると、DNAは互いに巻き付いて水素結合で結びつき、反対方向に走る2本のヌクレオチド鎖で構成されている。各鎖は、アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、チミン（T）の4つの相補的なヌクレオチドで構成されており、一方の鎖のAは必ずもう一方の鎖のTと対になり、Cは必ずGと対になっている。彼らは、このような構造により、各鎖を使用してもう一方の鎖を再構築できると提唱した。これは、世代間で遺伝情報を伝達する上で中心的な考え方である。[28]
タンパク質の配列決定の基礎は、 1955年までに膵臓から分泌される小さなタンパク質であるインスリンのアミノ酸配列をすべて完成させたフレデリック・サンガーの研究によって初めて築かれた。これは、タンパク質が液体に浮遊する物質のランダムな混合物ではなく、特定の分子パターンを持つ化学物質であるという最初の決定的な証拠となった。サンガーのインスリンの配列決定の成功は、ワトソンやクリックなどのX線結晶学者を刺激した。彼らは当時、DNAが細胞内でタンパク質の形成をどのように指示するかを理解しようとしていた。1954年10月にフレデリック・サンガーが行った一連の講義に出席して間もなく、クリックはDNAのヌクレオチドの配列がタンパク質のアミノ酸配列を決定し、それがタンパク質の機能を決定するのに役立つという理論を展開し始めた。彼は1958年にこの理論を発表した。[29]
RNAシークエンシング
RNAシーケンシングは、ヌクレオチドシーケンシングの最も初期の形態の1つでした。RNAシーケンシングの大きなランドマークは、1972年[30]と1976年にゲント大学（ベルギー、ゲント）のウォルター・フィアースと彼の同僚によって特定され発表されたバクテリオファージMS2の最初の完全な遺伝子と完全なゲノムの配列です。 [31]従来のRNAシーケンシング法では、 cDNA分子を作成し、それをシーケンシングする必要があります。[32]
従来のRNAシーケンシング法
従来の RNA シーケンス法には、いくつかのステップが含まれます。
1)逆転写：最初のステップは、逆転写酵素と呼ばれる酵素を使用して、RNA分子を相補DNA（cDNA）分子に変換することです。
2) cDNA 合成: cDNA 分子は、PCR (ポリメラーゼ連鎖反応)と呼ばれるプロセスを通じて合成され、cDNA を増幅して複数のコピーを生成します。
3)配列決定：増幅された cDNA は、サンガー配列決定法やマクサム・ギルバート配列決定法などの技術を使用して配列決定されます。
課題と限界
従来の RNA シーケンス法にはいくつかの制限があります。たとえば、
cDNA 分子の作成が必要であり、時間と労力がかかります。エラーやバイアスが発生しやすく、配列結果の精度に影響する可能性があります。また、希少または低存在量の転写産物を検出する能力にも限界があります。
RNAシーケンシング技術の進歩
近年、RNA シーケンシング技術の進歩により、これらの制限の一部が解消されました。次世代シーケンシング(NGS) や単一分子リアルタイム (SMRT) シーケンシングなどの新しい手法により、RNA 分子のシーケンシングがより高速かつ正確で、コスト効率に優れています。これらの進歩により、遺伝子発現の研究、新しい遺伝子の特定、遺伝子発現の調節の理解に新たな可能性が開かれました。
初期のDNA配列決定法
DNA配列を決定する最初の方法は、1970年にコーネル大学のレイ・ウーによって確立された位置特異的プライマー伸長戦略でした。 [33] DNAポリメラーゼ触媒と特異的ヌクレオチド標識は、どちらも現在の配列決定スキームで重要な役割を果たしており、ラムダファージDNAの付着末端の配列決定に使用されました。[34] [35] [36] 1970年から1973年にかけて、ウー、R・パドマナバン、および同僚は、この方法が合成位置特異的プライマーを使用して任意のDNA配列を決定するために使用できることを実証しました。[37] [38] [8]その後、フレデリック・サンガーは、英国ケンブリッジのMRCセンターでこのプライマー伸長戦略を採用し、より迅速なDNA配列決定法を開発し、1977年に「連鎖停止阻害剤によるDNA配列決定」の方法を発表しました。 [39]ハーバード大学のウォルター・ギルバートとアラン・マクサムも、「化学分解によるDNA配列決定」を含む配列決定法を開発しました。[40] [41] 1973年、ギルバートとマクサムは、ワンダリングスポット分析と呼ばれる方法を使用して24塩基対の配列を報告しました。[42]配列決定の進歩は、DNAサンプルをウイルス以外のソースから分離することを可能にする 組み換えDNA技術の同時開発によって促進されました。
全ゲノムの配列決定
最初に完全なDNAゲノムが解読されたのは、1977年のバクテリオファージφX174のゲノムでした。 [43] 医学研究評議会の科学者は1984年にエプスタイン・バーウイルスの完全なDNA配列を解読し、172,282ヌクレオチドが含まれていることを発見しました。この配列の完成は、ウイルスの遺伝子プロファイルに関する事前の知識なしに達成されたため、DNA配列決定における重要な転換点となりました。[44] [8]
1980年代初頭、ハーバート・ポールらは、電気泳動中に配列反応混合物のDNA分子を固定化マトリックスに移す非放射性法を開発した。 [45] [46]その後、 GATCバイオテック社によるDNAシーケンサー「Direct-Blotting-Electrophoresis-System GATC 1500」が商品化され、EUゲノム配列決定プログラムの枠組みで集中的に使用され、酵母サッカロミセス・セレビシエの第2染色体の完全なDNA配列が決定された。[47] カリフォルニア工科大学のリロイ・E・フッドの研究室は、1986年に初の半自動DNAシーケンシングマシンを発表しました。[48]これに続いて、 1987年にアプライドバイオシステムズ社が初の全自動シーケンシングマシンであるABI 370を販売し、デュポン社は新しい蛍光標識技術を使用して4つのジデオキシヌクレオチドすべてを1つのレーンで識別できるジェネシス2000 [49]を発売しました。1990年までに、米国国立衛生研究所（NIH）は、マイコプラズマ・カプリコラム、大腸菌、線虫、サッカロミセス・セレビシエの大規模なシーケンシング試験を1塩基あたり0.75ドルのコストで開始しました。一方、クレイグ・ベンターの研究室では、発現配列タグと呼ばれるヒトcDNA配列の配列決定が始まり、ヒトゲノムのコード部分を捕捉する試みが行われました。[50] 1995年、ベンター、ハミルトン・スミス、およびゲノム研究所（TIGR）の同僚は、自由生活生物であるインフルエンザ菌の最初の完全なゲノムを発表しました。環状染色体には1,830,137塩基が含まれており、サイエンス誌[51]での発表は、全ゲノムショットガン配列決定の最初の公開例となり、初期のマッピング作業の必要性がなくなりました。
