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エクソームシーケンス（全エクソームシーケンス（WES）とも呼ばれる）は、ゲノム内の遺伝子のタンパク質コード領域（エクソームと呼ばれる）すべてをシーケンスするゲノム技術です。 [ 1 ]これは2つのステップから構成されます。最初のステップは、タンパク質をコードするDNAのサブセットのみを選択することです。これらの領域はエクソンとして知られており、ヒトには約18万個のエクソンがあり、これはヒトゲノムの約1％、つまり約3000万塩基対に相当します。2番目のステップは、任意のハイスループットDNAシーケンス技術を使用してエクソンDNAをシーケンスすることです。[ 2 ]
このアプローチの目的は、タンパク質配列を変化させる遺伝子変異を特定することであり、全ゲノムシーケンスよりもはるかに低コストでこれを実現することである。これらの変異は、メンデル遺伝性疾患とアルツハイマー病などの一般的な多遺伝子疾患の両方の原因となる可能性があるため、全エクソームシーケンスは学術研究と臨床診断の両方に応用されている。
エクソームシーケンスは、個人のすべての遺伝子の遺伝子変異を効率的に特定できるため、希少なメンデル遺伝性疾患の研究に特に有効です。これらの疾患は、ごく少数の個人にしか存在しない非常にまれな遺伝子変異によって引き起こされることがほとんどです。 [ 3 ]対照的に、SNPアレイなどの技術では、より広い集団の多くの個人に共通する共有遺伝子変異しか検出できません。[ 4 ]さらに、重篤な疾患を引き起こす変異は、タンパク質コード配列に存在する可能性がはるかに高い（ただし、決して排他的ではない）ため、[ 5 ] [ 6 ]この1%に焦点を当てることは、全ゲノムシーケンスよりもはるかにコストが低く、関連する変異を高い収率で検出できます。
従来、臨床遺伝子検査は患者の臨床症状に基づいて選択され（つまり、特定の症候群に関連することが知られている1つの遺伝子または少数の遺伝子に焦点を当てる）、あるいは特定の種類の変異のみを調査し（例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション）、全患者の半数未満で確定的な遺伝子診断を提供していました。[ 7 ]現在、エクソームシーケンスは、これらの他の検査を補完するためにますます使用されています。すでに疾患の原因として知られている遺伝子の変異を見つけるためだけでなく、類似した特徴を持つ患者のエクソームを比較することによって新しい遺伝子を特定するためにも使用されています。
ターゲット濃縮法は、シーケンスの前にDNAサンプルから目的のゲノム領域を選択的に捕捉することを可能にする。2005年に直接ゲノム選択（DGS）法が最初に記述されて以来、いくつかのターゲット濃縮戦略が開発されてきた。[ 8 ]
標的捕捉のための多くの技術が報告されているが、そのうち全エクソームを捕捉できるようになったのはごくわずかである。[ 9 ]全エクソームシーケンスに適用された最初の標的濃縮戦略は、2007年のアレイベースのハイブリッド捕捉法であったが、近年では溶液内捕捉が普及している。
マイクロアレイには、ヒトゲノムの配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドが表面に固定され、目的の領域をタイル状に並べています。ゲノムDNAは切断されて二本鎖断片になります。断片は末端修復を受けて平滑末端になり、ユニバーサルプライミング配列を持つアダプターが付加されます。これらの断片はマイクロアレイ上のオリゴにハイブリダイズされます。ハイブリダイズしていない断片は洗い流され、目的の断片が溶出されます。その後、断片はPCRを使用して増幅されます。[ 10 ] [ 11 ]
Roche NimbleGenは、オリジナルのDGS技術[ 8 ]を次世代シーケンシングに応用した最初の企業です。同社は、約18万個のコーディングエクソンを捕捉するSequence Capture Human Exome 2.1M Arrayを開発しました。[ 12 ]この方法は、PCRベースの方法と比較して、時間とコストの両方を節約できます。Agilent Capture Arrayや比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイは、ターゲット配列のハイブリッドキャプチャに使用できる他の方法です。この技術の制限としては、高価なハードウェアと比較的多くのDNAが必要であることが挙げられます。[ 13 ]
