組み換えDNA

組み換え DNA ( rDNA ) 分子は、複数のソースからの遺伝物質を組み合わせてゲノム内に存在しない配列を作成する、遺伝子組み換えの実験室的方法(分子クローニングなど) によって形成されたDNA分子です。

組み換え DNA は、異なるソースからの 2 つ以上の断片を組み合わせて作成された DNA 片の一般的な名称です。組み換え DNA が可能なのは、すべての生物の DNA 分子が同じ化学構造を共有し、ヌクレオチド配列のみが異なるためです。組み換え DNA 分子は、神話上のキメラのように 2 つの異なる種の材料から作成できるため、キメラ DNAと呼ばれることもあります。rDNA 技術では回文配列を使用し、粘着末端と平滑末端が生成されます。

組み換え DNA 分子の構築に使用される DNA 配列は、任意の種に由来する可能性があります。たとえば、植物 DNA を細菌 DNA に結合したり、ヒト DNA を真菌 DNA に結合したりできます。さらに、自然界には存在しない DNA 配列をDNA の化学合成によって作成し、組み換え DNA 分子に組み込むこともできます。組み換え DNA 技術と合成 DNA を使用すると、任意の DNA 配列を作成して生物に導入できます。

生きた細胞内での組み換えDNAの発現から生じるタンパク質は、組み換えタンパク質と呼ばれます。タンパク質をコードする組み換えDNAが宿主生物に導入されても、必ずしも組み換えタンパク質が生成されるわけではありません。^[1]外来タンパク質の発現には特殊な発現ベクターの使用が必要であり、多くの場合、外来コード配列による大幅な再構築が必要になります。^[2]

組み換え DNA は、前者が人工的な方法によって生じるのに対し、後者は基本的にすべての生物に存在する DNA 配列の再混合をもたらす通常の生物学的プロセスであるという点で、遺伝子組み換えとは異なります。

分子クローニングは、組み換えDNAを生成するために使用される実験室プロセスです。^{[3] [4] [5] [6]これは、}ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とともに、実験者が選択した特定のDNA配列の複製を指示するために使用される2つの最も広く使用されている方法の1つです。これらの方法には2つの基本的な違いがあります。1つは、分子クローニングでは生きた細胞内でDNAを複製するのに対し、PCRは生きた細胞のない試験管内でDNAを複製することです。もう1つの違いは、クローニングではDNA配列を切り取って貼り付けるのに対し、PCRは既存の配列をコピーして増幅することです。

組み換え DNA の形成には、生きた細胞内で複製される DNA 分子であるクローニング ベクターが必要です。ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスから派生したもので、複製に必要な遺伝的シグナルを含む比較的小さな DNA セグメントと、外来 DNA の挿入、組み換え DNA を含む細胞の識別、および適切な場合には外来 DNA の発現に便利な追加要素が含まれています。分子クローニング用のベクターの選択は、宿主生物の選択、クローニングする DNA のサイズ、および外来 DNA の発現の有無と発現方法によって異なります。^{[7] DNA セグメントは、制限酵素/リガーゼ クローニングや}ギブソン アセンブリなどのさまざまな方法を使用して組み合わせることができます。^[要出典]

標準的なクローニングプロトコルでは、DNA断片のクローニングには基本的に7つのステップが含まれます。(1)宿主生物とクローニングベクターの選択、(2)ベクターDNAの調製、(3)クローニングするDNAの調製、(4)組み換えDNAの作成、(5)宿主生物への組み換えDNAの導入、(6)組み換えDNAを含む生物の選択、(7)目的のDNA挿入と生物学的特性を持つクローンのスクリーニング。^{[6]これらのステップについては、関連記事（} 分子クローニング）で詳しく説明しています。

DNA発現には適切な宿主細胞の導入が必要である。典型的には、細菌、酵母、昆虫、または哺乳類細胞（ヒト胎児腎細胞やCHO細胞など）が宿主細胞として使用される。^[8]

宿主生物への移植後、組み換え DNA 構造内に含まれる外来 DNA は発現する場合と発現しない場合があります。つまり、DNA は発現せずに単に複製される場合もあれば、転写および翻訳されて組み換えタンパク質が生成される場合もあります。一般的に、外来遺伝子の発現には、遺伝子を再構築して、宿主の翻訳装置で使用できるmRNA分子を生成するために必要な配列(プロモーター、翻訳開始シグナル、転写ターミネーターなど) を含める必要があります。^[9]異所性遺伝子の発現を改善するために、宿主生物に特定の変更を加えることができます。さらに、翻訳を最適化し、タンパク質を可溶性にし、組み換えタンパク質を適切な細胞内または細胞外の場所に導き、タンパク質を分解から安定化するために、コード配列の変更も必要になる場合があります。^{[10] [11] [12]}