2001年までに、ショットガンシークエンシング法が使用され、ヒトゲノムのドラフト配列が作成されました。[52] [53]
ハイスループットシーケンシング（HTS）法
1990 年代半ばから後半にかけて、DNA シーケンシングの新しい方法がいくつか開発され、2000 年までに市販のDNA シーケンサーに実装されました。これらはまとめて「次世代」または「第 2 世代」シーケンシング (NGS) 方法と呼ばれ、サンガー シーケンシングなどの以前の方法と区別されています。第 1 世代のシーケンシングとは対照的に、NGS テクノロジは一般に、非常にスケーラブルで、ゲノム全体を一度にシーケンシングできるという特徴があります。通常、これはゲノムを小さな断片に断片化し、断片をランダムにサンプリングし、以下で説明するようなさまざまなテクノロジのいずれかを使用してシーケンシングすることで実現されます。ゲノム全体をシーケンシングできるのは、自動化されたプロセスで複数の断片を一度にシーケンシングするためです (そのため、「大規模並列」シーケンシングと呼ばれます)。
NGS 技術は、研究者が健康に関する洞察を探求し、人類学者が人類の起源を調査する上で大きな力となり、「個別化医療」運動を促進しています。しかし、NGS 技術は、より多くのエラーの余地も生み出しました。NGS データの計算分析を実行するソフトウェア ツールは数多くあり、多くの場合、CSI NGS Portal などのオンライン プラットフォームにまとめられており、それぞれ独自のアルゴリズムを備えています。1 つのソフトウェア パッケージ内のパラメーターでさえ、分析結果が変わる可能性があります。さらに、DNA シーケンシングによって生成される大量のデータには、配列分析用の新しい方法とプログラムの開発も必要です。これらの課題に対処するために、NGS 分野で標準を開発する取り組みがいくつか試みられてきましたが、そのほとんどは個々の研究室から生まれた小規模な取り組みでした。最近では、FDA の資金提供を受けた大規模で組織的な取り組みがBioCompute標準に結実しました。
1990年10月26日、ロジャー・ツィエン、ペピ・ロス、マーガレット・ファネストック、アラン・J・ジョンストンは、DNAアレイ（ブロットおよび単一DNA分子）上で除去可能な3'ブロッカーを使用した段階的（「塩基ごと」）シーケンシングを記述した特許を申請した。[55] 1996年、ストックホルム王立工科大学のポール・ニレンと彼の学生モスタファ・ロナギは、パイロシーケンシングの方法を発表した。[56]
1997年4月1日、パスカル・マイヤーとローラン・ファリネッリは、DNAコロニーシーケンシングに関する特許を世界知的所有権機関に提出した。[57]この特許に記載されているDNAサンプルの準備とランダム表面ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アレイ法は、ロジャー・ツィエンらの「塩基ごとの」シーケンシング法と組み合わされ、現在イルミナのHi-Seqゲノムシーケンサーに実装されている。
1998年、ワシントン大学のフィル・グリーンとブレント・ユーイングは、シーケンサーデータ分析のためのphred品質スコアを発表しました。 [58]これは画期的な分析手法として広く採用され、現在でもシーケンシングプラットフォームの精度を評価するための最も一般的な指標となっています。[59]
Lynx Therapeuticsは2000年に大規模並列シグネチャシーケンシング（MPSS）を発表し、販売した。この方法は、並列化されたアダプタ/ライゲーション媒介ビーズベースのシーケンシング技術を組み込んでおり、最初の市販の「次世代」シーケンシング方法として機能したが、独立した研究室にDNAシーケンサーは販売されなかった。[60]
基本的な方法
マクサム・ギルバート配列
アラン・マクサムとウォルター・ギルバートは1977年にDNAの化学修飾とそれに続く特定の塩基での切断に基づくDNA配列決定法を発表しました。[40]化学配列決定としても知られるこの方法は、二本鎖DNAの精製サンプルをそれ以上のクローニングなしで使用できました。この方法は放射性標識を使用し、技術的に複雑なため、サンガー法が改良された後、広範囲に使用されていませんでした。
マクサム・ギルバート配列決定法では、DNA の 5' 末端の 1 つに放射性標識を付け、配列決定する DNA 断片を精製する必要がある。その後、化学処理により、4 つの反応 (G、A+G、C、C+T) のそれぞれで 4 つのヌクレオチド塩基のうち 1 つまたは 2 つに小さな割合で切断が生じる。修飾化学物質の濃度は、DNA 分子あたり平均 1 つの修飾を導入するように制御される。このようにして、放射性標識末端から各分子の最初の「切断」部位まで、一連の標識断片が生成される。4 つの反応の断片は、サイズ分離のために変性アクリルアミドゲルで並べて電気泳動される。断片を視覚化するために、ゲルをオートラジオグラフィー用の X 線フィルムにさらすと、放射性標識 DNA 断片に対応する一連の暗いバンドが得られ、そこから配列を推測することができる。[40]
この方法は2023年現在ではほとんど廃止されている。[61]
連鎖停止法
1977年にフレデリック・サンガーと同僚らが開発した連鎖停止法は、比較的簡単で信頼性が高いため、すぐに選択される方法となった。 [39] [62]発明された連鎖停止法は、マクサムとギルバート法よりも毒性化学物質の使用が少なく、放射能の量も少なかった。比較的簡単であったため、サンガー法はすぐに自動化され、第一世代のDNAシーケンサーで使用された方法となった。
サンガー法は、1980年代から2000年代半ばまで広く普及していた手法である。この期間に、蛍光標識、キャピラリー電気泳動、一般的な自動化など、この技術は大きく進歩した。これらの進歩により、はるかに効率的なシーケンシングが可能になり、コストが削減された。大量生産形態のサンガー法は、 2001年に最初のヒトゲノムを生成した技術であり、ゲノミクスの時代を先導した。しかし、10年後には、根本的に異なるアプローチが市場に登場し、ゲノムあたりのコストは2001年の1億ドルから2011年には1万ドルにまで下がった。[63]
合成による配列決定