溶液中捕捉法を用いて目的のゲノム領域を捕捉するには、カスタムオリゴヌクレオチド（プローブ）のプールを合成し、断片化されたゲノムDNAサンプルと溶液中でハイブリダイズさせる。プローブ（ビーズで標識されている）は目的のゲノム領域に選択的にハイブリダイズし、その後、ビーズ（目的のDNA断片を含む）を沈降させて余分な物質を洗浄除去する。次にビーズを除去し、ゲノム断片をシーケンスすることで、目的のゲノム領域（例えばエクソン）を選択的にDNAシーケンスすることができる。
この方法は、ハイブリダイゼーションキャプチャターゲット濃縮法を改良するために開発されました。溶液キャプチャ（ハイブリッドキャプチャとは対照的に）では、必要なテンプレート量よりも多くのプローブが対象領域に供給されます。[ 13 ]最適なターゲットサイズは約3.5メガベースで、対象領域の優れた配列カバレッジが得られます。推奨される方法は、対象領域の塩基対数、ターゲットのリード数、社内の機器など、いくつかの要因に依存します。[ 14 ]
次世代シーケンシング（NGS）プラットフォームは数多く存在し、従来のサンガーシーケンシング法に続いて登場しました。その他のプラットフォームとしては、Roche 454シーケンサー、Life Technologies SOLiDシステム、Life Technologies Ion Torrent、IlluminaのIllumina Genome Analyzer II（現在は販売終了）およびその後のIllumina MiSeq、HiSeq、NovaSeqシリーズ機器などがあり、これらはすべて大規模並列エクソームシーケンシングに使用できます。これらの「ショートリード」NGSシステムは、ヒトのエクソンに見られるような、比較的短いDNA配列の解析に特に適しています。
遺伝子変異を特定するための技術は複数存在する。それぞれの技術には、技術的および経済的な面で長所と短所がある。そのような技術の2つとして、マイクロアレイと全ゲノムシーケンスが挙げられる。
マイクロアレイはハイブリダイゼーションプローブを使用して既知のDNA配列の出現頻度を検査するため、予期せぬ遺伝子変化を特定するために使用することはできません。[ 13 ]対照的に、エクソームシーケンスで使用されるハイスループットシーケンス技術は、検査された数千のエクソン遺伝子座のDNAのヌクレオチド配列を直接提供します。[ 15 ]したがって、WESはハイブリダイゼーションジェノタイピングアレイの現在のいくつかの制限に対処します。
エクソームシーケンスはサンプルあたりのコストはハイブリダイゼーションベースの技術よりも高いものの、全ゲノムシーケンスのコスト低下とスループット向上により、そのコストは低下傾向にある。
エクソームシーケンスでは、タンパク質機能に影響を与える遺伝子のコード領域に見られる変異のみを特定できます。疾患に関連する構造変異や非コード変異を特定することはできません。これらは、全ゲノムシーケンスなどの他の方法で見つけることができます。[ 2 ]エクソームシーケンスではカバーされていないヒトゲノムの99%が残っており、エクソームシーケンスでは、全ゲノムシーケンスと比較して少なくとも20倍のサンプルでゲノムの一部をシーケンスできます。[ 2 ]特定された希少変異を臨床に応用するには、サンプルサイズと結果を解釈して臨床診断を提供する能力が重要であり、遺伝学の現在の知識では、エクソームシーケンスが診断の補助に使用されているという報告があります。[ 12 ]エクソームシーケンスのコストは通常、全ゲノムシーケンスよりも低くなっています。[ 16 ]
