ChIPシーケンス

ChIPシーケンス（ ChIP-seqとも呼ばれる）は、タンパク質とDNAの相互作用を解析する手法です。ChIP-seqは、クロマチン免疫沈降法（ChIP）と超並列DNAシーケンスを組み合わせることで、DNA結合タンパク質の結合部位を特定します。これにより、あらゆる対象タンパク質のグローバルな結合部位を正確にマッピングすることが可能です。従来、これらのタンパク質とDNAの関係を研究するために最も一般的に用いられていたのは、 ChIP-on-chipでした。

ChIP-seqは主に、転写因子やその他のクロマチン関連タンパク質が表現型に影響を与えるメカニズムにどのように影響するかを決定するために使用されます。タンパク質がDNAとどのように相互作用して遺伝子発現を制御するかを決定することは、多くの生物学的プロセスや疾患状態を完全に理解するために不可欠です。このエピジェネティック情報は、遺伝子型および発現解析を補完します。ChIP-seq技術は現在、ハイブリダイゼーションアレイを必要とするChIP-chipの代替として主に考えられています。アレイは固定数のプローブに制限されるため、これはある程度のバイアスをもたらします。対照的に、シーケンスはバイアスが少ないと考えられていますが、異なるシーケンス技術のシーケンスバイアスはまだ完全には理解されていません。^{[ 1 ]}

転写因子や他のタンパク質と直接物理的に相互作用する特定のDNA部位は、クロマチン免疫沈降法によって単離できます。ChIPは、目的のタンパク質に結合した標的DNA部位のライブラリを作成します。大規模並列配列解析は、全ゲノム配列データベースと組み合わせて、任意のタンパク質とDNAの相互作用パターン^{[ 2 ]}、または任意のエピジェネティックなクロマチン修飾のパターンを解析するために使用されます。これは、転写因子、ポリメラーゼおよび転写機構、構造タンパク質、タンパク質修飾、DNA修飾など、ChIP可能なタンパク質および修飾のセットに適用できます。^{[ 3 ]}特定の抗体への依存の代替として、DNase-Seq [ ⁴ ]やFAIRE -Seq ^{[ 5 ] [ 6 ]}のように、ゲノム内のすべてのヌクレオソーム欠乏またはヌクレオソーム破壊活性制御領域のスーパーセットを見つけるため^{のさまざまな方法が}開発されています。

ChIP-seqは迅速な解析を可能にするが、得られた結果の信頼性を確保するためには品質管理を実施する必要がある。

• 非冗長部分：低複雑性領域は情報がなく、参照ゲノムのマッピングを妨げる可能性があるため、除去する必要があります。^{[ 11 ]}
• ピーク内のフラグメント：ピーク内に位置するリードとピークのない場所に位置するリードの比率。^{[ 11 ]}

この技術の感度は、シーケンスランの深度（つまり、マッピングされたシーケンスタグの数）、ゲノムのサイズ、およびターゲット因子の分布に依存します。シーケンス深度はコストと直接相関しています。大きなゲノムに豊富に存在する結合因子を高感度でマッピングする必要がある場合、膨大な数のシーケンスタグが必要になるため、コストが高くなります。これは、コストが感度と相関しないChIP-chipとは対照的です。^{[ 12 ] [ 13 ]}

マイクロアレイベースのChIP法とは異なり、ChIP-seqアッセイの精度は、あらかじめ決められたプローブの間隔によって制限されません。多数の短いリードを統合することで、非常に正確な結合部位の局在が得られます。ChIP-chipと比較して、ChIP-seqデータを使用すると、実際のタンパク質結合部位から数十塩基対以内の結合部位を特定できます。結合部位のタグ密度は、タンパク質とDNAの結合親和性の良い指標であり、^{[ 14 ]}これにより、タンパク質と異なるDNA部位の結合親和性を定量化して比較することが容易になります。^{[ 15 ]}

STAT1 DNAとの関連： ChIP-seqは、細胞集団の解析に使用されるHeLa株のクローンであるHeLa S3細胞におけるSTAT1標的の研究に使用された。 ^{[ 16 ]}次に、ChIP-seqの性能は、代替のタンパク質-DNA相互作用法であるChIP-PCRおよびChIP-chipと比較された。^{[ 17 ]}

プロモーターのヌクレオソーム構造： ChIP-seqを用いて、酵母遺伝子にはRNAポリメラーゼが転写を開始できる150bpの最小限のヌクレオソームフリープロモーター領域があることが判明した。 ^{[ 18 ]}

転写因子の保存性： ChIP-seqを用いて、胚マウスの前脳と心臓組織における転写因子の保存性を比較した。著者らは転写エンハンサーの心臓における機能性を同定および検証し、同じ発生段階において、心臓の転写エンハンサーは前脳の転写エンハンサーよりも保存性が低いことを明らかにした。^{[ 19 ]}