合成によるシーケンシング（SBS）の目的は、DNAポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みを検出することでDNAサンプルの配列を決定することです。人工ポリメラーゼを使用して一本鎖DNAのコピーを合成し、各ヌクレオチドの取り込みを監視します。合成によるリアルタイムシーケンシングの原理は1993年に初めて説明され[64]、数年後に改良版が発表されました。[65] SBSのすべての実施形態の主要部分は非常に類似しており、（1）DNAの増幅（後続の信号を増強するため）および配列決定するDNAを固体支持体に付着させる、（2）固体支持体上での一本鎖DNAの生成、（3）設計されたポリメラーゼを使用したヌクレオチドの組み込み、および（4）ヌクレオチドの組み込みのリアルタイム検出が含まれます。ステップ3〜4が繰り返され、ステップ4で得られた信号から配列が組み立てられます。このリアルタイム合成によるシーケンシングの原理は、 454、PacBio、IonTorrent、Illumina、MGIなど、ほぼすべての大規模並列シーケンシング機器に使用されています。
大規模シーケンシングと新たにシーケンス
大規模シーケンシングは、多くの場合、染色体全体などの非常に長い DNA 断片のシーケンシングを目的としていますが、大規模シーケンシングは、ファージディスプレイで見られるような非常に大量の短い配列を生成するためにも使用できます。染色体などの長いターゲットの場合、一般的なアプローチは、大きな DNA 断片を切断 (制限酵素を使用) またはせん断 (機械力を使用) して短い DNA 断片にするものです。断片化された DNA は、DNA ベクターにクローニングされ、大腸菌などの細菌宿主で増幅されます。個々の細菌コロニーから精製された短い DNA 断片は、個別にシーケンシングされ、電子的に 1 つの長く連続した配列に組み立てられます。研究では、均一なサイズの DNA 断片を収集するためのサイズ選択ステップを追加すると、シーケンシングの効率とゲノムアセンブリの精度が向上することが示されています。これらの研究では、自動サイジングは手動のゲルサイジングよりも再現性が高く、正確であることが証明されています。[66] [67] [68]
「デ ノボシーケンシング」という用語は、特に、これまで配列が知られていない DNA の配列を決定するために使用される方法を指します。デ ノボはラテン語で「最初から」と翻訳されます。アセンブルされた配列のギャップは、プライマー ウォーキングによって埋めることができます。さまざまな戦略には、速度と精度のトレードオフが異なります。ショットガン法は、大規模なゲノムの配列決定によく使用されますが、そのアセンブリは複雑で困難であり、特に配列の繰り返しによってゲノム アセンブリにギャップが生じることがよくあります。
ほとんどのシーケンシング手法では、分子検出方法が単一分子シーケンシングに十分な感度を持たないため、個々の DNA 分子を増幅するためにin vitroクローニング手順が使用されています。エマルジョン PCR [69]は、プライマーでコーティングされたビーズとともに、油相内の水性液滴内の個々の DNA 分子を分離します。次に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) によって各ビーズが DNA 分子のクローンコピーでコーティングされ、その後のシーケンシングのために固定化されます。エマルジョン PCR は、Marguilis ら ( 454 Life Sciencesにより商品化)、Shendure および Porreca ら (「ポロニーシーケンシング」としても知られる) によって開発された方法、およびSOLiD シーケンシング( Agencourt、後にApplied Biosystems、現在のLife Technologiesにより開発) で使用されています。[70] [71] [72]エマルジョン PCR は、 10x Genomicsによって開発された GemCode および Chromium プラットフォームでも使用されています。[73]
ショットガンシーケンス
ショットガンシークエンシングは、1000塩基対以上、染色体全体を含むDNA配列の解析用に設計されたシークエンシング法である。この方法では、標的DNAをランダムな断片に分割する必要がある。チェーンターミネーション法を使用して個々の断片をシークエンシングした後、重複領域に基づいて配列を再構成することができる。[74]
ハイスループット法
次世代の「ショートリード」と第三世代の「ロングリード」シーケンシング法を含むハイスループットシーケンシング[nt 1]は、エクソームシーケンシング、ゲノムシーケンシング、ゲノムリシーケンシング、トランスクリプトームプロファイリング（RNA-Seq）、DNA-タンパク質相互作用（ChIP-シーケンシング）、およびエピゲノム特性評価に適用されます。[75]
低コストのシーケンシングに対する高い需要により、シーケンシングプロセスを並列化し、数千または数百万のシーケンスを同時に生成するハイスループットシーケンシング技術の開発が促進されました。 [76] [ 77] [78]ハイスループットシーケンシング技術は、標準的なダイターミネーター法で可能な範囲を超えてDNAシーケンシングのコストを下げることを目的としています。[79]超ハイスループットシーケンシングでは、最大500,000のシーケンシングバイシンセシス操作を並列に実行できます。[80] [81] [82]このような技術により、わずか1日でヒトゲノム全体をシーケンスできるようになりました。 [83] 2019年現在、ハイスループットシーケンシング製品の開発における企業リーダーには、イルミナ、キアゲン、サーモフィッシャーサイエンティフィックが含まれています。 [ 83 ][アップデート]
ロングリードシーケンス法
単一分子リアルタイム（SMRT）シーケンシング
SMRT シーケンシングは、合成によるシーケンシング手法に基づいています。DNA は、ゼロモード導波管 (ZMW) で合成されます。ZMW は、ウェルの底に捕捉ツールがある小さなウェルのような容器です。シーケンシングは、未修飾ポリメラーゼ (ZMW の底に取り付けられている) と、溶液中を自由に流れる蛍光標識ヌクレオチドを使用して実行されます。ウェルは、ウェルの底で発生する蛍光のみが検出されるように構築されています。蛍光標識は、ヌクレオチドが DNA 鎖に組み込まれるとヌクレオチドから切り離され、未修飾の DNA 鎖が残ります。SMRT技術開発者のPacific Biosciences (PacBio) によると、この方法論により、ヌクレオチド修飾 (シトシンのメチル化など) を検出できます。これは、ポリメラーゼの速度論を観察することで行われます。この手法では、平均読み取り長が 5 キロベースで、20,000 ヌクレオチド以上の読み取りが可能です。 [ 90] [100] 2015年にパシフィックバイオサイエンスは、PacBio RS II装置の15万ZMWと比較して100万ZMWを備えたSequel Systemと呼ばれる新しいシーケンシング装置の発売を発表しました。[101] [102] SMRTシーケンシングは、「第3世代」または「ロングリード」シーケンシング と呼ばれています。