シーケンス解析手法から生成される大量のデータの統計解析は困難です。個人のエクソームをシーケンスするだけでも、大量のデータと配列情報が生成され、相当量のデータ解析が必要となります。このデータの解析に関連する課題には、配列リードのアライメントとアセンブリに使用されるプログラムの変更が含まれます。[ 13 ]また、さまざまなシーケンス技術はエラー率やリード長が異なるため、異なるシーケンスプラットフォームの結果を比較する際に課題が生じる可能性があります。
ゲノム再シーケンス法では、偽陽性および偽陰性の所見が問題となる。エクソームデータの質を向上させるために、以下のようないくつかの戦略が開発されている。
まれな劣性疾患には、 dbSNPなどの公開データベースに一塩基多型(SNP)が存在しない場合があります。より一般的な劣性表現型には、dbSNP に報告されている疾患原因変異が存在する可能性が高くなります。たとえば、最も一般的な嚢胞性線維症変異は、ほとんどの集団で約 3% のアレル頻度を持っています。このような変異をスクリーニングすると、このような遺伝子が誤って考慮から除外される可能性があります。劣性疾患の遺伝子は、まれな非同義変異が 1 つ以上存在する可能性が低いため、通常、優性疾患よりも特定が容易です。[ 2 ]一般的な遺伝子変異をスクリーニングするシステムは、アレルの変異に関する正確な情報を持っていない可能性があるdbSNPに依存しています。研究対象のエクソームまたはゲノムワイドシーケンスされた個人の一般的な変異のリストを使用する方が信頼性が高くなります。このアプローチの課題は、シーケンスされたエクソームの数が増えるにつれて、dbSNP のまれな変異の数も増加することです。疾患表現型と関連しない可能性が高い一般的な変異を定義するための閾値を開発する必要があるだろう。[ 15 ]
遺伝的多様性と集団の民族性も大きな制約要因であり、偽陽性および偽陰性の結果が増加し、候補遺伝子の特定がより困難になる可能性がある。もちろん、多様性と民族性が存在する場合には閾値の厳格さを緩和することは可能であるが、その場合、変異を検出する力も低下する。候補遺伝子を特定するために遺伝子型優先のアプローチを用いることも、これらの制約を克服する解決策となる可能性がある。
一般的なバリアント解析とは異なり、全エクソームシーケンス研究における希少バリアントの解析では、単一のバリアントではなくバリアントセットを評価します。[ 17 ] [ 18 ]機能アノテーションは、希少バリアントの効果または機能を予測し、希少な機能バリアントの優先順位付けに役立ちます。これらのアノテーションを組み込むことで、全ゲノムシーケンス研究の希少バリアントの遺伝子関連解析のパワーを効果的に高めることができます。[ 19 ]機能アノテーションを組み込むことで、機能情報に基づいた希少バリアント関連解析を実行するための方法とツールがいくつか開発されており、全エクソームシーケンス研究の解析を強化しています。[ 20 ] [ 21 ]
ゲノム科学における新しい技術は、研究者が基礎研究と応用研究の両方に取り組む方法を変えました。エクソームシーケンスなどのアプローチにより、個々のゲノムから生成されるデータを大幅に強化することが可能になり、膨大な量の情報をどのように扱うかについて一連の疑問が生じています。これらの研究の被験者は、自分のシーケンス情報にアクセスできるようにすべきでしょうか？この情報は保険会社と共有すべきでしょうか？このデータは予期せぬ発見につながり、臨床的有用性や患者の利益を複雑にする可能性があります。ゲノム科学のこの分野は依然として課題であり、研究者はこれらの疑問にどのように対処するかを検討しています。[ 15 ]
エクソームシーケンスを用いることで、固定費用で実施可能な研究において、全ゲノムシーケンスよりもはるかに高い深度でサンプルをシーケンスすることが可能になります。この深度の向上により、エクソームシーケンスは、信頼性の高いバリアントコールを必要とする様々な用途に適しています。