ゲノムワイドChIP-seq:線虫C. elegansでChIPシーケンスを実施し、22種類の転写因子のゲノムワイドな結合部位を調べた。注釈付き候補遺伝子の最大20%が転写因子に割り当てられた。いくつかの転写因子は非コードRNA領域に割り当てられ、発生や環境要因の影響を受ける可能性がある。いくつかの転写因子の機能も特定された。転写因子の中には、他の転写因子を制御する遺伝子を調節するものもある。これらの遺伝子は他の因子によって調節されない。ほとんどの転写因子は、他の因子の標的と調節因子の両方として機能し、調節ネットワークを示している。^{[ 20 ]}

制御ネットワークの推論:ヒストン修飾のChIP-seqシグナルは、RNAレベルと比較して、プロモーターの転写因子モチーフとより相関していることが示されています。^{[ 21 ]}したがって、著者は、ヒストン修飾ChIP-seqを使用することで、発現に基づく他の方法と比較して、遺伝子制御ネットワークのより信頼性の高い推論が得られると提案しました。

ChIP-seqはChIP-chipの代替手段となる。STAT1の実験的ChIP-seqデータは、同じタイプの実験で得られたChIP-chipの結果と高い類似性を示し、64%以上のピークが共通のゲノム領域に存在する。データはシーケンスリードであるため、リードマッピングに使用できる高品質のゲノム配列があり、ゲノムにマッピングプロセスを混乱させる反復配列がない限り、ChIP-seqは迅速な解析パイプラインを提供する。また、ChIP-seqは結合部位配列の変異を検出する可能性があり、これはタンパク質結合や遺伝子制御における観察された変化を直接的に裏付ける可能性がある。

多くのハイスループットシーケンス手法と同様に、ChIP-seq は非常に大きなデータセットを生成するため、適切な計算解析手法が必要です。ChIP-seq のリードカウントデータから DNA 結合部位を予測するために、ピークコール手法が開発されています。最も一般的な手法の 1 つはMACS であり、ChIP-Seq タグのシフトサイズを経験的にモデル化し、それを使用して予測される結合部位の空間分解能を向上させます。^{[ 22 ]} MACS は高解像度のピークに最適化されていますが、もう 1 つの一般的なアルゴリズムである SICER は、より広いクロマチン領域を探索するために、キロベースからメガベースにわたるより広いピークを呼び出すようにプログラムされています。SICER は、遺伝子本体にまたがるヒストンマークに特に有効です。より数学的に厳密な手法である BCP (Bayesian Change Point) は、より高速な計算速度で、シャープなピークと広いピークの両方に使用できます。^{[ 23 ]} Thomasら(2017)による ChIP-seq ピークコールツールのベンチマーク比較を参照してください。 ^{[ 24 ]}

もう一つの関連する計算上の問題は、異なる生物学的条件からの 2 つの ChIP-seq シグナルの有意差を特定する差分ピーク検出です。差分ピーク検出ツールは、2 つの ChIP-seq シグナルをセグメント化し、隠れマルコフモデルを使用して差分ピークを特定します。2 段階差分ピーク検出ツールの例としては、ChIPDiff ^{[ 25 ]}と ODIN ^{[ 26 ]があります。}

ChIP-seq からの偽陽性部位を減らすために、複数の実験コントロールを使用して IP 実験から結合部位を検出できます。Bay2Ctrls は、IP の DNA 入力コントロール、モック IP、およびそれに対応する DNA 入力コントロールを統合するベイズ モデルを採用し、IP からの結合部位を予測します。^{[ 27 ]}このアプローチは、モデル生物全体などの複雑なサンプルに特に効果的です。さらに、分析によると、複雑なサンプルでは、​​サンプルの活性ゲノムのためか、モック IP コントロールが DNA 入力コントロールを大幅に上回っています。^{[ 27 ]}

• ChIPオンチップ
• ChIP-PCR
• ChIP-PET
• 哺乳類プロモーターデータベース

• ReMapカタログ：2800以上のChIP-seqデータセットからの調節エレメントの統合的かつ統一的なChIP-Seq解析により、485の転写調節因子からの8000万のピークのカタログが得られました。^{[ 1 ]}
• ChIPBaseデータベース： ChIP-Seqデータから転写因子結合マップを探索するためのデータベースです。様々な細胞／組織の種類や条件に対応した、最も包括的なChIP-Seqデータセットを提供します。
• GeneProfデータベースおよび解析ツール：GeneProfは、ChIP-seqおよびRNA-seqデータのための無料でアクセス可能な使いやすい解析環境であり、転写因子結合やヒストン修飾など、すぐに解析できる公開実験の大規模なデータベースが付属しています。
• 差分ピーク検出 ( 2021年5月15日、 Wayback Machineにアーカイブ) : ODINを使用した差分ピーク検出のチュートリアル。
• ChIP-seqデータのバイオインフォマティクス解析：ChIP-seqデータの包括的な解析。^{[ 2 ]}
• KLTepigenome：カルーネン・レーヴェ変換を用いてエピゲノムデータセットにおける相関変動を明らかにする。
• SignalSpider ：複数の正規化されたChIP-Seqシグナルプロファイルにおける確率的パターン発見のためのツール
• FullSignalRanker ：複数の正規化されたChIP-Seqシグナルプロファイルに対する回帰分析とピーク予測のためのツール