ナノポアDNAシーケンシング
ナノポアを通過する DNA は、イオン電流を変化させます。この変化は、DNA 配列の形状、サイズ、長さに依存します。ヌクレオチドの種類ごとに、イオンの流れをポアから遮断する時間が異なります。この方法では、修飾ヌクレオチドは必要なく、リアルタイムで実行されます。ナノポア シーケンシングは、SMRT シーケンシングとともに、「第 3 世代」または「ロング リード」シーケンシングと呼ばれます。
この方法に関する初期の産業研究は「エキソヌクレアーゼシーケンシング」と呼ばれる技術に基づいており、ヌクレオチドがシクロデキストリンと共有結合したアルファ（α）溶血素の細孔を通過する際に電気信号の読み取りが行われた。[103]しかし、その後の商業的な方法である「ストランドシーケンシング」では、DNA塩基を無傷のストランドで配列決定した。
開発中のナノポアシーケンシングの2つの主な分野は、固体ナノポアシーケンシングとタンパク質ベースのナノポアシーケンシングです。タンパク質ナノポアシーケンシングは、α-ヘモリシン、MspA（Mycobacterium smegmatis Porin A）、CssGなどの膜タンパク質複合体を利用します。これらは、個々のヌクレオチドとグループのヌクレオチドを区別する能力を考えると、大きな可能性を示しています。[104]対照的に、固体ナノポアシーケンシングは、窒化シリコンや酸化アルミニウムなどの合成材料を利用し、その優れた機械的能力と熱的および化学的安定性のために好まれています。[105]ナノポアアレイには、直径が8ナノメートル未満の数百の細孔が含まれる可能性があるため、このタイプのシーケンシングでは製造方法が不可欠です。 [104]
この概念は、一本鎖の DNA または RNA 分子が、8 ナノメートル未満の生物学的孔を電気泳動によって厳密に直線的に通過し、分子が孔を通過する際にイオン電流を放出することで検出できるという考えから生まれました。孔にはさまざまな塩基を認識できる検出領域があり、各塩基は孔を通過する際に塩基の配列に対応するさまざまな時間固有の信号を生成し、それが評価されます。[105]孔を通る DNA 輸送を正確に制御することが成功の鍵となります。エキソヌクレアーゼやポリメラーゼなどのさまざまな酵素を孔の入り口近くに配置することで、このプロセスを緩和するために使用されてきました。[106]
ショートリードシーケンス法
超並列シグネチャシーケンス (MPSS)
最初のハイスループットシーケンス技術である超並列シグネチャシーケンス（MPSS、次世代シーケンスとも呼ばれる）は、1992年にシドニー・ブレナーとサム・エレクターによって設立された会社であるLynx Therapeuticsで1990年代に開発されました。MPSSはビーズベースの方法で、アダプターライゲーションとそれに続くアダプターデコードという複雑なアプローチを使用して、4ヌクレオチドずつ増分してシーケンスを読み取りました。この方法では、シーケンス固有のバイアスや特定のシーケンスの損失の影響を受けやすかったです。この技術は非常に複雑だったため、MPSSはLynx Therapeuticsによって「社内」でのみ実行され、独立した研究室にDNAシーケンスマシンは販売されませんでした。Lynx Therapeuticsは2004年にSolexa（後にIlluminaに買収）と合併し、 Manteia Predictive Medicineから買収したより単純なアプローチである合成によるシーケンスの開発につながり、MPSSは時代遅れになりました。しかし、MPSS出力の本質的な特性は、数十万の短いDNA配列を含む、後の高スループットデータタイプに典型的なものでした。MPSSの場合、これらは通常、遺伝子発現レベルの測定のためのcDNAの配列決定に使用されました。[60]
ポロニー配列
ハーバード大学のジョージ・M・チャーチの研究室で開発されたポロニー配列決定法は、最初のハイスループット配列決定システムの一つであり、2005年に大腸菌ゲノム全体の配列決定に使用されました。 [107]これは、インビトロのペアタグライブラリとエマルジョンPCR、自動化顕微鏡、ライゲーションベースの配列決定化学を組み合わせ、大腸菌ゲノムを99.9999%を超える精度で、サンガー配列決定の約1/9のコストで配列決定しました。[107]この技術はAgencourt Biosciencesにライセンス供与され、その後Agencourt Personal Genomicsにスピンアウトし、最終的にApplied Biosystems SOLiDプラットフォームに組み込まれました。Applied Biosystemsは後にLife Technologiesに買収され、現在はThermo Fisher Scientificの一部となっています。
454 パイロシーケンシング
並列化されたパイロシーケンシング法は、 454 Life Sciences 社によって開発され、同社はその後Roche Diagnostics 社に買収された。この方法では、油溶液中の水滴内の DNA を増幅する (エマルジョン PCR)。各水滴には単一の DNA テンプレートが含まれており、プライマーでコーティングされた単一のビーズに付着してクローンコロニーを形成する。シーケンシングマシンには、ピコリットル容量のウェルが多数あり、各ウェルには単一のビーズとシーケンシング酵素が含まれている。パイロシーケンシングでは、ルシフェラーゼを使用して、新生 DNA に追加された個々のヌクレオチドを検出するための光を発生させ、結合されたデータを使用してシーケンスリードを生成する。[70]この技術は、一方ではサンガーシーケンシング、他方では Solexa および SOLiD と比較して、中間のリード長と塩基あたりの価格を提供する。[79]
イルミナ（ソレクサ）シーケンシング