ほとんどの場合、組み換えDNAを含む生物は明らかに正常な表現型を持っています。つまり、その外観、行動、代謝は通常変化しておらず、組み換え配列の存在を証明する唯一の方法は、通常はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）テストを使用してDNA自体を調べることです。^[13]重要な例外が存在し、以下で説明します。

rDNA配列が発現する遺伝子をコードしている場合、組換え遺伝子のRNAおよび/またはタンパク質産物の存在は、通常RT-PCRまたはウェスタンハイブリダイゼーション法を使用して検出できます。^[13]組換え遺伝子が宿主生物で生物学的活性を生成するように選択および変更されていない限り、全体的な表現型の変化は標準ではありません。^[14]遭遇する追加の表現型には、組換え遺伝子産物によって誘発される宿主生物への毒性があり、特に過剰発現または不適切な細胞または組織内で発現した場合に顕著です。^{[引用が必要]}

場合によっては、組み換え DNA は発現していなくても有害な影響を及ぼすことがあります。これが起こるメカニズムの 1 つは挿入不活性化で、rDNA が宿主細胞の遺伝子に挿入されます。場合によっては、研究者はこの現象を利用して遺伝子を「ノックアウト」し、その生物学的機能と重要性を判断します。^[15]染色体 DNA への rDNA の挿入が遺伝子発現に影響を与えるもう 1 つのメカニズムは、以前は発現していなかった宿主細胞遺伝子の不適切な活性化です。これは、たとえば、活性プロモーターを含む組み換え DNA フラグメントが以前はサイレントだった宿主細胞遺伝子の隣に位置したとき、または遺伝子発現を抑制する機能を持つ宿主細胞遺伝子が組み換え DNA によって挿入不活性化されたときに発生します。^[要出典]

組み換え DNA は、バイオテクノロジー、医療、研究の分野で広く使用されています。今日、DNA 技術の使用によって生じた組み換えタンパク質やその他の製品は、西洋の薬局、医師や獣医の診療所、医療検査室、生物学研究室のほぼすべてで見ることができます。さらに、組み換え DNA 技術を使用して操作された生物、およびそれらの生物から生成された製品は、多くの農場、スーパーマーケット、家庭の薬箱、さらにはGloFishやその他の遺伝子組み換え動物を販売するペットショップにまで流通しています。

組み換えDNAの最も一般的な用途は基礎研究であり、この技術は生物学および生物医学の現在のほとんどの研究にとって重要です。^[13]組み換えDNAは、遺伝子の識別、マッピング、配列決定、および機能の決定に使用されます。rDNAプローブは、個々の細胞内および生物全体の組織全体での遺伝子発現の分析に使用されます。組み換えタンパク質は、実験室実験の試薬として、また細胞および生物内のタンパク質合成を調べるための抗体プローブの生成に広く使用されています。^[4]

組み換えDNAのその他の実用的応用は、産業、食品生産、人間および獣医学、農業、バイオエンジニアリングの分野で数多く見受けられます。^[4]以下にいくつかの具体的な例を示します。

レンネットに含まれるキモシンは、κ-カゼインを加水分解してパラ-κ-カゼインとグリコマクロペプチドを生成する酵素で、チーズ、それに続くカード、ホエーの形成の第一歩となる。^{[16]これは、商業的に}使用された最初の遺伝子組み換え食品添加物であった。伝統的に、加工業者は、乳を飲んだ子牛の第4胃から抽出した製剤であるレンネットからキモシンを得ていた。科学者は、酵素の大規模な実験室生産のために、大腸菌の非病原性株（K-12）を組み換えた。この微生物学的に生産された組み換え酵素は、子牛由来の酵素と構造的に同一であり、コストが低く、大量に生産される。今日、米国のハードチーズの約60％は、遺伝子組み換えキモシンで作られている。1990年、FDAは、酵素が安全であることを示すデータに基づいて、キモシンに「一般的に安全と認められる」（GRAS）ステータスを付与した。^[17]

