パイロシークエンシング

パイロシークエンシングは、 DNAポリメラーゼによって取り込まれたヌクレオチドを検出することによって配列を決定する、「合成による配列決定」の原理に基づいた、非電気泳動型のDNA配列決定法（DNA中のヌクレオチドの順序を決定する方法）です。パイロシークエンシングは、ピロリン酸が放出される際の連鎖反応に基づく光検出に依存しているため、この名前が付けられました。

パイロシークエンシングの原理は、1993年にP. Nyrén、B. Pettersson、およびM. Uhlenによって初めて記述されました。^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]}この技術は、固相シークエンシング、ストレプトアビジンコート磁気ビーズの使用、3´から5´エキソヌクレアーゼ活性（校正）を欠く組換えDNAポリメラーゼ、およびホタルルシフェラーゼ酵素を使用した無機ピロリン酸の発光検出を組み合わせたものです。^{[ 4 ] [ 5 ]}

具体的には、DNAポリメラーゼ、ATPスルホリラーゼ、ホタルルシフェラーゼの3種類の酵素とデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）の溶液を、配列決定対象の一本鎖DNAに添加し、無機ピロリン酸の生成に伴って放出される光を測定することで、ヌクレオチドの取り込みを追跡する。光の強度によって、取り込まれたヌクレオチドの数が0個、1個、またはそれ以上であるかが判定され、鋳型鎖上に存在する相補的なヌクレオチドの数が示される。次のヌクレオチド混合物を加える前に、前のヌクレオチド混合物を取り除き、一本鎖鋳型のDNA配列が決定されるまで、4種類のヌクレオチドそれぞれについてこのプロセスが繰り返される。

ピロシークエンシングの溶液ベースの2番目の方法は、1998年にMostafa Ronaghi、[Mathias Uhlen]、^{[ 6 ]} 、およびPål Nyrenによって記述されました。この代替方法では、DNAポリメラーゼによって取り込まれなかったヌクレオチドを除去するために、追加の酵素であるアピラーゼが導入されます。これにより、DNAポリメラーゼ、ルシフェラーゼ、およびアピラーゼの酵素混合物をシークエンシングの開始時に添加し、手順全体を通して反応溶液中に保持することができます（したがって、自動化が容易になります）。この原理に基づく自動化装置は、翌年、Pyrosequencing社によって市場に導入されました。

3番目のバリアントであるマイクロ流体パイロシークエンシング法は、2005年に454 Life Sciences社のJonathan Rothberg氏率いる産業研究チームによって発表されました。^{[ 7 ] [ 3 ]}このパイロシークエンシングの代替アプローチは、シーケンスするDNAを固体支持体に固定するという元の原理に基づいています。Rothberg氏らは、マイクロファブリケーションとマイクロアレイを使用して、シーケンスを高度に並列的に実行できることを実証しました。これにより、ハイスループットDNAシーケンスが可能になり、自動化された装置が市場に導入されました。この最初の次世代シークエンシング装置は、ゲノム研究の新時代を切り開き、DNAシーケンスの価格が急速に低下し、手頃な価格で全ゲノムシーケンスが可能になりました。

「合成による配列決定」では、配列決定するDNAの一本鎖を取り出し、その相補鎖を酵素的に合成します。パイロシークエンシング法は、DNAポリメラーゼ（DNA合成酵素）の活性を別の化学発光酵素で検出することに基づいています。基本的に、この方法は、 DNAの一本鎖に沿って相補鎖を一度に1塩基対ずつ合成し、各ステップで実際にどの塩基が追加されたかを検出することによって、DNAの一本鎖の配列決定を可能にします。テンプレートDNAは不動であり、A、C、G、Tヌクレオチドの溶液が反応に順次添加され、除去されます。光は、ヌクレオチド溶液がテンプレートの最初の不対塩基と相補的である場合にのみ発生します。化学発光シグナルを生成する溶液のシーケンスにより、テンプレートの配列を決定できます。^{[ 8 ] [ 1 ] [ 3 ]}