ソレクサは現在イルミナの一部であり、 1998年にシャンカール・バラスブラマニアンとデビッド・クレナーマンによって設立され、可逆的ダイターミネーター技術とエンジニアリングポリメラーゼに基づくシーケンシング法を開発した。 [108]可逆的ターミネート化学の概念は、パリのパスツール研究所のブルーノ・カナールとサイモン・サルファティによって発明された。[109] [110]これは、関連特許に名前が挙がっているソレクサ社内で開発された。2004年、ソレクサはマンテイア・プレディクティブ・メディシン社を買収し、1997年にパスカル・マイヤーとローラン・ファリネッリによって発明された超並列シーケンシング技術を獲得した。[57]これは「DNAクラスター」または「DNAコロニー」に基づいており、表面上のDNAのクローン増幅を伴う。クラスター技術は、カリフォルニアのリンクス・セラピューティクスと共同で買収された。 Solexa Ltd. は後に Lynx と合併し、Solexa Inc. を設立しました。
この方法では、まず DNA 分子とプライマーをスライドまたはフローセルに取り付け、ポリメラーゼで増幅して、後に「DNA クラスター」と呼ばれるようになった局所クローン DNA コロニーを形成します。配列を決定するために、4 種類の可逆ターミネーター塩基 (RT 塩基) を追加し、組み込まれていないヌクレオチドを洗い流します。カメラで蛍光標識されたヌクレオチドの画像を撮影します。次に、染料と末端 3' ブロッカーを化学的に DNA から除去して、次のサイクルを開始できるようにします。ピロシーケンシングとは異なり、DNA 鎖は 1 ヌクレオチドずつ伸長し、画像の取得は遅延して実行できるため、1 台のカメラで連続的に撮影した画像で非常に大規模な DNA コロニー配列をキャプチャできます。
酵素反応と画像キャプチャを切り離すことで、最適なスループットと理論上は無制限のシーケンシング能力が実現します。最適な構成では、最終的に達成可能な機器のスループットは、カメラのアナログからデジタルへの変換速度にカメラの数を掛け、DNAコロニーを最適に視覚化するために必要なピクセル数（コロニーあたり約10ピクセル）で割った値によってのみ決まります。2012年には、10 MHzを超えるA/D変換速度で動作するカメラと利用可能な光学系、流体工学、酵素学により、スループットは100万ヌクレオチド/秒の倍数になり、これは1台の機器あたり1時間あたり1倍のカバレッジでヒトゲノム1個分に相当する量、および1台の機器（カメラ1台を装備）あたり1日あたり（約30倍で）ヒトゲノム1個分の再シーケンシングに相当する量です。[111]
コンビナトリアルプローブアンカー合成（cPAS）
この方法は、 Complete Genomics [112]が開発したコンビナトリアルプローブアンカーライゲーション技術 (cPAL) を改良したものであり、同社は2013 年に中国のゲノミクス企業BGIの傘下となった。[113]両社は、この技術を改良して、読み取り長の延長、反応時間の短縮、結果までの時間の短縮を可能にした。さらに、データは現在、標準の FASTQ ファイル形式で連続した全長の読み取りとして生成されており、ほとんどのショートリードベースのバイオインフォマティクス解析パイプラインでそのまま使用できる。[114] [引用が必要]
このハイスループットシーケンシング技術の基礎となる 2 つの技術は、DNA ナノボール(DNB) と、固体表面にナノボールを付着させるためのパターン化アレイです。[112] DNA ナノボールは、アダプターが連結された二本鎖のライブラリを変性させ、フォワード鎖のみをスプリントオリゴヌクレオチドに連結して ssDNA サークルを形成するだけで簡単に形成されます。DNA インサートを含むサークルの忠実なコピーは、約 300～500 個のコピーを生成するローリングサークル増幅を利用して生成されます。ssDNA の長い鎖は折り畳まれ、直径約 220 nm の 3 次元ナノボール構造を生成します。DNB を作成すると、フローセル上でライブラリの PCR コピーを生成する必要がなくなり、重複読み取り、アダプター間連結、PCR 誘発エラーの大部分を除去できます。[114] [引用が必要]
正電荷を帯びたスポットのパターン配列は、フォトリソグラフィーとエッチング技術によって製造され、その後化学修飾されてシーケンシングフローセルを生成します。フローセル上の各スポットは直径約250nmで、700nm（中心から中心）離れており、単一の負電荷を帯びたDNBをフローセルに簡単に取り付けることができるため、フローセル上の過少または過剰のクラスター化を減らすことができます。[112] [引用が必要]
次に、DNB 内の特定の部位に結合して付着するオリゴヌクレオチド プローブを追加することで、シーケンシングが実行されます。プローブはアンカーとして機能し、フローセルを流れた後、可逆的に不活性化された 4 つの単一のラベル付きヌクレオチドのうちの 1 つが結合できるようにします。結合していないヌクレオチドは洗い流され、付着したラベルがレーザー励起されて蛍光を発し、信号がカメラでキャプチャされ、ベース コーリング用のデジタル出力に変換されます。サイクルが完了すると、付着した塩基のターミネーターとラベルが化学的に切断されます。サイクルは、フローセルを横切る別の自由ラベル付きヌクレオチドの流れで繰り返され、次のヌクレオチドが結合して信号がキャプチャされます。このプロセスは、挿入された DNA 片の配列を決定するために、2018 年現在、約 4,000 万ヌクレオチド/秒の速度で何度も (通常 50 ～ 300 回) 実行されます。[要出典]
SOLiD シーケンス
Applied Biosystems (現在はLife Technologiesブランド) の SOLiD 技術は、ライゲーションによるシーケンシングを採用しています。ここでは、固定長のすべての可能なオリゴヌクレオチドのプールが、シーケンシングされた位置に従ってラベル付けされます。オリゴヌクレオチドはアニールされ、ライゲーションされます。一致する配列に対するDNA リガーゼによる優先的なライゲーションにより、その位置のヌクレオチドに関する情報を示す信号が生成されます。テンプレート内の各塩基は 2 回シーケンシングされ、結果のデータは、この方法で使用される2 塩基エンコード方式に従ってデコードされます。シーケンシングの前に、DNA はエマルジョン PCR によって増幅されます。結果として得られたビーズは、それぞれ同じ DNA 分子の単一コピーを含み、ガラススライド上に堆積されます。[115]結果は、イルミナのシーケンシングに匹敵する量と長さの配列です。[79]このライゲーションによるシーケンシング法は、回文配列のシーケンシングに問題があることが報告されています。[98]
イオントレント半導体シーケンシング