組換えヒトインスリンは、1型糖尿病の治療において、動物由来のインスリン（豚や牛など）をほぼ完全に置き換えました。さまざまな組換えインスリン製剤が広く使用されています。^[18]組換えインスリンは、ヒトインスリン遺伝子を大腸菌または酵母（サッカロミセス・セレビシエ）に挿入することによって合成され^[19]、ヒトが使用するインスリンを生成します。^[20]大腸菌によって生成されたインスリンは、さらに翻訳後修飾（グリコシル化など）を必要とするのに対し、酵母はより複雑な宿主生物であるため、これらの修飾を自ら行うことができます。組換えヒトインスリンの利点は、慢性的に使用した後、動物由来のインスリンがヒトの免疫系を刺激するのとは異なり、患者がそれに対する免疫防御を発達させないことです。^[21]

下垂体から正常な成長と発達に必要な量のHGHが生成できない患者に投与される。組み換えHGHが利用可能になる前は、治療用のHGHは死体の下垂体から採取されていた。この危険な慣行により、一部の患者がクロイツフェルト・ヤコブ病を発症した。組み換えHGHはこの問題を解決し、現在では治療に使用されている。^[22]また、アスリートなどによってパフォーマンス向上薬として誤用されてきた。^{[23] [24]}

これは、正常な血液凝固を維持するのに十分な量の第VIII因子を産生することができない出血性疾患である血友病患者に投与される血液凝固タンパク質である第VIII因子の組み換え型である。 ^[25]組み換え第VIII因子が開発される前は、タンパク質は複数のドナーからの大量のヒト血液を処理することによって得られていたが、これにはHIVやB型肝炎などの血液媒介感染症の伝染リスクが非常に高かった。

B型肝炎感染は、酵母細胞で産生されるB型肝炎ウイルス表面抗原の一種を含む組換えサブユニット B型肝炎ワクチンの使用により効果的に制御できます。ポリオウイルスなどの他の一般的なウイルスとは異なり、B型肝炎ウイルスは試験管内で増殖できないため、組換えサブユニットワクチンの開発は重要かつ必要な開発でした。^[26]

組み換え抗体（rAbs）は、哺乳類細胞に基づく発現システムによって試験管内で生産されます。特定のエピトープへの単一特異的結合により、rAbsは研究目的だけでなく、特定の癌種、感染症、自己免疫疾患に対する治療選択肢としても適しています。^[27]

HIV 感染の診断に広く使用されている 3 つの方法は、いずれも組み換え DNA を使用して開発されています。抗体検査 ( ELISAまたはウェスタン ブロット) では、組み換え HIV タンパク質を使用して、 HIV 感染に反応して体内で生成された抗体の存在を検査します。DNA 検査では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR) を使用して HIV 遺伝物質の存在を探します。RT-PCR 検査の開発は、HIV ゲノムの分子クローニングと配列分析によって可能になりました。米国疾病予防管理センター (CDC) の HIV 検査ページ

ゴールデンライスは、 β-カロチンの生合成を担う酵素を発現するように設計された組み換え米の品種です。^[14]この品種の米は、世界の人口におけるビタミンA欠乏症の発生率を減らす上で大きな期待が寄せられています。 ^[28]ゴールデンライスは現在、規制と知的財産の問題が解決されるまで使用されていません。^[29]

重要な農作物（大豆、トウモロコシ、ソルガム、キャノーラ、アルファルファ、綿花など）の商業品種では、除草剤グリホサート（商品名ラウンドアップ）に対する耐性をもたらす組み換え遺伝子を組み込んだ品種が開発されており、グリホサートの散布による雑草防除が簡素化されている。^[30]これらの作物は、いくつかの国で一般的に商業的に使用されている。

バチルス・チューリンゲンシスは、殺虫作用を持つタンパク質（ Bt毒素）を自然に生成する細菌です。 ^[28]この細菌は長年、害虫駆除戦略として作物に利用されており、農業や園芸で広く採用されています。最近では、細菌タンパク質の組み換え型を発現する植物が開発されており、一部の昆虫捕食者を効果的に駆除できる可能性があります。これらの遺伝子組み換え作物の使用に関連する環境問題は、まだ完全には解決されていません。 ^[31]