現在の関連研究は、ゲノム全体にわたる一般的な変異に焦点を当てています。これは、現在の検査法で最も簡単に特定できるためです。しかし、候補遺伝子研究では、大きな影響を与える疾患原因変異がエクソーム内に存在することがわかっています。負の選択のため、アレル頻度ははるかに低く、現在の標準的な遺伝子型判定法では型判定されない可能性があります。全ゲノムシーケンスは、ゲノム全体にわたる新規変異を検査する可能性のある方法です。しかし、複雑な疾患（自閉症など）では、多数の遺伝子が疾患リスクに関連していると考えられています。[ 1 ] [ 22 ]この根本的なリスクの異質性は、遺伝子発見には非常に大きなサンプルサイズが必要であることを意味し、したがって全ゲノムシーケンスは特に費用対効果が高いとは言えません。このサンプルサイズの問題は、遺伝子変異が変異レベルでまれであっても、疾患遺伝子を効果的にマッピングする新しい高度な分析方法の開発によって緩和されます。[ 22 ]さらに、コーディング領域の変異はより広範に研究されており、その機能的意味合いを導き出すのがはるかに容易であるため、標的エクソーム領域内の変異の実用的応用がよりすぐに利用可能になります。
希少変異遺伝子発見におけるエクソームシーケンスは、非常に活発で継続的な研究分野であり、遺伝子セット全体にわたって重大なリスク負担が観察されるという証拠が増えています。エクソームシーケンスは、自己免疫疾患である円形脱毛症のKRT82遺伝子の希少変異を報告しています。[ 1 ]
影響の大きいメンデル遺伝性疾患では、これまでの研究結果から、コーディング遺伝子内の1つまたはごく少数の変異が疾患全体の原因となっていることが示唆されている。これらの疾患の重篤性から、原因となる少数の変異は集団内で極めて稀であるか、あるいは新規の変異であると推定され、標準的な遺伝子型判定法では見逃される。エクソームシーケンスは、コーディング領域全体にわたって高カバレッジの変異検出を提供し、真の変異をノイズから分離するために必要な情報を提供する。メンデル遺伝性疾患の発見に成功したモデルの一つは、両親と被験者の遺伝子型を判定するトリオシーケンスを用いて新規変異を発見することである。
2009年9月に発表された研究では、エクソームシーケンスを使用して原因遺伝子変異を特定できるかどうかを判断するための概念実証実験について議論した。彼らは、 MYH3遺伝子の変異によって引き起こされることが知られているまれな常染色体優性疾患であるフリーマン・シェルドン症候群（FSS）（OMIM 193700）の4人の個人のシーケンスを行った。[ 2 ]また、FSSの原因遺伝子を特定するために一般的な変異を除去するために、 8人のHapMap個人のシーケンスも行われた。一般的な変異を除外した後、著者らはMYH3を特定することができ、エクソームシーケンスがまれな疾患の原因変異を特定するために使用できることを確認した。[ 2 ]これは、まれなメンデル遺伝性疾患の未知の原因遺伝子を特定するアプローチとしてエクソームシーケンスを使用した最初の報告された研究であった。
その後、別のグループがトルコ出身のバルト症候群疑い患者の臨床診断に成功したと報告した。 [ 12 ]バルト症候群は腎性塩類喪失疾患である。エクソームシーケンスにより、先天性塩化物下痢（CLD）に関連するSLC26A3と呼ばれる遺伝子に予期せぬ高度に保存された劣性変異が明らかになった。このCLDの分子診断は、紹介元の臨床医によって確認された。この例は、未診断の遺伝性疾患患者の評価における臨床ツールとしての全エクソームシーケンスの使用の概念実証を提供した。この報告は、患者の分子診断のための次世代シーケンス技術の最初の応用とみなされている。
2番目の報告では、常染色体劣性遺伝のまれな疾患であるミラー症候群（MIM#263750）として知られるメンデル遺伝性疾患の患者のエクソームシーケンスが行われた。ミラー症候群の兄弟2人と血縁関係のない2人が研究された。非同義変異、スプライスアクセプターおよびドナー部位、短いコーディング挿入または欠失など、病原性を持つ可能性のある変異が調べられた。[ 3 ] ミラー症候群はまれな疾患であるため、原因となる変異はこれまで特定されていないことが予想される。公共のSNPデータベースにある一般的な一塩基多型（SNP）の以前のエクソームシーケンス研究を使用して、候補遺伝子をさらに除外した。これらの遺伝子を除外した後、著者らはミラー症候群の患者間で共有されているDHODHの変異を発見した。ミラー症候群の各患者は、 DHODH変異の複合ヘテロ接合体であり、罹患した患者の両親はそれぞれ保因者であることが判明したため、この変異は遺伝した。[ 3 ]