Ion Torrent Systems Inc. (現在はLife Technologiesが所有) は、標準的なシーケンシング化学をベースにしながらも、半導体ベースの新しい検出システムを採用したシステムを開発した。このシーケンシング方法は、他のシーケンシングシステムで使用されている光学的方法とは対照的に、 DNAの重合中に放出される水素イオンの検出に基づいている。シーケンシングするテンプレートDNA鎖を含むマイクロウェルに、1種類のヌクレオチドを注入する。導入されたヌクレオチドが先頭のテンプレートヌクレオチドと相補的である場合、成長中の相補鎖に組み込まれる。これにより水素イオンが放出され、超高感度イオンセンサーが作動して反応が起こったことを示す。テンプレート配列にホモポリマー繰り返しが存在する場合、1回のサイクルで複数のヌクレオチドが組み込まれる。これにより、放出される水素の数と比例して電子信号が高くなる。[116]
DNAナノボール配列
DNA ナノボール シーケンシングは、生物の全ゲノム配列を決定するために使用されるハイ スループット シーケンシング技術の一種です。Complete Genomics社は、この技術を使用して、独立した研究者から提出されたサンプルをシーケンシングしています。この方法では、ローリング サークル レプリケーションを使用して、ゲノム DNA の小さな断片を DNA ナノボールに増幅します。次に、連結による非連鎖シーケンシングを使用して、ヌクレオチド配列を決定します。[117]この DNA シーケンシング方法により、1 回の実行で多数の DNA ナノボールをシーケンシングでき、他のハイ スループット シーケンシング プラットフォームと比較して試薬コストが低くなります。 [118]ただし、各 DNA ナノボールからは短い DNA 配列のみが決定されるため、短い読み取りを参照ゲノムにマッピングすることは困難です。[117]
ヘリスコープ単一分子シーケンシング
ヘリスコープシーケンシングは、ヘリコスバイオサイエンス社が開発した単一分子シーケンシング法である。フローセル表面に付着したポリAテールアダプターが追加されたDNA断片を使用する。次のステップは、蛍光標識ヌクレオチド（サンガー法と同様に、一度に1種類のヌクレオチド）でフローセルを周期的に洗浄する伸長ベースのシーケンシングである。読み取りはヘリスコープシーケンサーによって実行される。[119] [120]読み取りは短く、平均35bpである。[121]この技術が特に斬新だったのは、増幅されていないDNAをシーケンシングした同クラス初の技術であり、増幅ステップに関連する読み取りエラーを防止した点である。[122] 2009年にヘリスコープを使用してヒトゲノムのシーケンシングが行われたが、2012年に同社は倒産した。[123]
マイクロ流体システム
DNA の配列を決定するために使用されるマイクロ流体システムには、液滴ベースのマイクロ流体とデジタル マイクロ流体の2 つがあります。マイクロ流体デバイスは、現在の配列決定アレイの多くの制限を解決します。
Abateらは、DNA配列決定のための液滴ベースのマイクロ流体デバイスの使用を研究した。[4]これらのデバイスは、1秒間に数千の速度でピコリットルサイズの液滴を形成および処理する能力がある。このデバイスはポリジメチルシロキサン（PDMS）から作られ、液滴に含まれるDNAの配列を読み取るために、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）アッセイを使用した。アレイ上の各位置は、特定の15塩基配列をテストした。[4]
フェアらは、デジタルマイクロ流体デバイスを使用してDNAピロシークエンシングを研究した。[124]デバイスの携帯性、試薬量、分析速度、大量生産能力、高スループットなどの利点がある。この研究は、デジタルデバイスがピロシークエンシングに使用できることを示す概念実証を提供した。この研究では、酵素の伸長と標識ヌクレオチドの添加を含む合成も使用されていた。[124]
Bolesらは、デジタルマイクロ流体デバイスでのパイロシークエンシングも研究した。[125]彼らは電気湿潤装置を使用して液滴を作成、混合、分割した。シークエンシングには、3つの酵素プロトコルと磁気ビーズで固定されたDNAテンプレートを使用する。このデバイスは2つのプロトコルを使用してテストされ、生のパイログラムレベルに基づいて100％の精度が得られました。これらのデジタルマイクロ流体デバイスの利点には、サイズ、コスト、および達成可能な機能統合レベルが含まれます。[125]
マイクロ流体工学を用いたDNA配列決定研究は、inDrops法などの同様の液滴マイクロ流体技術を使用してRNAの配列決定にも応用できる可能性があります。 [126]これは、これらのDNA配列決定技術の多くがさらに応用され、ゲノムとトランスクリプトームについてより深く理解するために使用できることを示しています。
開発中の手法
現在開発中の DNA シーケンシング法には、DNA 鎖がナノポアを通過するときに配列を読み取る方法（この方法は現在商業化されていますが、固体ナノポアなどの次世代はまだ開発中です）[127] [128]や、原子間力顕微鏡や透過型電子顕微鏡などの顕微鏡ベースの技術があり、長い DNA 断片（>5,000 bp）内の個々のヌクレオチドの位置を、より重い元素（ハロゲンなど）でヌクレオチドを標識して視覚的に検出および記録することで特定します。[129] [130] 第 3 世代の技術は、過剰な試薬の必要性を排除し、DNA ポリメラーゼの処理能力を利用することで、スループットを向上させ、結果までの時間とコストを削減することを目指しています。[131]
トンネル電流 DNA配列
もう一つのアプローチは、一本鎖DNAがチャネルを通過する際の電気トンネル電流の測定を利用するものである。電子構造に応じて、各塩基はトンネル電流に異なる影響を与えるため[132]、異なる塩基を区別することができる。[133]
トンネル電流を利用するとイオン電流法よりも桁違いに速く配列決定できる可能性があり、いくつかのDNAオリゴマーとマイクロRNAの配列決定はすでに達成されている。[134]
ハイブリダイゼーションによる配列決定
ハイブリダイゼーションによるシークエンシングは、 DNAマイクロアレイを使用する非酵素的手法である。配列を決定するDNAの単一プールを蛍光標識し、既知の配列を含むアレイにハイブリダイズする。アレイ上の特定のスポットからの強力なハイブリダイゼーション信号により、シークエンシング対象のDNAの配列が特定される。 [135]