組み換え DNA のアイデアは、スタンフォード大学医学部の生化学科のデール・カイザー教授の大学院生であったピーター・ロバンによって初めて提案されました。 ^[32]組み換え DNA の成功した製造と細胞内複製を記述した最初の出版物は、1972 年と 1973 年にスタンフォードとUCSFから発表されました。^{[33] [34] [35] [36]} 1980 年、スタンフォードの生化学科の教授であり、最初の論文の 1 つ^{[33]の著者である}ポール・バーグは、核酸、特に組み換え DNA に関する研究でノーベル化学賞を受賞しました。ヴェルナー・アーバー、ハミルトン・スミス、ダニエル・ネイサンズは、rDNA 技術の技術を向上させた制限エンドヌクレアーゼの発見により、 1978 年のノーベル生理学・医学賞を共同受賞しました。^[要出典]

スタンフォード大学は1974年11月4日に組み換えDNAに関する米国特許を申請し、発明者をハーバート・W・ボイヤー（カリフォルニア大学サンフランシスコ校教授）とスタンレー・N・コーエン（スタンフォード大学教授）と記載した。この特許（US 4,237,224A）は1980年12月2日に付与された。^{[37] [38]組み換えDNA技術を使用して生成された最初の認可医薬品は、}ジェネンテック社が開発し、イーライリリー社がライセンスしたヒトインスリンであった。^[39]

組み換え DNA 法の初期の開発に関わった科学者たちは、組み換え DNA を含む生物が望ましくない、あるいは危険な特性を持つ可能性があることを認識していました。1975 年の組み換え DNA に関するアシロマ会議では、これらの懸念が議論され、特に危険であると見なされた実験については、組み換え DNA 研究の自主的な一時停止措置が開始されました。この一時停止措置は、国立衛生研究所(米国) が rDNA 研究に関する正式なガイドラインを策定し発行するまで、広く遵守されていました。今日では、組み換え DNA 分子と組み換えタンパク質は通常は危険とは見なされていません。しかし、組み換え DNA を発現する一部の生物については、特に実験室を離れて環境や食物連鎖に導入された場合に懸念が残ります。これらの懸念については、遺伝子組み換え生物および遺伝子組み換え食品論争に関する記事で説明されています。さらに、組み換え DNA から特定のタンパク質製品が生成されるバイオ医薬品製造の副産物についても懸念されています。宿主細胞タンパク質と呼ばれる主要な副産物は宿主発現系から発生し、患者の健康と環境全体に脅威を与えます。^{[40] [41]}

• 組み換えDNAに関するアシロマ会議
• 遺伝子工学
• 遺伝子組み換え生物
• 組み換えウイルス
• ベクターDNA
• 生体分子工学
• 組み換えDNA技術
• 宿主細胞タンパク質
• T7発現システム

• 創造の8日目：生物学における革命の創造者。Touchstone Books、ISBN 0-671-22540-5。第2版：Cold Spring Harbor Laboratory Press、1996年ペーパーバック：ISBN 0-87969-478-5。  
• ミクラス、デイビッド。2003年。「DNAサイエンス：入門コース」コールド・スプリング・ハーバー・プレス：ISBN 978-0-87969-636-8。 
• ラスムッセン、ニコラス、「Gene Jockeys: Life Science and the rise of Biotech Enterprise」、ジョンズホプキンス大学出版局、(ボルチモア)、2014年。ISBN 978-1-42141-340-2。 
• ローゼンフェルド、イスラエル。2010年。「DNA：世界を揺るがした分子のグラフィックガイド」コロンビア大学出版局：ISBN 978-0-231-14271-7。 
• マーク・シュルツ、キャノン・ザンダー。2009年、『生命の素：遺伝学とDNAのグラフィックガイド』ヒル＆ワン：ISBN 0-8090-8947-5。 
• ワトソン、ジェームズ。2004年。「DNA：生命の秘密」ランダムハウス：ISBN 978-0-09-945184-6。 

• 組み換え DNA ファクトシート (ニューハンプシャー大学より)
• 酵母のプラスミド（サンディエゴ州立大学のファクトシート）
• 組み換え DNA の構築と組み換え細菌による外来タンパク質の生産を示すアニメーション。2012 年 3 月 28 日にWayback Machineにアーカイブされました。
• UCSF での組み換え DNA 研究と Genentech での商業的応用、1994 年の Herbert W. Boyer とのインタビューの編集されたトランスクリプト、Living history プロジェクト。口述歴史。
• 組み換えタンパク質の精製原理と方法ハンドブック 2008-12-05 にWayback Machineでアーカイブ
• マサチューセッツ工科大学、オーラル ヒストリー プログラム、組み換え DNA 論争に関するオーラル ヒストリー コレクション、MC-0100。マサチューセッツ工科大学、特別コレクション部門、マサチューセッツ州ケンブリッジ