溶液ベースのパイロシークエンシングでは、一本鎖DNA（ssDNA）テンプレートをシークエンシングプライマーとハイブリダイズさせ、 DNAポリメラーゼ、ATPスルホリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼの酵素、および基質であるアデノシン5'ホスホ硫酸（APS）とルシフェリンとともにインキュベートします。^{[ 8 ]}

1. 4種類のデオキシヌクレオチド三リン酸のうちの1つを加えることで、2番目のステップが開始されます。dNTPs ) —ノイズを避けるために、dATPの代わりにルシフェラーゼの基質ではないdATPαSが加えられます。DNAポリメラーゼは、正しい相補的なdNTPsを鋳型に組み込みます。この組み込みにより、ピロリン酸（PPi）が放出されます。^{[ 8 ]}

1. ATPスルホリラーゼは、アデノシン5'ホスホ硫酸の存在下でPPiをATPに変換する。このATPは、ルシフェラーゼを介したルシフェリンからオキシルシフェリンへの変換の基質として働き、その量に比例した量の可視光を生成する。ルシフェラーゼ触媒反応で生成された光はカメラで検出され、プログラムで分析される。^{[ 8 ]}

1. 未結合のヌクレオチドとATPはアピラーゼによって分解され、反応は別のヌクレオチドで再開することができる。^{[ 8 ]}

このプロセスは、以下の式で表すことができます。

• PPi + APS → ATP + 硫酸塩（ATPスルホリラーゼによって触媒される）
• ATP + ルシフェリン + O2 → AMP + PPi + オキシルシフェリン + CO2 + _hv (ルシフェラーゼによって触媒される)

ここで、PPiはピロリン酸、APSはアデノシン5-リン酸硫酸、ATPはアデノシン三リン酸、O2は二酸素、AMPはアデノシン一リン酸、CO2_は二酸化炭素、hvは光である。^{[ 8 ]}

現在、この方法の限界は、DNA配列の個々のリード長が300～500ヌクレオチド程度であり、鎖終結法（例えばサンガーシーケンス法）で得られる800～1000ヌクレオチドよりも短いことである。このため、特に反復DNAを多く含む配列の場合、ゲノムアセンブリ のプロセスがより困難になる可能性がある。また、校正機能がないため、この方法の精度が制限される。

スウェーデンのウプサラに拠点を置く Pyrosequencing AB 社は、 HealthCap 社から提供されたベンチャーキャピタルによって設立され、ピロシークエンシング技術を使用して短い DNA 断片をシーケンスするための装置と試薬を商品化することを目的としていました。^{[ 9 ]} Pyrosequencing AB 社は1999 年にストックホルム証券取引所に上場しました。^{[ 9 ]} 2003 年に Pyrosequencing AB 社が米国に拠点を置く Biotage LLC 社およびその他の企業を買収した際、社名は Biotage AB に変更されました。^{[ 9 ]} Biotage AB 社のピロシークエンシングおよびその他のバイオメディカル部門は、 2008 年にQiagen 社に売却されました。 ^{[ 9 ]} ピロシークエンシング技術は454 Life Sciences社にライセンス供与されました。454社は、ゲノムシーケンスやメタゲノミクスを含む大規模 DNA シーケンスのプラットフォームとして登場したアレイベースのピロシークエンシング技術を開発しました。

ロシュは454ライフサイエンスを買収し、2013年に454シーケンシングプラットフォームの販売中止を発表した。^{[ 10 ]} 454シーケンシングプラットフォームは、イルミナの色素シーケンシングとアプライドバイオシステムズのシーケンシング製品によって部分的に置き換えられた。

• コネチカット州ハリントン。リン、EI; MT オルソンと JR エシュルマン (2013 年 9 月 1 日) 「パイロシーケンスの基礎」。アーチ。パソル。研究室メッド。137 (9): 1296–1303。土井: 10.5858/arpa.2012-0463-RA。PMID 23991743 。2025 年10 月 29 日に取得。 {{cite journal}}: CS1 maint: 複数名: 著者リスト (リンク)対応する PDF ドキュメントについては、こちらのリンクを参照してください。

• Metzker M. (2005). "DNAシーケンスにおける新興技術" . Genome Research . 15 (12): 1767–76 . doi : 10.1101/gr.3770505 . PMID 16339375 .