このシーケンシング法は、DNAプローブとも呼ばれる短い一本鎖DNA分子（オリゴヌクレオチド）のライブラリの結合特性を利用して、標的DNA配列を再構築する。非特異的ハイブリッドは洗浄によって除去され、標的DNAが溶出される。[136]ハイブリッドはDNA配列を再構築できるように再配置される。このシーケンシング法の利点は、均一なカバレッジで多数の標的を捕捉できることである。[137]通常、多数の化学物質と開始DNAが必要である。しかし、溶液ベースのハイブリダイゼーションの出現により、必要な装置と化学物質は大幅に減少した。[136]
質量分析によるシーケンシング
質量分析法は、DNA配列を決定するために使用されることがある。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）は、 DNA断片を可視化するためのゲル電気泳動の代替方法として特に研究されてきた。この方法では、連鎖終結配列決定反応によって生成されたDNA断片を、サイズではなく質量で比較する。各ヌクレオチドの質量は他のものと異なり、この違いは質量分析法で検出できる。断片内の単一ヌクレオチド変異は、ゲル電気泳動のみよりもMSで簡単に検出できる。MALDI-TOF MSはRNA断片間の違いをより簡単に検出できるため、研究者はまずDNAをRNAに変換することで、MSベースの方法で間接的にDNAを配列決定することができる。[138]
MS ベースの方法によって可能になる DNA 断片の高解像度は、法医学研究者にとって特に興味深いものです。なぜなら、彼らは個人を特定するためにヒト DNA サンプルの一塩基多型を見つけたいと考えているからです。これらのサンプルは高度に劣化している可能性があるため、法医学研究者は安定性が高く、血統研究に応用できるミトコンドリア DNAを好むことが多いのです。MS ベースのシーケンシング方法は、連邦捜査局データベース[139]のサンプルと第一次世界大戦の兵士の集団墓地で発見された骨のヒトミトコンドリア DNA の配列を比較するために使用されています。[140]
初期の連鎖終結法とTOF MS法では、最大100塩基対の読み取り長が実証されました。[141]研究者はこの平均読み取りサイズを超えることができていません。連鎖終結法シーケンシングのみの場合と同様に、MSベースのDNAシーケンシングは大規模なde novoシーケンシングプロジェクトには適さない可能性があります。それでも、最近の研究では、短いシーケンスリードと質量分析法を使用して、病原性連鎖球菌株の単一ヌクレオチド多型を比較しました。 [142]
マイクロ流体サンガーシーケンシング
マイクロ流体サンガーシーケンシングでは、DNA断片の熱サイクル増幅と電気泳動による分離がすべて単一のガラスウエハー（直径約10cm）上で行われるため、試薬の使用量とコストが削減されます。[143]研究者は、マイクロチップを使用することで従来のシーケンシングのスループットを向上できることを示した例もあります。[144]この技術を効果的に使用するには、まだ研究が必要です。
顕微鏡ベースの技術
このアプローチは、電子顕微鏡を使用してDNA分子の配列を直接視覚化する。原子番号が増加した原子を含む修飾塩基を酵素的に組み込むことによって、完全なDNA分子内のDNA塩基対を初めて識別し、合成された3,272塩基対DNA分子と7,249塩基対のウイルスゲノム内の個別に標識された塩基を直接視覚化し識別することが実証された。[145]
RNAPシーケンシング
この方法は、ポリスチレンビーズに付着したRNAポリメラーゼ（RNAP）の使用に基づいています。配列決定するDNAの一方の端は別のビーズに付着し、両方のビーズは光トラップ内に置かれます。転写中のRNAPの動きによりビーズが近づき、それらの相対距離が変化するため、1ヌクレオチドの解像度で記録できます。サンガー法と同様に、4つのヌクレオチドタイプのそれぞれの濃度を下げた4つの読み取り値に基づいて配列が推定されます。[146]領域間で比較が行われ、既知の配列領域と未知の配列領域を比較することで配列情報が推定されます。[147]
試験管内ウイルスハイスループットシーケンシング
454ピロシークエンシングとin vitroウイルスmRNAディスプレイ法を組み合わせて、タンパク質相互作用の完全なセットを分析する方法が開発されました。具体的には、この方法では、対象のタンパク質をそれらをコードするmRNAに共有結合させ、逆転写PCRを使用してmRNA断片を検出します。その後、mRNAを増幅して配列決定することができます。この組み合わせた方法はIVV-HiTSeqと名付けられ、無細胞条件下で実行できますが、その結果はin vivo条件を代表しない可能性があります。 [148]
市場占有率
DNAの配列を決定する方法は多種多様ですが、市場を独占しているのはごくわずかです。2022年には、イルミナが市場の約80%を占め、残りの市場は数社の企業（PacBio、オックスフォード、454、MGI）によって占められています。[149]
サンプルの準備
あらゆる DNA 配列決定プロトコルの成功は、対象となる生物学的材料からの DNA または RNA サンプルの抽出と準備に依存します。
- DNA 抽出が成功すると、分解されていない長い鎖を持つ DNA サンプルが生成されます。
- RNA抽出が成功すると、逆転写酵素（PCRのような方法で既存のRNA鎖に基づいて相補DNAを合成するDNAポリメラーゼ）を使用して相補DNA（cDNA）に変換する必要があるRNAサンプルが得られます。[150]相補DNAはその後、ゲノムDNAと同じ方法で処理できます。
DNAまたはRNAの抽出後、サンプルはシーケンシング方法に応じてさらに準備が必要になる場合があります。サンガーシーケンシングの場合、シーケンシングの前にクローニング手順またはPCRのいずれかが必要です。次世代シーケンシング方法の場合、処理前にライブラリの準備が必要です。[151]抽出後とライブラリの準備後の両方で核酸の品質と量を評価することで、劣化したサンプル、断片化したサンプル、純度の低いサンプルを識別し、高品質のシーケンシングデータが得られます。[152]
開発イニシアチブ
2006年10月、Xプライズ財団は、完全なゲノム配列決定技術の開発を促進するためのイニシアチブであるArchon X Prizeを設立し、「10日以内に100人のヒトゲノムを配列決定できる装置を構築し、配列決定された10万塩基あたり1つのエラー以下の精度で、配列がゲノムの少なくとも98％を正確にカバーし、ゲノムあたり1万ドル以下の経常コストで使用できる最初のチーム」に1000万ドルを授与することを意図していました。[153]