エクソームシーケンスによって、希少なメンデル遺伝性疾患の原因となる新規遺伝子が同定されたのは今回が初めてです。この画期的な発見は、エクソームシーケンスが複雑な疾患の原因遺伝子を特定する可能性を秘めていることを示しています。これは、従来の方法の限界により、これまで不可能だったことです。ターゲットキャプチャと大規模並列シーケンスは、個々のヒトゲノムにおけるタンパク質コードの変化を引き起こす変異を検出するための、費用対効果が高く、再現性があり、堅牢な戦略であり、高い感度と特異性を備えています。
エクソームシーケンスは、患者の疾患の遺伝的原因を診断するために使用できます。根本的な疾患遺伝子変異の特定は、診断および治療アプローチに大きな影響を与え、疾患の自然経過の予測を導き、リスクのある家族メンバーを検査することを可能にします。[ 2 ] [ 3 ] [ 12 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]エクソームシーケンスが単一遺伝子解析よりも優れている理由は数多くあり、非典型的な臨床症状のために検査されなかった遺伝子の変異を特定できること[ 25 ]や、同じ患者で異なる遺伝子の変異が異なる表現型に寄与している臨床例を特定できることなどが含まれます。[ 3 ]
疾患の遺伝的原因が診断された場合、この情報は適切な治療法の選択に役立つ可能性がある。この戦略が臨床で初めて成功したのは、炎症性腸疾患の乳児の治療であった。[ 24 ] [ 26 ]以前は多くの従来の診断法が用いられていたが、その結果では乳児の症状を説明できなかった。エクソームシーケンスデータの解析により、XIAP遺伝子の変異が特定された。この遺伝子の機能に関する知識が乳児の治療を導き、骨髄移植によって乳児は病気から回復した。[ 24 ]
研究者らはエクソームシーケンスを使用して、バルト症候群および先天性塩化物下痢症の患者の根本的な変異を特定した。[ 12 ]ビルギュラーらのグループもエクソームシーケンスを使用して、重度の脳奇形のある患者の根本的な変異を特定し、「これらの発見は、従来の方法では困難であることが証明されている状況で、疾患遺伝子座を特定するための全エクソームシーケンスの使用を強調しています...私たちの結果は、この技術が、遺伝子座の異質性や診断分類の境界に関する不確実性によってマッピングが混乱している状況での遺伝子発見に特に価値があることを示しており、医学への幅広い応用の明るい未来を示唆しています」と述べている。[ 23 ]
南アフリカのケープタウン大学の研究者らは、エクソームシーケンスを用いて、不整脈原性右室心筋症（ARVC）として知られる遺伝性疾患の根本原因としてCDH2遺伝子の変異を発見した。この疾患は、心臓病や心停止のリスクを高める。
複数の企業が消費者にエクソームシーケンスを提供してきた。Knomeは、数千ドルの費用で消費者にエクソームシーケンスサービスを提供した最初の企業だった。 [ 27 ]その後、23andMeは2011年9月に発表されたWESパイロットプログラムを実施し、2012年に中止した。消費者は999ドルでエクソームデータを入手できた。同社は生データを提供し、分析は提供しなかった。[ 27 ] [ 28 ] [ 29 ]
2012 年 11 月、 Gene by Geneの一部門である DNADTC は、80 倍のカバー率でエクソームを 695 ドルの導入価格で提供し始めました。[ 30 ] DNADTC の Web サイトによると、この価格は現在 895 ドルです。2013 年 10 月、BGI は、50 倍のカバー率で個人向けの全エクソームシーケンスを 499 ドルで提供するプロモーションを発表しました。[ 31 ] 2016 年 6 月、Genos は、唾液からシーケンスされた CLIA 認定の 75 倍の消費者向けエクソームで、さらに低い価格の 399 ドルを実現することができました。[ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]
2018年に36件の研究をレビューしたところ、エクソームシーケンスの費用は555 米ドルから5,169 米ドルまでで、診断率は患者グループによって3%から79%までと幅があることがわかった。[ 16 ]