国立ヒトゲノム研究所（NHGRI）は毎年、ゲノミクスの新たな研究と開発のための助成金を推進しています。2010年の助成金と2011年の候補には、マイクロ流体、ポロニー、塩基重配列解析手法の継続的な研究が含まれています。[154]
計算上の課題
ここで説明したシーケンシング技術は、完全なゲノムなどのより長い配列に組み立てる必要のある生データを生成します（配列アセンブリ）。これを実現するには、 PhredやPhrapなどのプログラムやアルゴリズムによって行われる生の配列データの評価など、多くの計算上の課題があります。他の課題としては、ゲノムの多くの場所で発生するため、完全なゲノムアセンブリを妨げることが多い反復配列に対処する必要があります。その結果、多くの配列が特定の染色体に割り当てられない可能性があります。生の配列データの生成は、詳細なバイオインフォマティクス分析の始まりにすぎません。[155]しかし、配列を決定し、配列エラーを修正するための新しい方法が開発されました。[156]
トリミングを読む
シーケンサーによって生成された生の読み取りは、その長さの一部のみが正しく、正確である場合があります。読み取り全体を使用すると、ゲノムアセンブリ、SNP呼び出し、遺伝子発現の推定などの下流の分析でアーティファクトが発生する可能性があります。ウィンドウベースまたはランニングサムクラスのアルゴリズムに基づいて、2つのクラスのトリミングプログラムが導入されています。[157]これは、現在利用可能なトリミングアルゴリズムの一部であり、それらが属するアルゴリズムクラスを指定しています。
倫理的問題
ヒト遺伝学は1970年代初頭から生命倫理の分野に含まれており[164]、DNAシーケンシング（特にハイスループットシーケンシング）の利用の増加は、多くの倫理的問題を引き起こしている。重要な問題の1つは、個人のDNAの所有権と、そのDNAをシーケンシングしたときに生成されるデータである。[165] DNA分子自体に関しては、このトピックに関する主要な訴訟であるムーア対カリフォルニア大学理事会（1990年）は、廃棄された細胞やこれらの細胞を使用して得た利益（たとえば、特許取得済みの細胞株として）に対する所有権は個人にはないという判決を下した。しかし、個人には細胞の除去と使用に関するインフォームドコンセントの権利がある。DNAシーケンシングによって生成されたデータに関しては、ムーアは個人にDNAから得られる情報に対する権利を与えていない。[165]
DNA配列解析が普及するにつれて、ゲノムデータの保管、セキュリティ、共有もより重要になってきている。[165] [166]例えば、保険会社が個人のゲノムデータを使用し、DNAに基づいて個人の将来の健康状態を予測して見積もりを変更する可能性があることが懸念されている。[166] [167] 2008年5月、米国で遺伝情報差別禁止法（GINA）が署名され、健康保険や雇用に関して遺伝情報に基づく差別を禁止した。 [168] [169] 2012年、米国大統領生命倫理問題研究委員会は、 GINAや医療保険の携行性と説明責任に関する法律など、DNA配列解析データに関する既存のプライバシー法は不十分であり、全ゲノム配列データは特に機密性が高く、データが作成された個人だけでなくその親族も特定できる可能性があると報告した。[170] [171]
米国のほとんどの地域では、舐められた切手や封筒、コーヒーカップ、タバコ、チューインガム、家庭ごみ、公共の歩道に落ちた髪の毛などから見つかった「捨てられた」DNAは、警察、私立探偵、政敵、親子関係をめぐる争いの当事者など、誰でも合法的に収集し、配列を調べることができる。2013年現在、11の州で「DNA盗難」を禁止していると解釈できる法律がある。[172]
23andMeなどの企業による新生児と成人の両方での遺伝子変異スクリーニングの使用が増えていることからも、倫理的な問題が浮上している。[173] [174]遺伝子変異のスクリーニングは有害であり、病気のリスクが高いことが判明した個人の不安を増大させる可能性があると主張されている。 [175]たとえば、Timeに掲載されたあるケースでは、病気の赤ちゃんの遺伝子変異をスクリーニングした医師は、両親に害を及ぼす可能性があるため、認知症に関連する無関係の変異を両親に知らせないことを選択した。 [176]しかし、2011年にThe New England Journal of Medicineで発表された研究では、病気のリスクプロファイリングを受けた個人に不安レベルの上昇は見られなかったことが示された。[175]また、ナノポアベースのシーケンシングなどの次世代シーケンシング技術の開発も、さらなる倫理的な懸念を引き起こしている。[177]
参照
- バイオインフォマティクス – 大規模で複雑な生物学的データセットの計算分析
- がんゲノム配列解析
- 循環コンセンサス配列
- DNAコンピューティング – 分子生物学ハードウェアを使用したコンピューティング
- DNA電界効果トランジスタ - DNAの部分電荷による電界効果を利用するトランジスタ
- DNA配列理論 – 生物学理論
- DNAシーケンサー – DNA配列決定プロセスを自動化するために使用される科学機器
- ジェノグラフィックプロジェクト – 市民科学プロジェクト
- ゲノムプロジェクト – 生物の完全なゲノム配列を決定するための科学的取り組み
- 絶滅危惧種のゲノム配列解析 - 絶滅危惧度評価のための DNA 検査
- ゲノムスキミング – ゲノム配列決定法
- IsoBase – PPI ネットワーク全体で機能的に関連するタンパク質
- リンクリードシーケンス
- ジャンピングライブラリ
- 核酸配列 – 核酸中のヌクレオチドの連続
- 多重ライゲーション依存性プローブ増幅
- 個別化医療 – 個々の患者に合わせて医療行為をカスタマイズする医療モデル
- タンパク質配列決定 – タンパク質中のアミノ酸配列の決定
- シーケンスマイニング
- 配列プロファイリングツール
- ハイブリダイゼーションによる配列決定 - DNA鎖中の一定サイズの構成ヌクレオチドを決定する方法
- ライゲーションによるシーケンシング - DNAリガーゼという酵素を使用してDNA配列の特定の位置に存在するヌクレオチドを識別するDNA配列決定法
- TIARA（データベース） – 個人ゲノム情報のデータベース
- 透過型電子顕微鏡によるDNAシーケンシング – 単一分子シーケンシング技術
注記
参考文献
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外部リンク
Wikibooks には、次世代シーケンシング (NGS)に関する本があります。
- 次世代シーケンスに関するウィキブック
